動物實驗技術(shù)

動物實驗技術(shù)第六章動物實驗基本操作技術(shù)

第一節(jié)、實驗動物的抓取與固定一、小鼠的抓取與固定抓取方法：用右手拇指和食指捏住尾部中段提起，如果只想移動小鼠，就用兩手把它捧起來。手固定法：將右手捏起的小鼠放在籠蓋上，用右手捏其尾部中段，在小鼠向前爬的一瞬間，用左手的拇指和食指捏住頸背部皮膚，再翻轉(zhuǎn)左手，將小鼠置于左手掌心中，右手拉住小鼠尾部，再用左手小指和無名指壓住小鼠尾根部使小鼠整個呈一條直線。固定時注意，過分用力會使小鼠頸椎脫臼，若用力過輕頭部能反轉(zhuǎn)過來咬傷實驗者的手。這種固定方法是灌胃給藥和腹腔注射給藥常用的方法。手術(shù)固定法：用乙醚等麻醉藥品麻醉后，用長20~30cm的線繩分別系在四肢上，再把四肢的線繩分別系在固定板四角的釘子上，并且在頭部上顎切齒的地方牽一根線繩達到完全固定。在靜脈給藥時，先根據(jù)小鼠的大小選擇合適的固定器，打開鼠筒蓋，把小鼠放在里面，只露出尾巴；或者用倒放的燒杯將鼠扣住，只露出尾巴并壓住。二、大鼠的抓取與固定抓取方法：4~5周齡以內(nèi)的大鼠同小鼠；周齡較大的大鼠其尾部皮膚容易被剝脫，所以用左手從背部中央到胸部捏起來抓住。抓取時最好帶防護手套，但手套不宜過厚。手固定法：同小鼠。手術(shù)固定法：同小鼠。靜脈給藥或采血時同小鼠。三、豚鼠的抓取與固定抓取方法：抓取幼小豚鼠時，用手捧起來；成熟的大豚鼠，用手大把抓起胸肋部即可。注意不能粗野，更不能抓取腰腹部，這樣容易造成肝破裂而死亡。手固定法：⑴將左手的食指和中指放在豚鼠頸背部兩側(cè)，拇指和無名指放在肋部，分別用手指夾住左右前肢抓起來。⑵反轉(zhuǎn)左手，用右手的拇指和食指夾住右后肢，用中指和無名指夾住左后肢是豚鼠整體伸直成一條直線。⑶一個人固定操作時，坐在椅子上，用右手拿著豚鼠的后肢夾在兩腿之間，用大腿代替右手夾住。手術(shù)固定法：同大、小鼠。四、家兔的抓取與固定抓取方法：用一只手大把抓住頸背部皮膚提起來，另一只手托住其臀部，讓其重心落在托其臀部的手上，運送時，還要抓住頸肩部皮膚抱著兔子運送。手固定法：在灌胃給藥時，人坐在椅子上，用一只手抓住頸背部皮膚，另一只手抓住兩后肢放在兩腿之間，大腿夾住兔子的下半身，用空著的手抓住兩前肢固定之，抓住頸背部的手同時捏著兩只耳朵，不讓頭部轉(zhuǎn)動。固定器固定法：耳靜脈給藥或采血時用盒式固定法；從頸動脈采血或手術(shù)實驗時用臺式固定法。盒式固定法：把兔子放在盒子里，只露出頭部，用轉(zhuǎn)扭擰固定器固定家兔。臺式固定法：將麻醉的兔子仰臥，用紗布條依次將四肢捆綁固定于固定臺的兩側(cè)，然后把頭部放在金屬制的首伽和咀環(huán)上固定。五、犬的抓取與固定抓取方法：先給犬帶上系有鐵鏈條的脖套，對于性情兇猛的犬，要用特制的鉗式長柄犬夾夾住犬頸部將犬按倒后，再系脖套和鏈條。手固定法：首先綁住犬嘴，方法是飼養(yǎng)員或犬主人從側(cè)面靠近并輕輕撫摸其頸部皮毛，然后迅速用布帶綁住犬嘴，布帶從下頜繞到上頜打一個結(jié)，再繞到下頜打一個結(jié)，然后將布帶繞到頭后頸，在頸后部再打一個結(jié)，最后打一個活結(jié)，對于未經(jīng)馴服的犬，可用長柄犬夾夾住犬頸部按倒后強制綁嘴。