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文檔簡介
第十二章程序性細(xì)胞死亡與細(xì)胞衰老
程序性細(xì)胞死亡(PCD)細(xì)胞衰老1
第一節(jié)程序性細(xì)胞死亡(PCD)
受到嚴(yán)格的基因調(diào)控、程序性的細(xì)胞死
亡形式。對生物體的正常發(fā)育、自穩(wěn)態(tài)
平衡及多種病理過程具有重要的意義。
本節(jié)內(nèi)容將涉及:
動物細(xì)胞的程序性死亡
植物細(xì)胞與酵母細(xì)胞的程序性死亡(自學(xué))2細(xì)胞死亡的方式主要有三種:細(xì)胞凋亡(apoptosis)細(xì)胞壞死(necrosis)
細(xì)胞自噬(autophagy)動物細(xì)胞的程序性死亡3機(jī)體結(jié)構(gòu)細(xì)胞增殖細(xì)胞分化細(xì)胞凋亡細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)染色體(DNA與蛋白質(zhì)的相互作用)衰老4細(xì)胞凋亡(Apoptosis)●細(xì)胞凋亡一詞的來源:
細(xì)胞凋亡一詞,即apoptosis,源自希臘語,
本意指樹葉的脫落或花瓣的凋零。
選用此詞,是強(qiáng)調(diào)這一過程是一種自然的生
理學(xué)過程,是受基因調(diào)控的主動的生理性細(xì)
胞自殺行為。5
2002年,悉尼·布雷諾爾(英)、羅伯特·霍維茨(美)
和約翰·蘇爾斯頓(英),因在器官發(fā)育的遺傳調(diào)控和
細(xì)胞程序性死亡方面的研究獲諾貝爾生理學(xué)/醫(yī)學(xué)獎。JohnE.Sulston
H.RobertHorvitzSydneyBrenner6
秀麗隱桿線蟲C.elegans是研究PCD的理想材料咽卵巢腸陰門直腸肛門7雌雄同體細(xì)胞數(shù):體:1090–131=959(cells)生殖:2000雄性(0.05%)細(xì)胞數(shù):體:1090(cells)生殖:1000幼蟲細(xì)胞數(shù)(個):體細(xì)胞:556原始生殖細(xì)胞:2
秀麗隱桿線蟲細(xì)胞凋亡情況81、細(xì)胞凋亡的概念:
一種有序的或程序性的細(xì)胞死亡方式,使細(xì)胞接受
某些特定信號刺激后進(jìn)行的正常生理應(yīng)答反應(yīng)。
該過程具有典型的形態(tài)學(xué)和生化特征,凋亡細(xì)胞最
后以凋亡小體的形式被吞噬消化。
細(xì)胞凋亡是一個主動的由基因決定的自動結(jié)束生命
的過程,也常被稱為細(xì)胞程序性死亡(即PCD,
programmedcelldeath)。一)細(xì)胞凋亡的概念及特征一、細(xì)胞凋亡92、細(xì)胞凋亡
過程及特征最重要特征:細(xì)胞質(zhì)膜保持完整,內(nèi)含物不外泄,不引發(fā)機(jī)體炎癥反應(yīng)。需ATP供能凋亡小體形成細(xì)胞凋亡開始正常細(xì)胞凋亡小體被吞噬10胸腺細(xì)胞凋亡過程形態(tài)變化正常凋亡凋亡細(xì)胞表面發(fā)泡,許多泡狀或者芽狀突起,逐漸分隔,形成單個凋亡小體。11胸腺細(xì)胞凋亡過程形態(tài)變化正常凋亡12可逆膨脹細(xì)胞皺縮不可逆膨脹解體破碎胞膜完整細(xì)胞壞死細(xì)胞凋亡133、細(xì)胞凋亡的生化特征(DNA梯狀條帶)1)細(xì)胞色素C誘導(dǎo)0h2)細(xì)胞色素C誘導(dǎo)1h3)細(xì)胞色素C誘導(dǎo)2h4)細(xì)胞色素C誘導(dǎo)3h5)細(xì)胞色素C誘導(dǎo)4h6)陰性對照7)Marker細(xì)胞色素C作用:促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)特異性核酸酶內(nèi)切酶活化。DNA降解成180-200bp片段或其整數(shù)倍片段144、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因子1)物理性因子:包括射線(紫外線,
