藥品檢驗(yàn)用菌種的傳代和保藏

藥品檢驗(yàn)用菌種的傳代和保藏菌種的定義及其與各應(yīng)用領(lǐng)域的關(guān)系菌種泛指從自然界獲取的各種微生物的不同的種。醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究菌種主要考慮其致病機(jī)理工業(yè)生產(chǎn)研究菌種主要考慮其發(fā)酵機(jī)理藥品微生物檢驗(yàn)主要考慮其標(biāo)準(zhǔn)性

第2頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天標(biāo)準(zhǔn)菌種的概念及其管理標(biāo)準(zhǔn)菌種是指由國(guó)家授權(quán)機(jī)構(gòu)制備的具有穩(wěn)定的生物學(xué)特性并用妥善方法保藏的菌種。我國(guó)的標(biāo)準(zhǔn)菌種統(tǒng)一由中國(guó)菌種保藏管理委員會(huì)（CCCCM）管理，涉及藥品微生物檢驗(yàn)的菌種由醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心（CMCC）提供第3頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天標(biāo)準(zhǔn)菌種的保藏形式我國(guó)提供的標(biāo)準(zhǔn)菌種通常是以凍干粉的形式包裝于熔封的厚玻璃容器中。在這種容器中，微生物通常與賦形劑共存，由于缺乏生長(zhǎng)必須的環(huán)境條件，一般呈休眠狀態(tài)。第4頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天純培養(yǎng)所謂微生物的純培養(yǎng)是指在一個(gè)微生物的菌落形成單位中，所有的微生物細(xì)胞或孢子都屬于生物學(xué)的同一個(gè)種。嚴(yán)格地說(shuō)，純培養(yǎng)是在培養(yǎng)基上由一個(gè)細(xì)胞或孢子分裂、繁殖而產(chǎn)生的后代。在該細(xì)胞或孢子的生長(zhǎng)過(guò)程種，不受其他微生物的侵犯，不會(huì)在培養(yǎng)物中產(chǎn)生另外微生物種的后代，在整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中不發(fā)生變異或死亡。

第5頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天獲取純培養(yǎng)的工作環(huán)境1、潔凈工作室：環(huán)境潔凈度10000級(jí)下的局部100級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi)，全過(guò)程必須無(wú)菌操作，防止微生物污染。2、無(wú)菌隔離艙第6頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天獲取純培養(yǎng)的接種工具1、接種環(huán)2、接種針3、接種鏟4、接種鉤5、其他玻璃器械第7頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天獲取純培養(yǎng)的其他器具1、玻璃器皿：如各種規(guī)格培養(yǎng)皿。2、微生物實(shí)驗(yàn)室常用的設(shè)備，如高壓滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱等第8頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天獲取純培養(yǎng)的主要技術(shù)－移植（又稱接種）微生物的移植（或稱接種）是指將微生物接種在培養(yǎng)基上的操作。第9頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天移植（又稱接種）的兩種方式－劃線和穿刺1、劃線法是指用接種工具將微生物細(xì)胞移植在固體培養(yǎng)基斜面或平板上的一種方法。2、穿刺法是指用接種工具將微生物細(xì)胞移植到固體或半固體培養(yǎng)基內(nèi)的一種方法。

第10頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天影響集菌培養(yǎng)效果的若干因素溫度滲透壓氧氣光pH值和氧化還原電位培養(yǎng)基抗生素第11頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天驗(yàn)證純培養(yǎng)的主要依據(jù)1、用顯微鏡觀察時(shí)，全部的生物個(gè)體是相似的，如果是細(xì)菌，對(duì)革蘭氏染色反應(yīng)應(yīng)當(dāng)是一致的。2、將培養(yǎng)物制成懸液，重新傾注平板，或平板劃線培養(yǎng)后，所形成的全部菌落的形態(tài)應(yīng)該是相似的。如果是細(xì)菌，將重新形成的菌落各作穿刺培養(yǎng)，其培養(yǎng)特征應(yīng)當(dāng)是一致的。3、從重新分離的各菌落作生理特征觀測(cè)時(shí)，如對(duì)氮源的利用，對(duì)糖類的發(fā)酵或同化以及其他生理生化的測(cè)定，應(yīng)呈現(xiàn)出一致性。

