芽孢桿菌用于防治大口黑鱸嗜水氣單胞菌病的測(cè)試

大口黑鱸（Micropterussalmoides），又稱加州鱸，是我國重要的淡水經(jīng)濟(jì)魚類。在養(yǎng)殖過程中，嗜水氣單胞菌常誘發(fā)大口黑鱸出現(xiàn)“腸道感染、出血、潰爛”等癥狀，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)導(dǎo)致大口黑鱸出現(xiàn)大規(guī)模的死亡，帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。通常人們會(huì)使用抗生素對(duì)細(xì)菌病進(jìn)行治療。但是長期使用也促使了耐藥菌出現(xiàn)，導(dǎo)致菌群平衡失調(diào)等。益生菌在近幾年逐漸走入大眾視野。目前可以將益生菌大致分為四類，分別是乳桿菌、雙歧桿菌、芽孢桿菌、鏈球菌等。其中的芽孢桿菌是一類可以產(chǎn)生芽孢的革蘭氏陽性菌，能夠耐酸堿、高溫等惡劣條件，具備明顯的生存優(yōu)勢(shì)，芽孢桿菌產(chǎn)生的芽孢可以在胃內(nèi)酸性條件下存活，從而經(jīng)過胃到達(dá)于小腸，在其中發(fā)揮益生作用，可以有效應(yīng)對(duì)病害的發(fā)生，因此被認(rèn)為是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的潛在益生菌。本測(cè)試從大口黑鱸腸道中選擇芽孢桿菌作為拮抗嗜水氣單胞菌的益生菌，這是區(qū)別于傳統(tǒng)藥物使用的一種防治方法，具備新穎的應(yīng)用研究視角。一

測(cè)試方法本次實(shí)驗(yàn)所需的大口黑鱸樣品從廣州市番禺區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng)采集，魚體規(guī)格100~200g；指示菌種：嗜水氣單胞菌，由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院提供。首先選取10組患病塘，采集健康及患病的大口黑鱸各5組，每組采集6尾大口黑鱸，共采集60份樣本；然后取出腸道，無菌條件下置于冰盒保存。最后將部分樣品混合。委托廣東美格基因科技有限公司對(duì)樣品進(jìn)行高通量測(cè)序。分析比較健康與發(fā)病的樣本腸道菌群差異，發(fā)現(xiàn)益生菌。二

測(cè)試結(jié)果健康組與患病組的大口黑鱸的腸道內(nèi)容物中的細(xì)菌種類存在差異，其中芽孢桿菌的差異最為顯著，在健康魚腸道內(nèi)容物中芽孢桿菌屬（Bacillusspp.）豐度較高。1.細(xì)菌分離及鑒定結(jié)果經(jīng)劃線純化，共分離出6株潛在的芽孢桿菌，均為革蘭氏陽性菌，呈桿狀，長短不一。2.貝萊斯芽孢桿菌抑菌結(jié)果在大口黑鱸腸道內(nèi)分離出的6種芽孢桿菌中（如圖1），4種對(duì)嗜水氣單胞菌的生長無明顯抑制作用，1種有抑制作用但效果不明顯，1種貝萊斯芽孢桿菌的抑菌效果最為顯著。圖16株芽孢桿菌對(duì)嗜水氣單胞菌的抑菌結(jié)果3.攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果連續(xù)21d對(duì)大口黑鱸進(jìn)行飼喂實(shí)驗(yàn)，記錄每日大口黑鱸的存活情況，繪制Kaplan-Meier生存曲線，如圖2所示。圖2大口黑鱸Kaplan-Meier生存曲線（CK組：不攻毒，投喂普通飼料；A組：攻毒，投喂拌有貝萊斯芽孢桿菌發(fā)酵液的飼料；B組：攻毒，投喂普通飼料。）其中對(duì)照組（CK組）的大口黑鱸無死亡情況；對(duì)實(shí)驗(yàn)組（A組）的大口黑鱸投喂普通飼料并浸泡攻毒，累計(jì)死亡率為82.5%；對(duì)實(shí)驗(yàn)組（B組）的大口黑鱸投喂拌有貝萊斯芽孢桿菌菌液的飼料并浸泡攻毒，累計(jì)死亡率為62.5%，同A組的死亡率相比下降了20.0%；貝萊斯芽孢桿菌對(duì)大口黑鱸的保護(hù)率為24.2%。由此得出，在人工感染的過程中，將貝萊斯芽孢桿菌拌料投喂大口黑鱸可以延緩大口黑鱸的死亡，并降低大口黑鱸的死亡率。三