射線等),較溫和的溫度刺激(如:熱激,冷激)等。2)化學(xué)及生物因子:包括活性氧基團(tuán)和分子(超氧自由基,H2O2),
DNA和蛋白質(zhì)合成的抑制劑,正常生理因子
(激素、細(xì)胞生長因子)的失調(diào)及凋亡因子(腫瘤
壞死因子,TNF
)、細(xì)胞毒素等。151、凋亡的生理學(xué)意義:1)生長發(fā)育:
組織與器官的塑造(趾的分化);動物變態(tài)等2)免疫細(xì)胞分化:淋巴細(xì)胞的克隆選擇3)防御作用:
清除衰老細(xì)胞、DNA損傷的細(xì)胞以及被病原體
感染的細(xì)胞。二)細(xì)胞凋亡的生理意義161)蝌蚪尾巴的消失
蝌蚪在變態(tài)過程中,尾部細(xì)胞發(fā)生凋亡172)脊椎動物的神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育
凋亡的神經(jīng)元神經(jīng)元靶細(xì)胞靶細(xì)胞分泌的存活因子通過細(xì)胞凋亡使神經(jīng)元的數(shù)目與靶細(xì)胞相匹配神經(jīng)生長因子等183)發(fā)育過程中手和足的成形過程凋亡細(xì)胞被吞噬后形成趾間隔19胎鼠趾的發(fā)育202、凋亡的病理學(xué)意義1)病原體侵染誘導(dǎo)凋亡—HIV抑制凋亡
—Poxvirus(痘病毒)2)
細(xì)胞凋亡不足腫瘤、自身免疫疾?。?)細(xì)胞凋亡過度神經(jīng)退行性疾?。ˋD,帕金森癥)、心肌梗塞、
再生障礙性貧血、骨組織壞死等。21三)細(xì)胞凋亡的檢測◆形態(tài)學(xué)觀測:染色法、透射和掃描電鏡觀察◆DNA電泳:DNA片段呈現(xiàn)出梯狀條帶◆TUNEL測定法(DNA斷裂的原位末端標(biāo)記法)◆彗星電泳法(cometassay)凋亡細(xì)胞DNA降解片段電荷發(fā)生了變化,在電場泳動
的速度較快,使細(xì)胞核呈現(xiàn)出一種彗星式的圖案。◆流式細(xì)胞分析(凋亡細(xì)胞為亞二倍體)221、形態(tài)學(xué)觀測1)臺盼藍(lán)染色:臺盼藍(lán)可為活細(xì)胞排斥,但可使死細(xì)胞著色。2)Giemsa染色:
可觀察染色質(zhì)固縮,凋亡小體的形成等。3)透射和掃描電鏡:可觀察凋亡細(xì)胞核的形態(tài)、結(jié)構(gòu)變化,如:染色體固縮,凋亡小體的形成等現(xiàn)象。232、DNALadder檢測1)誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡2)收集凋亡的細(xì)胞,
提取基因組DNA3)以2%的瓊脂糖
膠電泳分離DNA4)EB染色進(jìn)行觀察染色質(zhì)DNA在核小體間被切割243、TUNEL測定法(標(biāo)記DNA斷裂缺口的3’-OH)基因組DNA斷裂時,
暴露的3’-OH可以在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移
酶(TdT)
的催化下,
加上熒光或DIG標(biāo)記的dUTP,可通過熒光顯微鏡/流式細(xì)胞儀或酶促顯色進(jìn)行檢測。25TUNEL測定法檢測晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡情況264、DAPIStaining方法(與DNA結(jié)合的染料)27四)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制
線蟲(C.elegans)的凋亡研究發(fā)現(xiàn):
ced3、ced4基因促進(jìn)細(xì)胞凋亡,ced9
