重組基因?qū)胧荏w細(xì)胞

重組基因?qū)胧荏w細(xì)胞作為基因工程的宿主細(xì)胞必須具備以下特性：便于重組DNA分子的導(dǎo)入；能使重組DNA分子穩(wěn)定存在于細(xì)胞中；便于重組體的篩選；遺傳性穩(wěn)定高，易于擴(kuò)大培養(yǎng)或發(fā)酵生長；安全性高，無致病性，不會(huì)對(duì)外界環(huán)境造成生物污染；有利于外源基因蛋白表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的積累，或促進(jìn)外源基因的高效分泌表達(dá)。在遺傳密碼的應(yīng)用上無明顯偏倚性；具有較好的翻譯后加工機(jī)制，便于真核目的基因的高效表達(dá)；在理論研究和生產(chǎn)實(shí)踐上有較高的應(yīng)用價(jià)值。第2頁,共68頁，2024年2月25日，星期天關(guān)于細(xì)菌的感受態(tài)本質(zhì)與存在局部原生質(zhì)體化假說——細(xì)菌表面的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，即局部失去細(xì)胞壁或局部溶解細(xì)胞壁，使DNA分子能通過質(zhì)膜進(jìn)入細(xì)胞。酶受體假說——感受態(tài)細(xì)胞表面形成一種能接受DNA的酶切位點(diǎn)，使DNA分子能進(jìn)入細(xì)胞。通常制備高效轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞的方法是：在冰浴中，用一定濃度的CaCl2處理對(duì)數(shù)生長期的細(xì)菌。

CaCl2處理后的細(xì)菌一般4℃可保存48h,用于轉(zhuǎn)化，大多數(shù)能在1-2天內(nèi)具有吸收外源DNA的能力。第3頁,共68頁，2024年2月25日，星期天重組體分子導(dǎo)入受體細(xì)胞的途徑將外源重組體分子導(dǎo)入受體細(xì)胞的途包括轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、顯微注射、電穿孔等多種方式。這些途徑將隨載體種類和受體系統(tǒng)的不同而異。轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)主要適應(yīng)于細(xì)菌一類的原核細(xì)胞和酵母這樣的低等真核細(xì)胞，而顯微注射和電穿孔主要應(yīng)用于高等動(dòng)植物的真核細(xì)胞。

把帶有目的基因的重組質(zhì)粒DNA引入受體細(xì)胞的過程稱為轉(zhuǎn)化（transformation）。將重組噬菌體DNA直接引入受體細(xì)胞的過程稱為轉(zhuǎn)染（transfection）。若重組噬菌體DNA被包裝到噬菌體頭部成為有感染力的噬菌體顆粒，再以此噬菌體為運(yùn)載體，將頭部重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞中，這一過程稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）。第4頁,共68頁，2024年2月25日，星期天轉(zhuǎn)化反應(yīng)DNA分子轉(zhuǎn)化的過程如下：1.吸附——完整的雙鏈DNA分子吸附在受體菌的表面；2.轉(zhuǎn)化——雙鏈DNA分子解鏈，單鏈DNA進(jìn)入受體菌，另一鏈降解；3.自穩(wěn)——外源質(zhì)粒DNA分子在細(xì)胞內(nèi)又復(fù)制成雙鏈環(huán)狀DNA；4.表達(dá)——供體基因隨同復(fù)制子同時(shí)復(fù)制，并被轉(zhuǎn)錄、翻譯。有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，進(jìn)行轉(zhuǎn)化的是雙鏈DNA，有的則證明吸附在細(xì)胞表面的是雙鏈DNA,但是以單鏈DNA進(jìn)入細(xì)胞。至于質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化質(zhì)粒構(gòu)型的關(guān)系，認(rèn)為只有閉環(huán)DNA與開環(huán)DNA的轉(zhuǎn)化，才能獲得轉(zhuǎn)化子，而線性質(zhì)粒DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化不能得到轉(zhuǎn)化子，因?yàn)橛贸菪]合環(huán)狀和開環(huán)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌不會(huì)受到菌體酶的破壞。第5頁,共68頁，2024年2月25日，星期天基因工程中常用的受體細(xì)胞類型：原核生物細(xì)胞真核生物細(xì)胞真菌細(xì)胞植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞第6頁,共68頁，2024年2月25日，星期天一、原核生物細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)：大部分原核生物細(xì)胞無纖維素組成的堅(jiān)硬細(xì)胞壁，便于外源DNA的進(jìn)入。沒有核膜，染色體DNA沒有固定結(jié)合的蛋白質(zhì)，為外源DNA與裸露的染色體DNA重組減少了麻煩。原核生物多為單細(xì)胞生物，容易獲得一致性的實(shí)驗(yàn)材料，并且培養(yǎng)簡單，繁殖迅速，實(shí)驗(yàn)周期短，重復(fù)實(shí)驗(yàn)快?；蚪M小，遺傳背景簡單，并且不含線粒體和葉綠體基因組，便于對(duì)引入的外源基因進(jìn)行遺傳分析。第7頁,共68頁，2024年2月25日，星期天缺點(diǎn)：原核生物細(xì)胞不具備真核生物的蛋白質(zhì)折疊復(fù)性系統(tǒng)，即使真核生物基因能得到表達(dá)，得到的多是無特異性空間結(jié)構(gòu)的多肽鏈。原核生物細(xì)胞缺乏真核生物的蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)，而許多真核生物蛋白質(zhì)的生物活性正是依賴于其側(cè)鏈的糖基化或磷酸化等修飾作用。原核細(xì)胞內(nèi)源性蛋白酶易降解異源蛋白，造成表達(dá)產(chǎn)物不穩(wěn)定。第8頁,共68頁，2024年2月25日，星期天