第12頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天定期移植保藏法一般步驟為：將菌種接種在所要求的培養(yǎng)基上，置最適溫度下集菌培養(yǎng)。得到健壯的菌體（如有性孢子、無(wú)性孢子或細(xì)胞等）后，放于溫度較低、干燥處保藏，并且每隔一定時(shí)間重新移植培養(yǎng)一次。

第13頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天定期移植保藏法1、細(xì)菌置4～6℃保藏，芽孢桿菌每3～6個(gè)月移植一次，其他細(xì)菌每月移植一次。

2、放線菌于4～6℃保藏，每3個(gè)月移植一次。

3、酵母菌于4～6℃保藏，每4～6個(gè)月移植一次。

4、絲狀真菌于4～6℃保藏，每3個(gè)月移植一次。

5、擔(dān)子菌于4～6℃保藏，每3個(gè)月移植一次。6、保藏的濕度通常在50％～70％為宜。

第14頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天定期移植保藏法1、需定期檢查2、移植進(jìn)行時(shí)，應(yīng)仔細(xì)核對(duì)3、集菌培養(yǎng)完成后，應(yīng)比較培養(yǎng)特征4、應(yīng)注意觀察各代之間的變化第15頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天瓊脂斜面低溫保藏法1、菌種的典型菌落接種至斜面，規(guī)定的溫度和時(shí)間培養(yǎng)，充分生長(zhǎng)，硅膠塞換成無(wú)菌橡膠塞。4～6℃冰箱保藏a:1～3個(gè)月移植一次，繼續(xù)保藏。b:用半固體高層培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)，可保藏半年至一年。第16頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天瓊脂斜面低溫保藏法適用細(xì)菌、霉菌、酵母菌及放線菌保藏優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、大多數(shù)微生物適用缺點(diǎn)：保藏期短；傳代次數(shù)多；容易發(fā)生變異及污染。生孢梭菌用硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基、乙型溶血性鏈球菌及肺炎球菌用血肉湯（瓊脂）培養(yǎng)基第17頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天液體石蠟保藏法一般步驟為：準(zhǔn)備液體石蠟并滅菌去水備用。獲得需要保藏菌種的純培養(yǎng)，將液體石蠟注入培養(yǎng)容器中，并完全覆蓋培養(yǎng)基。液體石蠟液面以高出培養(yǎng)基上端0.5～1cm為宜

4～6℃冰箱保藏第18頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天液體石蠟保藏法確保保藏環(huán)境的干燥，避免長(zhǎng)霉。使用此法保藏的菌種時(shí)應(yīng)特別注意防止微生物外濺污染。該法對(duì)酵母菌的保藏最為有效，對(duì)大多數(shù)細(xì)菌保藏效果一般。第19頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天甘油冷凍保藏法將保藏菌種接種瓊脂斜面上，適宜溫度下培養(yǎng)適宜時(shí)間，用無(wú)菌接種環(huán)輕輕刮取菌苔，并通過(guò)接種環(huán)與試管壁之間的輕輕摩擦使菌種充分?jǐn)U散到無(wú)菌水中，調(diào)證菌液濃度，向已制備好的菌懸液加入等體積的20％無(wú)菌甘油，輕輕振試管管，使內(nèi)容物充分混合，分裝于無(wú)菌小管。甘油冷凍管最好在-30℃貯存。第20頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天沙管保藏法制備沙管培養(yǎng)接種制備菌懸液混菌干燥保藏適合保藏芽孢桿菌、梭菌、放線菌和一些絲狀真菌。

第21頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天土壤保藏法用土壤替代沙管保藏法中的河沙，其余操作與沙管保藏法相同適合保藏土壤細(xì)菌、放線菌和絲狀真菌，時(shí)間為2～6年。