基因可阻止ced3/ced4的激活,抑制細(xì)胞凋亡。
Ced3在哺乳類同源物是ICE(Interleukin-1β-convertingenzyme,白介素-1β
轉(zhuǎn)換酶),
即
Caspase1,可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。常見的細(xì)胞凋亡途徑有兩條:Caspase依賴性的細(xì)胞凋亡(外源、內(nèi)源性)和不依賴于caspase
的細(xì)胞凋亡途徑,兩個途徑一般同時被激活。
281、Caspase家族與凋亡1)Caspase家族簡介
Caspase的活性位點均包含半胱氨酸(Cysteine)
殘基,裂解靶蛋白位點是天冬氨酸殘基后的肽
鍵,故稱天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白水解
酶(Cysteineasparticacicspecificprotease),
即
Caspase。
Caspase自身以非活化的酶原Procaspase存在,
其激活依賴于其他的Caspase在它的天冬氨酸
位點裂解活化或自身活化。292)caspase超家族成員及功能(15種)執(zhí)行者負(fù)責(zé)切割胞質(zhì)及核內(nèi)的結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)蛋白,產(chǎn)生凋亡對執(zhí)行者前體進(jìn)行切割,激活執(zhí)行者白介素前體的活化,不直接參與凋亡信號的傳遞30Caspase的分類及功能(共15種)ExecutioneroreffectorAutocatalyticinitiator炎癥執(zhí)行者起始者/引發(fā)者31A、起始者:對執(zhí)行者前體進(jìn)行切割、激活
包括:Caspase-2,8,9,10,11
B、執(zhí)行者:切割胞質(zhì)及核內(nèi)的結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)蛋白,產(chǎn)生效應(yīng)
包括:Caspase-3,6,7
C、激活期:
前期細(xì)胞應(yīng)答死亡信號,起始Caspase活化D、執(zhí)行期:后期執(zhí)行Caspase活化,執(zhí)行細(xì)胞死亡3)Caspase的分類:4)Caspase的激活階段:323)Caspase的結(jié)構(gòu)特征①
起始者及執(zhí)
行者均以無
活性的酶原
形式存在;②
N端均含一段前區(qū)域;33④在大亞基的C端含有
一活性中心,其中半
胱氨酸是必需氨基酸。③活性形式由2個大亞基和2個小亞基組成的雜四聚體;Activeenzyme催化位點34Caspase的級聯(lián)效應(yīng)Caspase的酶原活化354)
Caspase的作用底物目前已知的Caspase作用底物約280種36
①凋亡蛋白酶激活的DNA酶抑制物(ICAD)CAD:CaspaseActivatedDNase由Caspase激活的核酸酶(具內(nèi)切酶活性)ICADCADDNACaspaseCaspase的作用底物舉例降解37②核纖層(lamina)蛋白核纖層解體核纖層染色體③細(xì)胞骨架蛋白:
導(dǎo)致細(xì)胞解體,形成凋亡小體
④其他的caspases⑤滅活細(xì)胞凋亡的抑制物38
當(dāng)細(xì)胞接受凋亡信號分子(FasL,TNF等)刺激后,凋亡細(xì)胞表面信號分子受體相互聚集并與細(xì)胞內(nèi)銜接蛋白(Adaptorprotein)結(jié)合,這些銜接蛋
白又募集Procaspase聚集在受體部位,胞質(zhì)內(nèi)的