至今被用作受體菌的原核生物有大腸桿菌、枯草桿菌、藍(lán)細(xì)菌等。(一)大腸桿菌受體細(xì)胞大腸桿菌屬革蘭氏陰性菌，它是目前為止研究得最為詳盡、應(yīng)用最為廣泛的原核生物種類之一，也是基因工程研究和應(yīng)用中發(fā)展最為完善和成熟的載體受體系統(tǒng)。優(yōu)點(diǎn)：繁殖迅速、培養(yǎng)簡便，代謝易于控制。缺點(diǎn)：大腸桿菌細(xì)胞間隙中含有大量的內(nèi)毒素，可導(dǎo)致人體熱原反應(yīng)。第9頁,共68頁，2024年2月25日，星期天(二)枯草桿菌受體細(xì)胞枯草桿菌又稱枯草芽孢桿菌，是一類革蘭氏陽性菌。優(yōu)點(diǎn)：枯草桿菌具有胞外酶分泌－調(diào)節(jié)基因，能將具有表達(dá)的產(chǎn)物高效分泌到培養(yǎng)基中，大大簡化了蛋白表達(dá)產(chǎn)物的提取和加工處理等，而且在大多數(shù)情況下，真核生物的異源重組蛋白經(jīng)枯草桿菌分泌后便具有天然的構(gòu)象和生物活性。枯草桿菌不產(chǎn)生內(nèi)毒素，無致病性，是一種安全的基因工程菌?？莶輻U菌具有芽孢形成的能力，易于保存和培養(yǎng)。枯草桿菌也具有大腸桿菌生長迅速、代謝易于調(diào)控、分子遺傳學(xué)背景清楚等優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)用：已成功的用于表達(dá)人的β干擾素、白細(xì)胞介素、乙型肝炎病毒核心抗原和動(dòng)物口蹄疫病毒VPI抗原等。第10頁,共68頁，2024年2月25日，星期天(三)藍(lán)細(xì)菌（藍(lán)藻）藍(lán)藻——又稱藍(lán)綠藻或藍(lán)細(xì)菌，它含有葉綠素a(缺乏葉綠素b)和藻膽素，具有光合系統(tǒng)Ⅰ(PSⅠ)

和光合系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)、能進(jìn)行光合作用，但它又具有細(xì)菌的特征，無細(xì)胞核及雙層膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器，染色體裸露，是一種典型的原核生物。藍(lán)藻作為表達(dá)外源基因的受體菌兼具微生物和植物的優(yōu)點(diǎn)，具體表現(xiàn)在：基因組為原核型，除了裸露的染色體DNA外，不含葉綠體DNA和線粒體DNA，遺傳背景簡單，便于基因操作和外源DNA的檢測(cè)。細(xì)胞壁屬G-，主要由肽聚糖組成，便于外源DNA的轉(zhuǎn)化。營光合自養(yǎng)生長，培養(yǎng)條件簡單，只需光、CO2、無機(jī)鹽、水和適宜的溫度就能滿足生長需要。多種藍(lán)藻含內(nèi)源質(zhì)粒，為構(gòu)建藍(lán)藻質(zhì)粒載體提供了極好的條件。藍(lán)藻富含蛋白質(zhì)，并且多數(shù)藍(lán)藻無毒，早已用作食物或保健品，在此基礎(chǔ)上采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，把一些重要藥物的基因轉(zhuǎn)入無毒藍(lán)藻，就可達(dá)到錦上添花的效果。第11頁,共68頁，2024年2月25日，星期天二、絲狀真菌受體細(xì)胞