手術(shù)臺固定法：麻醉后，松開布帶，將犬仰臥在手術(shù)臺上，先固定四肢，再固定頭部。六、貓的抓取與固定抓取方法：先輕聲呼喚，慢慢將手伸入貓籠，輕輕撫摸貓頭、頸及背部，然后一只手抓住其背部皮毛，另一只手抓其腰背部。如遇兇暴的貓不讓接觸時，可用網(wǎng)套抓取。固定方法：同兔臺式固定法。貓頭可用一根粗棉繩，一端拉住貓的兩只門齒，另一端捆綁在實驗臺的鐵柱上。第二節(jié)、實驗動物的編號與標(biāo)記一、染色法：用化學(xué)試劑或藥品在實驗動物體表的不同部位進行涂染，并用不同顏色區(qū)別各組動物。編號原則是先左后右，從前到后，從上到下。有時用兩種顏色一個代表十位、一個代表個位。常用的染色劑有3%~5%的苦味酸（黃色）、2%的硝酸銀溶液（咖啡色）、0.5%的中性品紅溶液（紅色）和煤焦油酒精溶液（黑色）。二、耳緣剪孔法：是在動物的耳邊緣剪出不同的缺口或打成不同的小孔進行標(biāo)記的方法。為防止孔、口愈合，一般在打孔后用消毒的滑石粉涂抹在孔、口局部。由打孔或剪切的位置和孔數(shù)代表編號，一般在耳內(nèi)按上、中、下打孔，分別代表1、2、3，在相應(yīng)位置剪缺口代表4、5、6，剪兩個缺口代表7、8、9，無孔或缺口為10。一般左耳代表個位數(shù)、右耳代表十位數(shù)。三、烙印法：用烙印鉗或刺針將號碼刺在或烙印在動物無體毛或明顯部位，如耳、面、鼻部及四肢等，然后用溶在酒精中的黑墨在針刺處涂抹。這種方法適用于大中型實驗動物，操作時要注意防止感染。四、號牌法：用特制的金屬號牌固定在實驗動物的耳上或頸項部，掛牌時要注意避開血管。此法適用于小動物。五、籠子編號法：不在動物身體上作標(biāo)記而把裝動物的籠子進行編號，也叫替代法。第三節(jié)、實驗動物的給藥與去毛一、攝入法給藥二、注射法給藥三、去毛一、攝入法給藥1.自動口服法：將藥物放入飼料或飲水中，讓動物自動攝入，方法簡單不費工夫，也不會給動物造成損傷。但很難掌握給藥量，有時藥物在常溫下還會分解。這種方法一般適用于動物疾病的防治、藥物的毒性觀察、某些與食物有關(guān)的人類疾病動物模型的復(fù)制等。2.強制灌胃給藥：就是用灌胃器將藥品直接強制灌入胃內(nèi)。這種方法能準(zhǔn)確掌握給藥量、給藥時間，并能發(fā)現(xiàn)和記錄癥狀出現(xiàn)的時間及經(jīng)過。缺點是費時、同時給動物帶來一定的損傷和心理影響。因此，如果操作技術(shù)熟練對動物的不良影響就可以減少一些。⑴大、小鼠、豚鼠的灌胃法：左手抓住鼠背頸部皮毛將動物固定，右手持灌胃器，將灌胃針從口腔插入，沿上顎壁插入食道，使其前端達到膈肌水平，為防止插入氣管，應(yīng)回抽注射器針?biāo)?，如無空氣被抽回，即可將藥液注入。小鼠進針約3~4cm、大鼠、豚鼠為4~6cm，常用灌胃量小鼠為0.2~1.0ml、大鼠為1~4ml、豚鼠為1~5ml。⑵兔、犬、貓的灌胃法：先固定動物，然后將開口器固定在動物口中，壓住舌頭，然后將灌胃管從開口器小孔插入食道，將另一端浸入水中，如有氣泡逸出，說明誤入氣管需拔出重插。插好后將藥液推入。為避免藥液殘留需注入5ml生理鹽水。