Procaspase相互活化并產(chǎn)生級聯(lián)反應(yīng),使細(xì)胞凋亡。2、Caspase依賴的細(xì)胞凋亡途徑分為死亡受體(Fas)起始的外源途徑及線粒體起源的內(nèi)源途徑兩條。1)死亡受體起始的外源途徑(書上P450)39下游caspases活化后,作用于底物,裂解核
纖層蛋白,導(dǎo)致細(xì)胞核形成凋亡小體;裂解
Dnase結(jié)合蛋白,使Dnsae釋放,降解DNA
形成DNAladder,裂解參與細(xì)胞連接或附著
的骨架和其他蛋白,使凋亡細(xì)胞皺縮、脫落,
便于細(xì)胞吞噬;導(dǎo)致膜脂重排(如:磷酯酰絲氨酸由脂雙層內(nèi)頁→外頁),便于吞噬細(xì)
胞識別并吞噬。40外源性死亡受體通路凋亡誘導(dǎo)因素死亡受體(Fas)配體(FasL)的表達(dá)、結(jié)合Caspase-8活化Caspase-3活化apoptosisFADDFADD接頭蛋白41死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物接頭蛋白DD:死亡結(jié)構(gòu)域DED:死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域CARD:caspase募集結(jié)構(gòu)域8,102,9凋亡誘導(dǎo)因子細(xì)胞凋亡內(nèi)源和外源信號途徑Bcl-2家族執(zhí)行者起始者起始者Apaf-1:凋亡蛋白酶活化因子
接頭蛋白
422)Bcl-2家族與線粒體起源的內(nèi)源性細(xì)胞凋亡
Bcl-2(B-celllymphomagene2)是一種原癌基因,是線蟲抗凋亡蛋白Ced9在哺乳類中的同源物,與線粒體相結(jié)合,能改變線粒體外膜通透性(釋放凋亡因子CytC),抑制或促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Bcl-2家族成員的基因根據(jù)功能不同可分為兩組:A、Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w等抑制凋亡;B、Bax、Bak、Bad、Noxa等促進(jìn)凋亡。
43BCL-2家族部分成員Bax和Bak寡聚化,促進(jìn)CytC釋放,引發(fā)凋亡;
Bcl-2、Bcl-xL與Bax/Bak形成異二聚體,阻止Bax和
Bak寡聚化,從而抑制凋亡。44Bcl-2家族、線粒體與細(xì)胞凋亡
Bcl-2家族促凋亡因子
Bid被活化后的Caspase8
或其他刺激因素裂解成2個片段,其中含有BH3
(Bcl-2homology)結(jié)構(gòu)域的
C-端片段被運送到線粒體,與Bcl-2
/
Bax
的BH3結(jié)構(gòu)域形成復(fù)合物,
導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放。CytC與胞質(zhì)中Ced4同源物Apaf-1(凋亡蛋白酶活化因子
apoptosisprotease
activatingfactor)結(jié)合并活化Apaf-1,被活化的
Apaf-1再活化Procaspase9,最后引起細(xì)胞凋亡。4546細(xì)胞內(nèi)源信號激發(fā)細(xì)胞程序性死亡起始者執(zhí)行者凋亡蛋白酶活化因子CytC被釋放并與Apaf1結(jié)合47凋亡誘導(dǎo)因素死亡受體/配體的表達(dá)、結(jié)合Caspase-8活化Caspase-3活化apoptosisBid活化線粒體通路活化死亡受體通路與線粒體通路的聯(lián)系Caspase-3活化48二、細(xì)胞壞死(necrosis)P543
細(xì)胞受到意外損傷,如極端的物理、化學(xué)因素或與嚴(yán)重的病理性刺激而發(fā)生的細(xì)胞被動死亡形式。細(xì)胞壞死時,細(xì)胞
內(nèi)含物釋放到胞外,引起周圍區(qū)域的炎癥反應(yīng)。
49