霉菌的基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)調(diào)控機(jī)理，以及蛋白質(zhì)加工與分泌都具有真核生物的特征，利用其表達(dá)高等動(dòng)植物基因具有原核生物細(xì)胞無法比擬的優(yōu)點(diǎn)。霉菌培養(yǎng)條件簡單，可以大規(guī)模培養(yǎng)；霉菌可以分泌表達(dá)目的基因產(chǎn)物，大大簡化目標(biāo)產(chǎn)物的分離純化過程。第12頁,共68頁，2024年2月25日，星期天三、酵母菌細(xì)胞是單細(xì)胞真核微生物，外源真核基因理想的表達(dá)系統(tǒng)。優(yōu)點(diǎn)：酵母菌是結(jié)構(gòu)最為簡單的真核生物之一，其基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理比較清楚，遺傳操作相對(duì)比較簡單。具有真核生物蛋白翻譯后修飾加工系統(tǒng)。不含有特異性病毒，不產(chǎn)生毒素。培養(yǎng)簡單，利于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，成本低廉。能使外源基因表達(dá)產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中，便于產(chǎn)物的提取和加工。第13頁,共68頁，2024年2月25日，星期天四、植物受體細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)：全能性，即一個(gè)分離的活細(xì)胞在合適的培養(yǎng)條件下，較容易再分化成植株，這意味著一個(gè)獲得外源基因的體細(xì)胞可以培養(yǎng)出能穩(wěn)定遺傳的植株或品系。缺點(diǎn)：植物細(xì)胞有纖維素參與組成的堅(jiān)硬細(xì)胞壁，不利于攝取重組DNA分子?，F(xiàn)在用作轉(zhuǎn)基因受體的植物有水稻、棉花、玉米、馬鈴薯、煙草等經(jīng)濟(jì)作物和擬南芥等模式植物。

第14頁,共68頁，2024年2月25日，星期天五、動(dòng)物受體細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)：能識(shí)別和除去外源真核基因中的內(nèi)含子，剪切和加工成熟的mRNA。真核基因的表達(dá)蛋白在翻譯后能被正確加工或修飾，產(chǎn)物具有較好的蛋白質(zhì)免疫原性，約為酵母細(xì)胞的16～20倍。易被重組DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，具有遺傳穩(wěn)定性和可重復(fù)性。經(jīng)轉(zhuǎn)化的動(dòng)物細(xì)胞可將表達(dá)產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中，便于提純和加工，成本低。缺點(diǎn)：組織培養(yǎng)技術(shù)要求高，難度較大。目前用作基因轉(zhuǎn)移的受體動(dòng)物主要有豬，羊、牛、魚等經(jīng)濟(jì)動(dòng)物和鼠、猴等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，主要用途在于大規(guī)模表達(dá)生產(chǎn)天然狀態(tài)的復(fù)雜蛋白質(zhì)或動(dòng)物疫苗、動(dòng)物品種的遺傳改良及人類疾病的基因治療等。第15頁,共68頁，2024年2月25日，星期天一、重組基因?qū)朐耸荏w細(xì)胞(一)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化：重組質(zhì)粒DNA分子通過與膜蛋白結(jié)合進(jìn)入受體細(xì)胞，并在受體細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定維持和表達(dá)的過程稱之為轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化現(xiàn)象最早是由Griffith于1928年在肺炎雙球菌中發(fā)現(xiàn)的。

第二節(jié)重組DNA分子轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞第16頁,共68頁，2024年2月25日，星期天第17頁,共68頁，2024年2月25日，星期天細(xì)菌轉(zhuǎn)化的本質(zhì)是受體菌直接吸收來自供體菌的游離DNA片段，即轉(zhuǎn)化因子，并在細(xì)胞中通過遺傳交換將之組合到自身的基因組中，從而獲得供體菌的相應(yīng)遺傳性狀的過程。第18頁,共68頁，2024年2月25日，星期天轉(zhuǎn)化的辦法：用氯化鈣制備新鮮的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化法用復(fù)合劑制備感受態(tài)細(xì)胞高壓電穿孔轉(zhuǎn)化法三親本雜交接合轉(zhuǎn)化大腸桿菌第19頁,共68頁，2024年2月25日，星期天大腸桿菌是一種革蘭氏陰性菌，自然條件下很難進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其主要原因是轉(zhuǎn)化因子的吸收較為困難。在基因工程研究和應(yīng)用中，轉(zhuǎn)化受體菌細(xì)胞的是根據(jù)人們需要構(gòu)建的外源重組質(zhì)粒DNA分子，而非來自供體菌的游離DNA片段(轉(zhuǎn)化因子)。因此在大腸桿菌的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，很少采取自然轉(zhuǎn)化的方法，通常的做法是首先采用人工的方法制備感受態(tài)細(xì)胞，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)化處理，其中代表性的方法之一是Ca2+誘導(dǎo)的大腸桿菌轉(zhuǎn)化法。第20頁,共68頁，2024年2月25日，星期天Ca2+誘導(dǎo)的大腸桿菌轉(zhuǎn)化法Ca2+誘導(dǎo)DNA對(duì)大腸桿菌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化的可能原因：①在0°C的CaCl2低滲溶液中，細(xì)菌細(xì)胞發(fā)生膨脹，同時(shí)CaCl2使細(xì)胞膜磷脂層形成液晶結(jié)構(gòu)，促使細(xì)胞外膜與內(nèi)膜間隙中的部分核酸酶解離開來，誘導(dǎo)大腸桿菌形成感受態(tài)。②Ca2+能與加入的DNA分子結(jié)合，形成抗DNA酶(DNase)的羥基-磷酸鈣復(fù)合物，并黏附在細(xì)菌細(xì)胞膜的外表面上。當(dāng)42℃熱刺激短暫處理細(xì)菌細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞膜的液晶結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈擾動(dòng)，并隨之出現(xiàn)許多間隙，為DNA分子提供了進(jìn)入細(xì)胞的通道。