第22頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天硅膠保藏法用硅膠替代沙管保藏法中的河沙，其余操作與沙管保藏法相同適合保藏酵母菌和某些絲狀真菌

第23頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天濾紙保藏法保藏微生物細(xì)胞或孢子的載體為濾紙。對(duì)細(xì)菌、酵母菌、絲狀真菌等都有一定的效果，有些菌種最長(zhǎng)可達(dá)17年。第24頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天明膠片保藏法制備無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)明膠制備無(wú)菌石蠟濾紙微生物培養(yǎng)并制成濃厚的懸液在懸液中加入營(yíng)養(yǎng)明膠將含微生物細(xì)胞或孢子的營(yíng)養(yǎng)明膠滴于石蠟濾紙表面干燥將形成的明膠片密封保藏第25頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天麩皮保藏法我國(guó)歷史悠久的微生物保藏法適于保藏根霉、曲霉、青霉、紅曲霉等屬和赤霉菌

第26頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天梭氏真空干燥保藏法在小試管中放置菌懸液小試管在大試管中放置大試管在真空狀態(tài)下干燥密封大試管第27頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天液體直接干燥保藏法需要加入保護(hù)劑干燥之前不需凍結(jié)在干燥過(guò)程中為增大蒸發(fā)面積，可加入多孔材料干燥后的容器應(yīng)熔封第28頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天蒸餾水保藏法最為簡(jiǎn)便的微生物保藏法微生物細(xì)胞或孢子保藏在蒸餾水中保藏的容器應(yīng)密封適于保藏棒狀桿菌、土壤桿菌和假單孢菌等

第29頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天液氮冰箱超低溫保藏法需專用設(shè)備－液氮超低溫冰箱菌懸液密封于安瓿管內(nèi)，控速凍結(jié)國(guó)外已普遍采用保藏時(shí)間長(zhǎng)第30頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天凍結(jié)真空干燥保藏法歷史悠久，又稱凍干法不產(chǎn)生孢子只產(chǎn)生菌絲體的絲狀真菌不宜采用該法適用面廣保藏時(shí)間可達(dá)10年以上多為菌種保藏機(jī)構(gòu)采用第31頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天凍結(jié)真空干燥保藏法密封性好，可避免保藏期間的污染保藏容器體積小，方便攜帶和貯藏保藏時(shí)間更長(zhǎng)，變異概率更低第32頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天普通微生物實(shí)驗(yàn)室適用的保藏技術(shù)瓊脂斜面低溫保藏法液體石蠟保藏法低溫冷凍保藏法甘油冷凍保藏法第33頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天瓊脂斜面低溫保藏法細(xì)菌置4～6℃保藏，芽孢桿菌每3～6個(gè)月移植一次，其他細(xì)菌每月移植一次。