炎癥反應(yīng)50細(xì)胞壞死細(xì)胞凋亡性質(zhì)病理性的群體細(xì)胞死亡生理性或病理性的單個細(xì)胞死亡誘導(dǎo)因素強(qiáng)烈刺激,隨機(jī)發(fā)生較弱刺激,非隨機(jī)發(fā)生生化特點被動過程,無新蛋白合成,不耗能主動過程,有新蛋白合成耗能形態(tài)變化細(xì)胞結(jié)構(gòu)全面溶解、破壞、細(xì)胞腫脹,失去質(zhì)膜完整性胞膜及細(xì)胞器相對完整,細(xì)胞皺縮,核固縮DNA電泳彌散性降解,電泳呈均一DNA片狀(“拖尾”)DNA片段化(180-200bp)電泳呈梯狀條帶炎癥反應(yīng)溶酶體破裂,局部炎癥反應(yīng)溶酶體相對完整局部無炎癥反應(yīng)凋亡小體無有基因調(diào)控?zé)o有細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死的特征比較51第二節(jié)細(xì)胞衰老
cellaging
或cellsenescence
一般含義是復(fù)制衰老,是指正常細(xì)胞經(jīng)過有限次數(shù)的分裂增殖后,停止分裂,細(xì)胞形態(tài)和生理代謝發(fā)生顯著改變的過程。52涉及內(nèi)容●
Hayflick
界限(HayflickLimitation)●細(xì)胞在體內(nèi)條件下的衰老(自學(xué))●衰老細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化(自學(xué))●細(xì)胞衰老的分子機(jī)制(自學(xué))531、概念:關(guān)于細(xì)胞增殖能力和壽命是有限的觀點細(xì)胞,至少是培養(yǎng)的二倍體細(xì)胞,不是不死的,而是有一定的壽命;它們的增殖能力不是無限的,而是有一定的界限,這就是Hayflick
界限(即細(xì)胞最大分裂次數(shù))。癌細(xì)胞或培養(yǎng)的細(xì)胞系是不正常細(xì)胞,其染色體數(shù)目或形態(tài)已經(jīng)不同于原先的細(xì)胞。細(xì)胞的增殖能力與供體年齡有關(guān)物種壽命與培養(yǎng)細(xì)胞壽命之間存在著一定的關(guān)系二倍體細(xì)胞的衰老是由細(xì)胞本身決定的 ◆決定細(xì)胞衰老的因素在細(xì)胞內(nèi)部,不是外部的環(huán)境 ◆是細(xì)胞核而不是細(xì)胞質(zhì)決定了細(xì)胞衰老一、Hayflick界限(HayflickLimitation)54成人早衰癥(Werner'ssyndrome):病人平均39
歲時出現(xiàn)衰老,47
歲左右生命結(jié)束。55患嬰幼兒早衰癥(Hutchinson-Gilfordsyndrome):小孩在1
歲時出現(xiàn)明顯的衰老,12-18
歲即過早夭折,其細(xì)胞培養(yǎng)只傳代2-10次。56二、細(xì)胞在體內(nèi)條件下的衰老●在機(jī)體內(nèi),細(xì)胞的衰老和死亡是常見的現(xiàn)象,甚至在個體發(fā)育的早期也會發(fā)生?!裾G闆r下終生保持分裂的細(xì)胞,其分裂能力是否隨著有機(jī)體年齡的增高而下降?它們會不會衰老?◆衰老動物體內(nèi),細(xì)胞分裂速度顯著減慢,其原因主要是
G1
期明顯延長。◆衰老個體內(nèi)的環(huán)境因素影響了細(xì)胞的增殖和衰老。◆骨髓干細(xì)胞移植實驗說明隨著年齡的增加,干細(xì)胞增殖速度也趨緩慢。57一名男子從36歲到75歲味覺喪失64%腎小球減少44%腎小球過濾率減少31%脊神經(jīng)元減少37%神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢10%腦供血量減少20%肺活量減少44%58三、細(xì)胞衰老的形態(tài)變化59衰老細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化細(xì)胞核的變化內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的變化線粒體的變化致密體的生成膜體系的變化60一)細(xì)胞核的變化在衰老變化中細(xì)胞核結(jié)構(gòu)的最明顯變化是核膜內(nèi)折。