兔、貓進針為15cm左右，犬為20cm左右。一次耐受量兔為80~150ml，犬為200~500ml。各種動物一次灌胃能耐受的最大容積動物種類體重（g）最大容積（ml）小鼠＞301.025~300.820~240.5豚鼠＞3006.0250~3004.0~5.0大鼠＞3008.0250~3006.0200~2494.0~5.0100~1993.0家兔＞35002002500~35001502000~2400100貓＞3000100~1502500~300050~80犬10000~15000200~5003.直腸給藥：多用于家兔，將藥物通過肛門直接注入動物直腸內(nèi)，經(jīng)直腸壁吸收，注意不要誤入陰道。二、注射法給藥1.皮內(nèi)注射：將藥液注入皮膚的表皮與真皮之間。用于接種、過敏實驗、觀察皮內(nèi)反應(yīng)及皮膚血管的通透性等。方法為脫毛消毒→刺入皮內(nèi)→向上挑起稍退一些針后再稍刺入→注入藥液。2.皮下注射：用左手拇指與食指輕輕捏起動物皮膚，右手持針將其刺入皮下，如果針頭易擺動證明已在皮下，可推進藥液，拔針后輕按針孔片刻防止藥液逸出。小鼠一般在背部、大鼠在背頸部或側(cè)下腹部、豚鼠在大腿內(nèi)側(cè)或背部、兔在背部或耳根部、貓犬在大腿外側(cè)。3.肌肉注射：一般選擇肌肉發(fā)達而且無大血管經(jīng)過的部位，犬、貓、兔多選臀部，大、小鼠多選股部。注射時針尖穿過皮膚后，再往深部刺入肌肉，此時針尖不能自由活動，回抽注射器無回血，即可注射。一般小動物選擇5或5.5號針頭，大動物選用6或6.5號針頭。注意，注射時針頭與肌肉成60。角，一次性刺入，小鼠每次注入量不超過0.1ml。4.腹腔注射：將動物固定，然后在左或右下腹皮下，將針頭向前推0.5~0.6cm，再以45。角斜穿腹肌，緩慢注入藥液。注藥之前有落空感，回抽無腸液、尿液后方可注藥。小鼠一次注射量為0.1~0.2ml/10g(體重)，大鼠為1~2ml/100(體重)。5.靜脈注射：實驗動物不同所選靜脈注射部位也不同。大、小鼠一般選用尾靜脈，兔選用耳緣靜脈，犬選用后肢小隱靜脈或前肢內(nèi)側(cè)皮下靜脈注射。一般只限于液體藥物，若是懸濁液，可能引起血管栓塞。⑴大、小鼠尾靜脈注射：尾靜脈有3條，左右兩側(cè)和背側(cè)各有1條，由于兩側(cè)靜脈比較容易固定，所以常被采用。操作時，先將動物固定在暴露尾部的固定器內(nèi)（燒杯等），除毛后，將尾部置于45℃~50℃的溫水中浸泡1~2分鐘或用75%酒精棉反復(fù)擦拭使血管擴張，以左手拇指和食指捏住尾兩側(cè)，使靜脈充盈，注射時針頭盡量采取與尾部平行的角度進針，完畢后把尾部向注射側(cè)彎曲止血。一次注射量為0.05~0.1mg/10g(體重)⑵兔耳緣靜脈注射：兔耳緣靜脈表淺易固定而常被采用。操作時，先固定兔子，而后用75%酒精棉球反復(fù)擦拭使血管充盈，左手食指、中指夾住靜脈近心端，拇指繃緊靜脈遠心端，無名指和小指墊在耳下邊，針從靜脈末端刺入并順血管方向平行刺入1cm左右，回抽有血后再用拇指固定針頭，放開食指和中指將藥液注入，拔針后用酒精棉球壓迫幾分鐘，防止流血和消毒。