討論與分析1.益生菌的選擇芽孢桿菌能夠通過形成芽孢應(yīng)對(duì)惡劣環(huán)境，在水產(chǎn)動(dòng)物腸道內(nèi)存在時(shí)間較長，相較于其他益生菌能夠更大限度的發(fā)揮益生作用，符合篩選要求。結(jié)合實(shí)驗(yàn)的實(shí)際情況及高通量測(cè)序結(jié)果，最終確定將芽孢桿菌作為分離對(duì)象。此外，從腸道中分離芽孢桿菌優(yōu)于從外部水體環(huán)境直接篩選。目前使用的芽孢桿菌是經(jīng)外源添加而非魚體本身具有的，其能否穩(wěn)定存在于腸道發(fā)揮作用以及安全性尚不清楚。從腸道中分離出的芽孢桿菌，側(cè)面反映出了該種芽孢桿菌能夠在腸道中存在，并在自然情況下不會(huì)對(duì)大口黑鱸造成損害。2.高通量測(cè)序分析對(duì)健康組和患病組大口黑鱸腸道細(xì)菌展開差異性和菌群組成的分析。發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌存在于健康組大口黑鱸的腸道中，并且芽孢桿菌的相對(duì)豐度在健康組和患病組中存在明顯差異，健康大口黑鱸的腸道中存在更多數(shù)量的芽孢桿菌。由此可以推斷芽孢桿菌有可能是大口黑鱸的腸道益生菌，在延緩大口黑鱸發(fā)病中發(fā)揮作用。3.攻毒試驗(yàn)評(píng)估為更好模擬養(yǎng)殖過程，本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)采用的浸泡攻毒是慢性攻毒，同注射攻毒相比，試驗(yàn)周期較長，前期的致死效果不明顯。但浸泡攻毒9d后出現(xiàn)效果，初期大口黑鱸開始死亡，中期連續(xù)多日死亡量陡增，后期趨于平穩(wěn)，該現(xiàn)象與養(yǎng)殖過程中疫病爆發(fā)過程類似。在注射后的1d，A、B兩組均有大口黑鱸死亡。但死亡個(gè)體為群體中較小者，可能是魚體自身免疫力較低，未對(duì)菌液浸泡的環(huán)境適應(yīng)。對(duì)于整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程和結(jié)果而言，未產(chǎn)生明顯不良影響。本次體外攻毒實(shí)驗(yàn)通過模擬養(yǎng)殖環(huán)境，再次驗(yàn)證了貝萊斯芽孢桿菌的益生效果，但仍存在一些不足之處：如僅通過死亡率判斷貝萊斯芽孢桿菌所發(fā)揮作用，并未對(duì)大口黑鱸腸道微生物的數(shù)量及組成進(jìn)行再次統(tǒng)計(jì)和分析判斷。四

結(jié)果與實(shí)際意義本研究借助高通量測(cè)序分析不同健康狀況的大口黑鱸腸道微生物差異。先從患病塘口的健康大口黑鱸腸道內(nèi)篩選、分離出9株細(xì)菌；再經(jīng)菌落形態(tài)觀察、革蘭氏染色初步判定以及16SrRNA測(cè)序鑒定出6株芽孢桿菌，其中的YB-9為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillusvelezensis），對(duì)嗜水氣單胞菌的拮抗效果最為明顯。發(fā)酵培養(yǎng)后用菌液拌料連續(xù)10d飼喂大口黑鱸，發(fā)現(xiàn)該菌不會(huì)對(duì)大口黑鱸的健康造成不良影響；最后進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)生產(chǎn)指導(dǎo)意義：一是將貝萊斯芽孢桿菌添加于飼料飼喂大口黑鱸有一定的保護(hù)效果，保護(hù)率可達(dá)24.2%。二是養(yǎng)殖實(shí)際過程中應(yīng)注意要預(yù)先拌料投喂，建立起腸道益生菌的保護(hù)屏障，實(shí)現(xiàn)病害防控。因在實(shí)驗(yàn)過程中筆者發(fā)現(xiàn)浸泡感染嗜水氣單胞菌后的6-7d，實(shí)驗(yàn)組的大口黑鱸開始出現(xiàn)“吃料慢