放線菌于4～6℃保藏，每3個(gè)月移植一次。

酵母菌于4～6℃保藏，每4～6個(gè)月移植一次。

絲狀真菌于4～6℃保藏，每4個(gè)月移植一次。

擔(dān)子菌于4～6℃保藏，每3個(gè)月移植一次。保藏的濕度通常在50％～70％為宜。

第34頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天菌種保藏的一般規(guī)定1、菌種“代”的確定：2005版藥典規(guī)定，以干燥菌種管為第“0”代，由此得到的第一批子代為第一代，以此類推。2、菌種傳代次數(shù)規(guī)定：2005版藥典規(guī)定不超過(guò)5代。3、菌種應(yīng)專人保藏、專柜貯藏，認(rèn)真做好登記，統(tǒng)一編號(hào)，按期傳代，并做好有關(guān)檢驗(yàn)記錄。4、保存菌種傳代或凍干均應(yīng)填寫(xiě)專用記錄，菌種管上應(yīng)有標(biāo)簽，表明菌種編號(hào)、代次、批號(hào)、日期。5、過(guò)期菌種應(yīng)及時(shí)處理、登記，經(jīng)121℃30分鐘滅菌消毒。第35頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天實(shí)驗(yàn)室菌種傳代操作步驟1、接種前用1：1000新潔爾滅擦拭工作臺(tái)面，然后開(kāi)紫外燈消毒30分鐘。2、自冰箱取出保存工作用菌種，室溫放置20分鐘；溫度平衡后才能傳代。3、實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)入緩沖間，換鞋、穿無(wú)菌衣、戴口罩，用1：1000新潔爾滅溶液消毒雙手，并將培養(yǎng)基及菌種移入陽(yáng)性菌接種室。4、點(diǎn)燃酒精燈，將菌種管塞子，通過(guò)火焰轉(zhuǎn)動(dòng)使稍稍松動(dòng)，以免接種時(shí)粘著打不開(kāi)。5、接種操作：左手拿住菌種管，將管口靠近火焰旁，右手拿接種棒，將白金耳燒紅約30秒，桿部通過(guò)火焰滅菌。挑取少量菌苔；另取，照上述方法在火焰旁打開(kāi)塞子，將白金耳伸入管內(nèi)斜面培養(yǎng)基的底部，從下到上將白金耳輕貼斜面培養(yǎng)基的表面作曲折移動(dòng)。5、接種后，將斜面置規(guī)定溫度、時(shí)間培養(yǎng)。取出觀察，菌種生長(zhǎng)良好，換橡皮塞，貼上標(biāo)簽，放入冰箱保存。6、細(xì)菌一個(gè)月傳代一次，枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉可三個(gè)月傳代一次。第36頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天菌種管理1、標(biāo)準(zhǔn)菌種必須從認(rèn)可的菌種收集途經(jīng)獲得；實(shí)驗(yàn)室必須建立和保存所有菌種的收集、貯藏、保存、確認(rèn)試驗(yàn)的記錄。2、實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有文件管理標(biāo)準(zhǔn)菌種（從原始菌種到工作用菌種）。該程序應(yīng)包括：a:標(biāo)準(zhǔn)菌種必須定期傳代，并做確認(rèn)試驗(yàn)，包括實(shí)驗(yàn)室在所需要關(guān)鍵診斷指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)室必須記錄并保存。b：每一子菌種都應(yīng)以適當(dāng)標(biāo)簽、標(biāo)記來(lái)表示名稱、標(biāo)準(zhǔn)號(hào)、接種日期和傳代日期。C:每一子菌種都應(yīng)以標(biāo)記從原始菌種傳代到工作用菌種的代數(shù)；記錄菌種生長(zhǎng)的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件；菌種生存條件等。第37頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天過(guò)期菌種處理過(guò)期菌種應(yīng)及時(shí)清理、登記，并經(jīng)121℃、30分鐘高壓消毒滅菌。第38頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天例1：金黃色葡萄球菌傳代保藏技術(shù)1、購(gòu)置金黃色葡萄球菌（如我所提供的菌種為第二代菌種），假定購(gòu)置日期為5月21日。2、準(zhǔn)備10支營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面，其中2支用于保藏，其余8支用于當(dāng)月實(shí)驗(yàn)。3、于5月22日打開(kāi)菌種管，接種菌種至上述10支斜面，35℃培養(yǎng)16～18小時(shí)。4、將10支第三代菌種管做好標(biāo)簽，置適宜溫度保藏。5、5月22日至6月22日，可以使用上述第三代菌種管。6、至6月22日，重復(fù)步驟2，得第四代菌種管。7、至8月22日前，重新購(gòu)置原種管。第39頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天例2：黑曲霉的傳代技術(shù)1、制備孢子懸液：取滅菌水或生理鹽水3～5ml，分2～3次小心滴加至菌種管內(nèi)（試管斜面），反復(fù)振搖。傾取孢子懸液置另一滅菌試管。2、涂布接種：用滅菌滴管吸取懸液滴加至改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基斜面，每管滴加2～3滴，轉(zhuǎn)動(dòng)試管，使懸液與斜面表面充分接觸第40頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天菌種確認(rèn)試驗(yàn)包括以下幾個(gè)方面：1、菌落生長(zhǎng)情況：目測(cè)2、染色鏡檢：3、生化試驗(yàn)；(1)糖醇代謝試驗(yàn)（2）氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗(yàn)（3）碳源和氮源利用試驗(yàn)（4）酶類試驗(yàn)（5）其他試驗(yàn)第41頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天短小芽孢桿菌確認(rèn)該菌未發(fā)生變異的主要方法為：1、通過(guò)顯微鑒別，為不呈鏈狀排列的桿菌，革蘭氏染色為陽(yáng)性。2、營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上菌苔光滑，薄，閃光，蔓延，不粘著，常常是淺黃色。