⑶犬的靜脈注射：多采用前肢內(nèi)側(cè)皮下靜脈或后肢小隱靜脈，在靜脈血管近心端用橡皮帶扎緊，使血管充盈，從靜脈的遠心端平行進針，回抽有血后松開橡皮帶，將藥液緩慢注入。⑷豚鼠的靜脈注射：同犬的靜脈注射方法，也可以象兔一樣采用耳緣靜脈注射。6.淋巴囊注射：主要用于蛙類。7.關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射：主要用于大中型動物，給兔子注射時首先將兔仰臥固定，在臏韌帶附著點外上方約0.5cm處進針，針頭從前上方向下后方傾斜刺入，直至針頭遇到阻力變小為止，然后針頭稍后退，以垂直方向推進關(guān)節(jié)腔中。當(dāng)有刺破薄膜的感覺時即可注入藥液。8.腦內(nèi)注射：常用于微生物學(xué)試驗。將病原體接種于被檢動物腦內(nèi)，然后觀察接種后的變化9.椎管內(nèi)注射：主要用于椎管麻醉和抽取腦脊液。10.椎動脈注射：應(yīng)用于兔、犬、貓等動物。三、去毛1.拔毛法：在各種動物做后肢皮下靜脈注射或采血，特別是兔耳緣靜脈注射或采血時常用。動物固定→拇指和食指拔去所需部位毛→涂一層凡士林。2.剪毛法：動物固定→水濕潤剪毛部位→將局部皮膚繃緊→用彎頭手術(shù)剪緊貼皮膚剪毛。3.剃毛法：動物固定→肥皂水浸潤剃毛部位→順被毛方向剃毛（若用電動剃刀則逆被毛方向剃毛）。4.化學(xué)脫毛法：常用于大動物無菌手術(shù)、局部皮膚刺激性實驗、觀察動物局部血液循環(huán)或其它各種病理變化。⑴方法：動物固定→剪短脫毛部位被毛→用棉球或紗布沾取脫毛劑→在脫毛部位涂成薄層→2~3分鐘后用溫水洗滌脫下的被毛→干紗布擦干→涂一層油脂。⑵常用脫毛劑：硫化堿、硫化鈉、硫化鈣、硫化鍶、硫化鋇、三硫化二砷。⑶配方：Ⅰ硫化鈉:肥皂粉:淀粉=3:1:7調(diào)成膏狀。Ⅱ硫化鈉:淀粉:糖:甘油;硼砂:水=8:7:4:5:1:75調(diào)成糊狀。Ⅲ8%的硫化鈉溶液Ⅳ硫化堿10g、生石灰15g，加水至100ml，溶解即可。第四節(jié)、實驗動物的麻醉一、全身麻醉二、局部麻醉三、麻醉注意事項一、全身麻醉1.吸入麻醉：多采用乙醚做麻醉藥。把帶有乙醚的棉球放入玻璃容器內(nèi)，揮發(fā)后將動物放入容器內(nèi)4~6分鐘，動物失去運動力后立即取出動物以避免麻醉過深致死。此法多用于短期操作性實驗，乙醚麻醉的優(yōu)點是蘇醒快，但是對呼吸道刺激性大，長時間容易窒息死亡。2.注射麻醉：大、小鼠和豚鼠常采用腹腔注射法進行全身麻醉，犬、貓、兔等既可腹腔注射也可靜脈注射給藥。注射時，先用麻醉藥總量的2/3，密切觀察動物生命體征的變化，如已經(jīng)達到所需麻醉的程度，余下的麻醉藥則不用，避免麻醉過深抑制大腦呼吸中樞導(dǎo)致動物死亡。