第21頁,共68頁，2024年2月25日，星期天用氯化鈣制備新鮮的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化法

細(xì)菌在低溫下經(jīng)CaCl2溶液處理，細(xì)菌細(xì)胞膨脹成球形，提高了膜的通透性，轉(zhuǎn)化混合物中的DNA，形成抗DNase的羧基-鈣磷酸復(fù)合物，粘附于細(xì)胞表面上，經(jīng)42℃短時(shí)間熱沖擊處理，會(huì)使受體細(xì)菌中誘導(dǎo)產(chǎn)生出一種短暫的感受態(tài)。在此期間它們能夠攝取各種不同來源的DNA，如λ噬菌體DNA或質(zhì)粒DNA等。

完全適用于大多數(shù)大腸桿菌菌株，具有簡單快速、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。每微克質(zhì)粒DNA產(chǎn)生將近107個(gè)轉(zhuǎn)化菌落，該效率可滿足常規(guī)克隆的需要。該法制備的感受態(tài)細(xì)胞可貯存于-70℃?zhèn)溆谩５?2頁,共68頁，2024年2月25日，星期天第23頁,共68頁，2024年2月25日，星期天該法重復(fù)性好。操作簡便快捷，適用于成批制備感受態(tài)細(xì)胞。對(duì)這種感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，每μg質(zhì)粒DNA可以獲得5×106～2×l07個(gè)轉(zhuǎn)化茵落，完全可以滿足質(zhì)粒的常規(guī)克隆的需要。

第24頁,共68頁，2024年2月25日，星期天用復(fù)合劑制備感受態(tài)細(xì)胞

菌株暴露于組合的二價(jià)陽離子（MnCl2和CaCl2）中更長時(shí)間，并且用氯化六氨合高鈷、DMSO、DTT（二硫蘇糖醇）等復(fù)合試劑處理細(xì)菌以提高轉(zhuǎn)化效率。高于5×108個(gè)轉(zhuǎn)化菌落。第25頁,共68頁，2024年2月25日，星期天Mg2+對(duì)DNA分子有很大的穩(wěn)定性作用，因此利用MgCl2與CaCl2共同處理大腸桿菌細(xì)胞，可以提高DNA的轉(zhuǎn)化效率。如利用二甲基亞砜(DMSO)和二硫蘇糖醇(DDT)等進(jìn)一步處理細(xì)胞，能誘導(dǎo)高頻感受態(tài)細(xì)胞的形成，轉(zhuǎn)化效率可提高100～1000倍，且對(duì)大小質(zhì)粒分子均可進(jìn)行有效的轉(zhuǎn)化。但該法要求條件高，對(duì)外界污染物極為敏感，通常很少采用。

第26頁,共68頁，2024年2月25日，星期天DNA分子進(jìn)入大腸桿菌受體細(xì)胞的機(jī)制

一般認(rèn)為只有雙鏈閉環(huán)或開環(huán)的質(zhì)粒DNA分子才能轉(zhuǎn)化，而線形DNA分子不能獲得轉(zhuǎn)化子。因此，環(huán)狀DNA分子中混雜線形DNA分子，會(huì)影響環(huán)狀DNA分子的轉(zhuǎn)化效率。也有人認(rèn)為吸附在受體細(xì)胞表面上的是雙鏈DNA，但卻以單鏈DNA進(jìn)入細(xì)胞，這與革蘭氏陽性菌的轉(zhuǎn)化過程相似。第27頁,共68頁，2024年2月25日，星期天轉(zhuǎn)化處理過程中，可能感染雜菌，導(dǎo)致假陽性轉(zhuǎn)化子的出現(xiàn)，因此須設(shè)以下幾種對(duì)照處理：DNA對(duì)照處理。轉(zhuǎn)化處理液中用0.2ml無菌水代替0.2m1感受態(tài)細(xì)胞，檢驗(yàn)DNA溶液是否染菌。感受態(tài)細(xì)胞對(duì)照處理。轉(zhuǎn)化處理液中用0.1mlNTE緩沖液(500mMNaCl,10mMTris-HCl,1mMEDTA,pH8.0)代替0.1m1DNA溶液，檢驗(yàn)感受態(tài)細(xì)胞是否染菌。感受態(tài)細(xì)胞有效性對(duì)照處理。在0.2ml感受態(tài)細(xì)胞中加入0.1ml已知容易轉(zhuǎn)化這種感受態(tài)細(xì)胞的質(zhì)粒DNA。