3、生化試驗(yàn)可選做明膠穿刺、淀粉水解和硝酸鹽還原，結(jié)果為明膠緩慢液化，淀粉水解陰性，硝酸鹽還原陰性。第42頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天枯草芽孢桿菌確認(rèn)該菌未發(fā)生變異的主要方法為：1、通過(guò)顯微鑒別，為呈鏈狀排列的桿菌，不形成莢膜，革蘭氏染色為陽(yáng)性。2、營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上菌苔生長(zhǎng)豐厚，粗糙，不透明，不閃光，蠟質(zhì)，蔓延，奶油色至微褐色。3、生化試驗(yàn)可選做明膠穿刺、淀粉水解和硝酸鹽還原，結(jié)果明膠呈漏斗形至層狀液化，淀粉水解陽(yáng)性，硝酸鹽還原陽(yáng)性。第43頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天大腸埃希菌確認(rèn)該菌未發(fā)生變異的主要方法為：1、通過(guò)顯微鑒別，為成對(duì)和呈短鏈排列的近球形的桿菌，一般不形成莢膜，革蘭氏染色為陰性。2、營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上菌苔通常白色，有時(shí)帶黃白色，濕潤(rùn)，閃光，蔓延生長(zhǎng)。3、生化試驗(yàn)可選做明膠穿刺和靛基質(zhì)試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、V.P.試驗(yàn)和檸檬酸鹽利用試驗(yàn)，結(jié)果不液化明膠，靛基質(zhì)試驗(yàn)和甲基紅試驗(yàn)陽(yáng)性，V.P.和檸檬酸鹽利用試驗(yàn)陰性。第44頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天大腸埃希菌該菌為微生物限度檢查規(guī)定不得檢出的控制菌，有一整套完整的鑒定手段，也可參考該方法用于判斷所保藏的菌種有無(wú)發(fā)生變異。該鑒定方法主要內(nèi)容即為經(jīng)典的IMViC試驗(yàn)，結(jié)果為++--。第45頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天銅綠假單孢菌確認(rèn)該菌未發(fā)生變異的主要方法為：1、通過(guò)顯微鑒別，為單個(gè)，成對(duì)或呈短鏈排列的桿菌，有運(yùn)動(dòng)性，革蘭氏染色為陰性。2、營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上菌苔生長(zhǎng)旺盛，薄，白色，閃光，培養(yǎng)基變?yōu)榫G色至暗褐色或黑色，發(fā)熒光。3、生化試驗(yàn)可選做明膠穿刺、吲哚和硝酸鹽還原試驗(yàn)，結(jié)果迅速液化明膠，液體呈淺黃綠色或淺藍(lán)綠色，吲哚試驗(yàn)陰性，硝酸鹽還原試驗(yàn)陽(yáng)性。第46頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月25日，星期天銅綠假單孢菌該菌為微生物限度檢查規(guī)定不得檢出的控制菌，可利用氧化酶試驗(yàn)和綠膿菌素試驗(yàn)迅速判斷所保藏的菌種有無(wú)發(fā)生變異。第47頁(yè),共52頁(yè)，2024年2月