各種動物常用的全身麻醉劑的劑量及途徑劑量(mg/kg體重)動物注射戊巴比巴比苯巴比硫噴異戊巴氯胺酮氯醛糖烏拉坦途徑妥鈉妥鈉妥鈉妥鈉妥鈉比妥鈉(20%~25%)(1%~3%)(1%~2%)(5%~10%)(10%)小鼠i.p50~80200/15~20100100~200//i.m///////1350大鼠i.p40~50200/40~100100100~200550/i.m///////1350s.c//100~110////800~1000豚鼠i.p30~50100//100///i.m///20~50///1350兔i.p25~40///80~120///i.v20~30225~300/15~2040~50/80~100750~1000犬i.p30//20~5080~10010~40//i.v3022550~10015~2040~50/60750~1000口服/350////1001500注:i.p指腹腔注射,i.m指肌肉注射,s.c指皮下注射,i.v指靜脈注射二、局部麻醉1.表面麻醉:利用局部麻醉藥的組織穿透作用，透過粘膜，阻滯淺表的神經(jīng)末梢，稱為表面麻醉。常用利多卡因，眼部用藥點滴、鼻內(nèi)用要涂敷、咽喉氣管用藥噴霧、尿道灌注給藥。2.區(qū)域阻滯麻醉：在手術(shù)區(qū)內(nèi)四周和底部注射麻醉藥阻斷疼痛的向心傳導(dǎo)，稱為區(qū)域阻滯麻醉。常用普魯卡因。3.神經(jīng)干(叢)阻滯麻醉：在神經(jīng)干(叢)的四周注射麻醉藥，阻滯其傳導(dǎo)，使其所支配的區(qū)域疼痛感覺消失，稱為神經(jīng)干(叢)阻滯麻醉。常用利多卡因。4.局部浸潤麻醉：沿手術(shù)切口逐層注射局部麻醉藥，阻滯組織中的神經(jīng)末梢，稱為局部浸潤麻醉。常用普魯卡因。三、麻醉注意事項1.有些麻醉藥，如乙醚揮發(fā)性很強，易燃，使用時應(yīng)遠離火源，平時應(yīng)妥善保存。2.應(yīng)特別注意各種麻醉藥的劑量和給藥途徑，切莫因藥量過大而引起中毒或死亡。3.注射時，一般要求緩慢注入，并隨時觀察動物肌肉的緊張性、角膜反射、呼吸頻率、疼痛反射等指標(biāo)。4.注意保溫。5.萬一麻醉過量，根據(jù)不同情況采取措施，如施行人工呼吸、給予蘇醒劑或注射強心劑、咖啡因、腎上腺素、可拉明等，也可以靜脈注射5%溫?zé)岬钠咸烟侨芤?。第五?jié)、實驗動物血液、體液的采集一、實驗動物的血液采集二、實驗動物的體液采集一、實驗動物的血液采集采血部位及采血量采血方式采血部位采血量(ml)采血前處置小鼠大鼠部尾靜脈0.03~0.050.3~0.5分尾動脈0.1~0.30.5~1.0采足背中靜脈0.1~0.3血眼窩靜脈叢0.05~0.10.5~1.0麻醉(不麻亦可)頸靜脈0.5~1.03~5麻醉手術(shù)全頸動脈0.5~1.0同上斷頭0.5~1.05~10麻醉(不麻亦可)采心臟0.5~0.83~5麻醉、手術(shù)后大靜脈0.5~1.02~4同上血腹大動脈5~8同上采血部位及采血量動物采血部位采血量(ml)采血前處理豚鼠耳動脈(部分)＜0.5耳靜脈(部分)＜0.5心臟(全)5~10全采血時也有麻醉、手術(shù)開胸后直視下采血的方法后大靜脈(全)3~5麻醉、手術(shù)腹動脈(全)5~10同上頸靜脈(全)3~5同上家兔耳靜脈(部分)2~5耳動脈(部分)5~10心臟(全)80~100頸動脈(全)80~120麻醉、手術(shù)二、實驗動物的體液采集1.尿液的采集⑴代謝籠法：此法較常用，適用于大、小鼠、沙鼠、豚鼠、兔等中小動物。將動物放在特制的籠內(nèi)，動物排便時，可以通過籠底的大小便分離漏斗