第28頁,共68頁，2024年2月25日，星期天電穿孔轉(zhuǎn)化法基本原理：利用高壓電脈沖作用，在大腸桿菌細(xì)胞膜上進(jìn)行電穿孔(electroporation)．形成可逆的瞬間通道，從而促進(jìn)外源DNA的有效吸收。電穿孔轉(zhuǎn)化法的效率受電場(chǎng)強(qiáng)度、電脈沖時(shí)間和外源DNA濃度等參數(shù)的影響，通過優(yōu)化這些參數(shù)，每μgDNA可以得到109－1010轉(zhuǎn)化子。研究表明，當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度和脈沖時(shí)間的組合方式導(dǎo)致50％~70％細(xì)菌死亡時(shí)，轉(zhuǎn)化水平達(dá)到最高。

第29頁,共68頁，2024年2月25日，星期天用于電穿孔轉(zhuǎn)化法的細(xì)胞處理要比感受態(tài)細(xì)胞的制備容易得多．當(dāng)細(xì)菌生長到對(duì)數(shù)中期后予以冷卻、離心，然后用低鹽緩沖液充分清洗降低細(xì)胞懸浮液的離子強(qiáng)度，并用10％甘油重懸細(xì)胞，使其細(xì)胞濃度為3×l010個(gè)／m1。分裝，在干冰上速凍后置于－70℃貯存。這樣，每小份細(xì)胞融化后即可用于轉(zhuǎn)化，有效期達(dá)6個(gè)月以上。電穿孔轉(zhuǎn)化須在低溫下(0－4℃)進(jìn)行，轉(zhuǎn)化效率要比在室溫下操作提高約100倍。

第30頁,共68頁，2024年2月25日，星期天三親本雜交接合轉(zhuǎn)化大腸桿菌簡稱為三親本雜交轉(zhuǎn)移法，是基于非接合型質(zhì)粒的遷移作用而建立的一種DNA轉(zhuǎn)化方式．適用于那些難以采用Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化法或電穿孔法轉(zhuǎn)化的受體菌。非接合型質(zhì)粒分子較小，缺少編碼質(zhì)粒轉(zhuǎn)移體系所需的全部基因，不能象接合型質(zhì)粒那樣在宿主細(xì)胞間自我轉(zhuǎn)移。但如果在宿主細(xì)胞中存在另外一種融合性的接合型質(zhì)粒（即輔助質(zhì)粒），非接合型質(zhì)粒通常也會(huì)被轉(zhuǎn)移，這種由共存的接合型質(zhì)粒引發(fā)的非接合型質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移過程稱為遷移作用。

第31頁,共68頁，2024年2月25日，星期天接合型質(zhì)粒分子較大，自我轉(zhuǎn)移的隨意性強(qiáng)，轉(zhuǎn)移過程中經(jīng)常伴隨著宿主細(xì)胞染色體的高頻轉(zhuǎn)移，因此難以作為基因工程載體使用。目前常用的質(zhì)粒載體多是在非接合型質(zhì)?；蛉笔Я私雍限D(zhuǎn)移基因的接合型質(zhì)粒的基礎(chǔ)上構(gòu)建的，故重組質(zhì)粒DNA分子也不能直接進(jìn)行接合轉(zhuǎn)化．而只能通過其遷移作用來完成。第32頁,共68頁，2024年2月25日，星期天首先將具有接合轉(zhuǎn)化功能的輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至含有重組質(zhì)粒的供體細(xì)胞中，然后將這種供體細(xì)胞與受體細(xì)胞進(jìn)行混合，促使兩者發(fā)生接合轉(zhuǎn)化作用，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體細(xì)胞。整個(gè)接合轉(zhuǎn)化過程涉及到3種有關(guān)的細(xì)菌菌株，即待轉(zhuǎn)化的受體菌、含有要轉(zhuǎn)化的重組質(zhì)粒DNA的供體菌和含有廣泛宿主的輔助質(zhì)粒的輔助菌，因此稱為三親本雜交接合轉(zhuǎn)化法。第33頁,共68頁，2024年2月25日，星期天第34頁,共68頁，2024年2月25日，星期天轉(zhuǎn)化率的計(jì)算及其影響因素