電鏡檢測可見衰老細(xì)胞核形狀不規(guī)則、內(nèi)陷和斷裂。染色質(zhì)固縮化是衰老細(xì)胞核中另一個重要變化。在衰老細(xì)胞中,細(xì)胞核固縮,還常常出現(xiàn)核內(nèi)容物,核質(zhì)染色加深,核的細(xì)致結(jié)構(gòu)逐漸消失,核仁也發(fā)生明顯的變化。61二)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的變化在衰老細(xì)胞中,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列變得無序,膜腔膨脹擴(kuò)大甚至崩解,膜面上核糖體數(shù)量減少。三)線粒體的變化細(xì)胞中線粒體的數(shù)量隨著年齡的增大而減少,而其體積則隨著年齡的增長而增大。同時,線粒體的結(jié)構(gòu)也發(fā)生變化,腫脹空泡化,內(nèi)部嵴大大減少。線粒體崩解是細(xì)胞衰老變化的重要標(biāo)志。62四)致密體的生成
溶酶體或線粒體轉(zhuǎn)化五)膜系統(tǒng)的變化1.膜脂相發(fā)生改變,不飽和脂肪酸含量增加,膜流動性下降。2.細(xì)胞的間隙連接明顯減少,組成間隙連接的膜內(nèi)顆粒聚集體變小,使細(xì)胞間代謝協(xié)作減少。3.膜的微粘度增加,從而影響膜表面受體的移動和特異性生物化學(xué)信號的傳導(dǎo)。63四、細(xì)胞衰老的分子機(jī)制一)氧化損傷學(xué)說:
該理論認(rèn)為,代謝過程中產(chǎn)生的活性氧基團(tuán)或分子
(ROS,reactiveoxygenspecies)引發(fā)的氧化性損傷的積累,最終導(dǎo)致衰老。ROS主要有三種類型:
◆O2-,即超氧陰離子;◆
OH-,即羥自由基;◆
H2O2。它們的高度活性引發(fā)脂類、蛋白質(zhì)和核酸分子的氧化性損傷,從而導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷乃至破壞。清除ROS,就可以延長壽命。64二)染色體端粒和衰老端粒是由簡單的富含T
和G
的DNA
片段的重復(fù)序列組成。人類端粒結(jié)構(gòu)為染色體末端重復(fù)上千次的TTAGGG
序列所組成。DNA
聚合酶不能完成線性染色體末端DNA
的復(fù)制。由于RNA引物的原因,DNA聚合酶一定會留下染色體末端的一段DNA(一段端粒)使其不被復(fù)制。那么真核細(xì)胞、染色體末端的端粒就會隨著細(xì)胞分裂而縮短。這個縮短的端粒傳給子細(xì)胞后,隨著細(xì)胞的再次分裂進(jìn)一步縮短。染色體末端端粒隨著每次細(xì)胞分裂逐漸縮短,直到不能分裂走向衰老。人類種系細(xì)胞一生中維持分裂、不斷增殖的原因是該細(xì)胞表達(dá)端粒酶。65
端粒酶以自身一段RNA為模板,通過逆轉(zhuǎn)錄酶,轉(zhuǎn)錄出一段端粒片段并使之連接于染色體的端粒末端,使端粒不縮短,維持完整,從而保持了細(xì)胞的永生化生長。在單細(xì)胞生物、多細(xì)胞生物的種系細(xì)胞中都顯示出弱的端粒酶活性。而在人類正常組織的體細(xì)胞均無端粒酶活性。值得注意的是,在絕大多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞中顯示明顯的端粒酶活性,這可能是腫瘤細(xì)胞具有永生性生長的原因之一。66一
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