轉(zhuǎn)化率是指DNA分子轉(zhuǎn)化受體菌獲得轉(zhuǎn)化子的效率，有兩種表示方式：一是以轉(zhuǎn)化子數(shù)與用于轉(zhuǎn)化處理的DNA分子數(shù)或質(zhì)量的比率表示；二是以轉(zhuǎn)化子數(shù)與用于轉(zhuǎn)化處理的受體細(xì)胞數(shù)的比率表示。用每單位質(zhì)量的DNA分子獲得的轉(zhuǎn)化子數(shù)來表示，難以反映分子大小與轉(zhuǎn)化率之間的關(guān)系。

第35頁,共68頁，2024年2月25日，星期天以用于轉(zhuǎn)化處理的受體細(xì)胞數(shù)為基數(shù)來計(jì)算轉(zhuǎn)化率，首先必須通過菌液OD值測(cè)定或細(xì)菌計(jì)數(shù)，計(jì)算出用于制備感受態(tài)細(xì)胞的受體菌總數(shù)。然后計(jì)算轉(zhuǎn)化子與受體菌的比率。第36頁,共68頁，2024年2月25日，星期天影響轉(zhuǎn)化率的因素分子質(zhì)量較小的重組質(zhì)粒DNA分子轉(zhuǎn)化率較高，分子質(zhì)量較大的重組質(zhì)粒DNA分子轉(zhuǎn)化率較低，對(duì)于大于30kb的重組質(zhì)粒則很難進(jìn)行轉(zhuǎn)化。組成重組DNA分子的載體類型及其構(gòu)型。與受體細(xì)胞親和性較強(qiáng)的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化率要高于親和性較弱的質(zhì)粒載體，而處于自然雙螺旋閉環(huán)結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒載體比開環(huán)結(jié)構(gòu)或線性結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒載體有更高的轉(zhuǎn)化率。經(jīng)體外酶切、酶連操作后的載體DNA或重組DNA分子由于空間構(gòu)象難以恢復(fù)，轉(zhuǎn)化率一般要比具有超螺旋結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒低兩個(gè)數(shù)量級(jí)。重組DNA分子的濃度和純度。在10ng／100μ1以下的DNA濃度范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)化效率與DNA分子數(shù)成正比關(guān)系。

第37頁,共68頁，2024年2月25日，星期天同一重組質(zhì)粒DNA分子轉(zhuǎn)化不同的受體菌細(xì)胞，轉(zhuǎn)化率不同——受體細(xì)胞的選擇對(duì)于重組DNA分子的轉(zhuǎn)化也是極為重要。前述三種轉(zhuǎn)化方法中，最佳轉(zhuǎn)化率以電穿孔法最高（108~1010/μg）；Ca2+誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化法居中（107~108/

μg

）；而三親本雜交轉(zhuǎn)移法最低（104~105/μg

），但它適于前兩種方法難以轉(zhuǎn)化的受體菌。

第38頁,共68頁，2024年2月25日，星期天在轉(zhuǎn)化操作方而，受體細(xì)胞的預(yù)處理或感受態(tài)細(xì)胞的制備對(duì)轉(zhuǎn)化率影響最大。如Ca2+誘導(dǎo)大腸桿菌轉(zhuǎn)化法，菌齡、CaCl2處理時(shí)間、感受態(tài)細(xì)胞的保存期以及熱激時(shí)間均是重要的影響因素。電穿孔轉(zhuǎn)化法中，對(duì)受體細(xì)胞進(jìn)行冰凍甘油預(yù)處理后的轉(zhuǎn)化率，要比不經(jīng)此預(yù)處理的轉(zhuǎn)化率高10~100倍。

第39頁,共68頁，2024年2月25日，星期天(二)重組λ噬菌體DNA分子轉(zhuǎn)導(dǎo)大腸桿菌

將重組λ噬菌體DNA分子導(dǎo)入大腸桿菌受體細(xì)胞的常規(guī)方法是轉(zhuǎn)導(dǎo)操作。轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)是指通過λ噬菌體(病毒)顆粒感染宿主細(xì)胞的途徑把外源DNA分子轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞內(nèi)的過程。

第40頁,共68頁，2024年2月25日，星期天具有感染能力的λ噬菌體顆粒除含有λ噬菌體DNA分子外，還包括外被蛋白。以噬菌體顆粒感染受體細(xì)胞，首先必須對(duì)重組A噬菌體DNA分子進(jìn)行體外包裝。體外包裝，是指在體外模擬λ噬菌體DNA分子在受體細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的一系列特殊的包裝反應(yīng)過程，將重組λ噬菌體DNA分子包裝為成熟的具有感染能力的λ噬菌體顆粒的技術(shù)。

第41頁,共68頁，2024年2月25日，星期天基本原理，根據(jù)λ噬菌體DNA體內(nèi)包裝的途徑，分別獲得缺失D包裝蛋白的λ噬菌體突變株和缺失E包裝蛋白的λ噬菌體突變株。這兩種突變株均不能單獨(dú)地包裝λ噬菌體DNA，但將它們分別感染大腸桿菌，從中提取缺失D蛋白的包裝物（含E蛋白)和缺失E蛋白的包裝物(含D蛋白)，兩者混合后就能包裝λ噬菌體DNA。

第42頁,共68頁，2024年2月25日，星期天λ噬菌體DNA體外包裝的主要過程①制備包裝物。首先，須培養(yǎng)兩種溶原菌第二，誘導(dǎo)溶菌生長第三，收集和貯存包裝物。②體外包裝。制備λ噬菌體DNA混合液。第一次包裝。包裝物剛?cè)诨瘯r(shí)，細(xì)胞發(fā)生破裂，釋放出包裝物可立即用于包裝。第二次包裝。進(jìn)行第二次包裝，可提高包裝效率2－5倍，加入蛋白酶可降低包裝反應(yīng)液的黏度，便于包裝反應(yīng)的進(jìn)行。去除細(xì)胞屑。第二次包裝后，在反應(yīng)液中加入SM溶液和氯仿，混勻后離心去除碎屑。上清液中含活的噬菌體顆粒。第43頁,共68頁，2024年2月25日，星期天經(jīng)過體外包裝的噬菌體顆?？梢愿腥具m當(dāng)?shù)氖荏w菌細(xì)胞，并將重組λ噬菌體DNA分子高效導(dǎo)入細(xì)胞中。在良好的體外包裝反應(yīng)條件下，每μg野生型的λ噬菌體DNA可形成108～109的pfu。對(duì)于重組的λ噬菌體DNA，包裝后的成斑率要比野生型的有所下降，但仍可達(dá)到106～107pfu，完全可以滿足構(gòu)建真核基因組基因文庫的要求。第44頁,共68頁，2024年2月25日，星期天(三)轉(zhuǎn)染將重組λ噬菌體DNA分子直接導(dǎo)入受體細(xì)胞中的過程，稱為轉(zhuǎn)染，類似于質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。完整的、未處理過的λ噬菌體DNA分子的轉(zhuǎn)染效率僅為105~106，而處理過的重組λ噬菌體DNA分子的轉(zhuǎn)染效率下降到只有103~104。噬菌體的轉(zhuǎn)染在基因克隆實(shí)驗(yàn)中并不常用。第45頁,共68頁，2024年2月25日，星期天二、受體細(xì)胞的選擇

野生型的大腸桿菌不是理想的受體細(xì)胞，因?yàn)樽陨砭哂械南拗坪托揎椣到y(tǒng)，另外還可能存在潛在的致病性。因此必須通過適當(dāng)?shù)恼T變手段對(duì)野生型大腸桿菌進(jìn)行遺傳性狀改造，以獲得適宜作為受體細(xì)胞的突變菌株。通常應(yīng)從以下幾個(gè)方面加以考慮：第46頁,共68頁，2024年2月25日，星期天①限制與修飾系統(tǒng)這是導(dǎo)致外源重組DNA轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低下的主要原因之一。應(yīng)選用限制系統(tǒng)缺陷型的突變菌株作為受體細(xì)胞，以提高外源DNA分子的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。進(jìn)一步使修飾系統(tǒng)也發(fā)生缺陷，則受體菌細(xì)胞既不能修飾，也不能限制外源DNA分子，更便于重組DNA分子的多種基因操作。

第47頁,共68頁，2024年2月25日，星期天②重組系統(tǒng)

進(jìn)入野生型細(xì)胞的外源DNA分子能自發(fā)地與染色體DNA發(fā)生的體內(nèi)同源重組反應(yīng)由rec基因家族的編碼產(chǎn)物所控制。RecA蛋白能促進(jìn)DNA分子之間的同源聯(lián)會(huì)和DNA單鏈交換，recA基因的突變使大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的遺傳重組頻率降低至10-6。recB、recC和recD基因的突變也可以降低遺傳重組的發(fā)生頻率。因此受體細(xì)胞必須選擇體內(nèi)同源重組缺陷型的遺傳表型，基因型為recA-、recB-或recC-等，有些大腸桿菌突變體菌株則將三個(gè)基因同時(shí)失活。

第48頁,共68頁，2024年2月25日，星期天③易于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)可以利用遺傳誘變技術(shù)改變受體菌細(xì)胞壁的通透性及細(xì)胞膜的特異吸附性，從而提高其轉(zhuǎn)化效率。還可以選擇能夠誘導(dǎo)形成感受態(tài)細(xì)胞的菌株作為受體菌細(xì)胞．第49頁,共68頁，2024年2月25日，星期天④有明顯的選擇性差異遺傳表型差異大，可便于重組子的檢測(cè)。通常是使受體細(xì)胞呈現(xiàn)與載體所攜帶的選擇標(biāo)記互補(bǔ)的遺傳性狀。如在大腸桿菌系統(tǒng)中，重組質(zhì)粒載體上多含有Amp抗性標(biāo)記基因，則所選用的受體細(xì)胞應(yīng)對(duì)這種抗生素敏感。當(dāng)重組DNA分子轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞后，載體上的標(biāo)記基因賦予受體細(xì)胞抗生素的抗性特征，據(jù)此可以區(qū)分轉(zhuǎn)化子與非轉(zhuǎn)化子。如果受體細(xì)胞具有與外源基因表達(dá)產(chǎn)物活性互補(bǔ)的遺傳特征，可以直接篩選到外源基因表達(dá)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。

第50頁,共68頁，2024年2月25日，星期天⑤感染寄生缺陷型從安全的角度上考慮，受體細(xì)胞不能具有感染寄生性。第51頁,共68頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)重組子的篩選將攝取外源DNA分子并能使該分子在其中穩(wěn)定維持的受體細(xì)胞統(tǒng)稱為克隆子。把采用各種轉(zhuǎn)化方法或轉(zhuǎn)導(dǎo)方法獲得的克隆子叫做轉(zhuǎn)化子（導(dǎo)入外源DNA分子后能穩(wěn)定存在的受體細(xì)胞稱為轉(zhuǎn)化子），現(xiàn)在這兩者有通用的趨向。含有重組DNA分子的克隆子被稱為重組子，如果重組子中含有外源目的基因則又稱為陽性克隆子或期望重組子

。第52頁,共68頁，2024年2月25日，星期天在重組DNA分子的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，一般僅有少數(shù)受體細(xì)胞成為克隆子。必須采用合適的方法從大量的細(xì)胞背景中篩選出期待的克隆子。經(jīng)過各種方法將外源DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞后，獲得所需陽性克隆子的過程稱為克隆子的篩選。

第53頁,共68頁，2024年2月25日，星期天一、遺傳表型直接篩選(一)根據(jù)載體選擇標(biāo)記初步篩選轉(zhuǎn)化子在構(gòu)建基因工程載體系統(tǒng)時(shí)，通常在載體DNA分子中組裝了一種或兩種選擇標(biāo)記基因，在受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，呈現(xiàn)出特殊的表型或遺傳學(xué)特性，作為篩選轉(zhuǎn)化子的依據(jù)。第54頁,共68頁，2024年2月25日，星期天

一般的做法是將轉(zhuǎn)化處理后的受體細(xì)胞接種在合適量選擇藥物的培養(yǎng)基上，在最適生長溫度條件下培養(yǎng)一定時(shí)間，根據(jù)菌落生長情況挑選出轉(zhuǎn)化子。常用的選擇標(biāo)記基因主要是抗性基因以及表達(dá)產(chǎn)物可以發(fā)光或使反應(yīng)底物顯色的基因，相應(yīng)的選擇條件是可以被抗性基因產(chǎn)物分解的抗生素和除草劑，可以使基因產(chǎn)物發(fā)光的光線，或者是可以使基因產(chǎn)物顯色的試劑。選擇培養(yǎng)基是根據(jù)宿主細(xì)胞類型配置的培養(yǎng)基，對(duì)于細(xì)菌受體細(xì)胞而言，通常用LB培養(yǎng)基，在LB培養(yǎng)基中加入適量的某種選擇物．即為選擇培養(yǎng)基。選擇物是由載體DNA分子上攜帶的選擇標(biāo)記基因所決定。第55頁,共68頁，2024年2月25日，星期天（1）抗藥性篩選第56頁,共68頁，2024年2月25日，星期天

當(dāng)帶有完整抗藥性基因的載體轉(zhuǎn)化無抗藥性細(xì)胞后，凡轉(zhuǎn)入載體的細(xì)胞都獲得了抗藥性，能在含有相應(yīng)藥物的瓊脂平板上生長成菌落，而未被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞不能生長。

第57頁,共68頁，2024年2月25日，星期天根據(jù)載體抗藥性標(biāo)志插入失活選擇

含有兩個(gè)以上的抗藥基因的載體，外源DNA片段插入其中一個(gè)基因，并導(dǎo)致這個(gè)基因的失活，就可用兩個(gè)含不同藥物的平板，互相對(duì)照，篩選含重組DNA的菌落，這就是插入失活效應(yīng)。（2）插入失活篩選法第58頁,共68頁，2024年2月25日，星期天第59頁,共68頁，2024年2月25日，星期天第60頁,共68頁，2024年2月2