生物理學學士畢業(yè)論文(木蹄層孔菌Lac的酶學性質(zhì)研究)

II木蹄層孔菌Lac的酶學性質(zhì)研究摘要本文對木蹄層孔菌漆酶的酶學性質(zhì)進行了研究。結果如下：以ABTS作為底物，酶反應的最適溫度為50℃；最適pH值為3；在40°C以下保持酶活力相對穩(wěn)定，50°C酶活性基本全部喪失；在pH值3.5~4范圍內(nèi)保持相對較高的酶活力。10mM/L的Ba2+、Ca2+、Co+、Fe3+、Na+、K+這六個金屬離子對漆酶酶活有較強的抑制作用，其中Fe3+的抑制作用最強，而Mg2+，Cu2+對兩種漆酶均有激活作用。以ABTS為底物時，漆酶的Km值為0.05mmol/L。關鍵詞：木蹄層孔菌，漆酶，酶學性質(zhì)

ENZYMATICPROPERTIESSTUDYOFtinderfungusLACCASEABSTRACTInthispaper,thetinderfungusenzymologypropertiesoflaccasewerestudied.Resultsareasfollows:toABTSassubstrate,theenzymereactionoftheoptimumtemperatureis50℃;TheoptimalpHvalueis3;Enzymeactivitystabilizationareunder40°C,basicallloseenzymeactivityunder50°C;WithinthescopeofthepHvalueof3.5~4remainedrelativelyhighenzymeactivity.10mm/LCo+,Ca2+,Ba2+,Fe3+,Na+,K+thesixmetalionsonlaccaseenzymeactivityhadastrongerinhibitoryeffect,oneofthestrongestinhibitoryeffectofFe3+,andMg2+,Cu2+effectontwokindsoflaccaseareactivated.ABTSassubstrates,laccaseKmvaluetendencyfor0.05LKeywords:tinderfungus，laccase，enzymaticproperties

目錄第1章緒論 11.1木蹄層孔菌國內(nèi)外研究進展 11.2漆酶國內(nèi)外研究進展 11.2.1漆酶理化性質(zhì) 21.2.2漆酶的應用 3第2章材料和方法 42.1實驗材料與儀器 42.1.1菌種 42.1.2實驗材料、試劑 42.1.3實驗儀器 52.2實驗方法 52.2.1木蹄層孔菌的培養(yǎng) 52.2.2粗酶液的制備 62.2.3漆酶酶學性質(zhì) 62.2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析 7第3章結果與分析 83.1最適反應pH值及pH穩(wěn)定性 83.2最適溫度及熱穩(wěn)定性 93.3金屬離子及抑制劑對漆酶活性的影響 103.4Km 11第4章討論 12致謝 12參考文獻 12第13頁共14頁第1章緒論1.1木蹄層孔菌國內(nèi)外研究進展木蹄層孔菌(Fomesfomentarius(L.:Fr.)Kick.)是一種多孔菌科的高等藥用真菌，是世界性分布的木腐性真菌[1]。它們生長在北美洲及歐洲的樺木屬及水青岡屬。單一顆樹上就可以有多個子實體。木蹄層孔菌并不能食用，由于其擔子果可以陰燃幾個小時，故可以用來點火。子實體大至巨大，馬蹄形，無柄。多呈灰色，灰褐、淺褐色至黑色，有一層厚的角質(zhì)皮殼及明顯環(huán)帶和環(huán)梭，邊緣鈍。菌管多層，軟木栓質(zhì)，多年生，生于櫟、樺、楊、柳、椴、榆、水曲柳、梨、李、蘋果等闊葉樹干上或木樁上。子實體和菌絲體中都含有許多具有生物活性的物質(zhì)，代表物質(zhì)就是木蹄多糖[3、4]。往往在生境陰濕或較黑暗的生境出現(xiàn)棒狀畸形子實體。分布于我國香港、廣東、廣西、云南、貴州、河南、陜西、四川、湖南、湖北、山西、河北、內(nèi)蒙古、甘肅、吉林、遼寧、黑龍江、西藏、新疆等地區(qū)[2]。在18世紀和19世紀，木蹄層孔菌曾被用來作為止血的膏藥，在一些傳統(tǒng)的藥典中被用來作為針灸的工具[5]。在中國和亞洲其他許多國家，木蹄子實體水煎服廣泛用于治療食管癌、胃癌、口腔潰瘍、腸胃失調(diào)、發(fā)炎和各種感冒等疾病[6-7]。國內(nèi)外對木蹄的研究結果表明，木蹄具有顯著抑制腫瘤細胞生長、增強機體免疫功能和抗氧化等功效。目前，對木蹄層孔菌的研究主要是對其甲醇、乙醇、乙酸乙酯、氯仿、石油醚、正丁醇的提取物的抗腫瘤活性進行研究[5]。有學者對木蹄層孔菌子實體化學成分做研究表明其含有酚、有機酸、苷類等[8]。研究表明其子實體和菌絲體中都含有許多具有生物活性的物質(zhì)，其中的多糖具有抗腫瘤和免疫刺激活性。1.2漆酶國內(nèi)外研究進展漆酶即多酚氧化酶，是一種藍色多銅氧化酶家族的糖蛋白氧化酶，它利用分子氧作為氧化劑，氧化木質(zhì)素中酚型單元成為酚氧游離基，同時還原分子氧生成水。在ABTS存在時，能氧化木質(zhì)素中的非酚型單元，并且其催化過程不需要H2O2參與，因此它在催化木質(zhì)素降解時有一定的優(yōu)越性[9]。漆酶按來源可分為漆樹漆酶、真菌漆酶和細菌漆酶，其中以真菌漆酶為主。在產(chǎn)漆酶的真菌中最重要的是擔子菌中的白腐菌。白腐真菌漆酶通常以多重基因編碼的同工酶形式出現(xiàn)，有來源廣泛、單電子氧化還原電位高、可以催化降解多環(huán)芳烴類物質(zhì)等特點[10]。由于漆酶底物的廣泛和人們對漆酶介質(zhì)的不斷研究，漆酶的商業(yè)用途也越來越廣泛。目前漆酶的研究主要集中于對漆酶的酶學性質(zhì)研究，酶活測定，發(fā)酵條件研究這方面，已有利用漆酶降解木材中的木質(zhì)素、生產(chǎn)酒精和利用漆酶區(qū)分嗎啡和可卡因的先例[11]。1.2.1漆酶理化性質(zhì)漆酶催化反應機理漆酶的作用底物具有廣泛性，但對氧具有專一性。漆酶催化苯酚類芳香胺等物質(zhì)的整個催化過程大致包括：酶分子對底物的作用、電子在酶分子中的傳遞、氧分子對酶分子的還原。就酚類化合物和芳香胺類化合物而言，漆酶利用氧分子作為電子受體，從被氧化的底物分子中，通過單電子提取方式從多酚類化合物的o-位和p-位的-OH和芳胺中去除一個H原子，形成自由基，該自由基不穩(wěn)定，進一步發(fā)生聚合或解聚反應，引起重排、二聚、烷基-芳基斷裂、芐醇氧化、側鏈和芳環(huán)的斷裂或生成醌等一系列的非酶促反應。在氧的存在下，還原態(tài)漆酶被氧化，氧分子被還原為水。漆酶催化不同類型底物氧化反應的機理主要表現(xiàn)在兩方面：一方面是底物自由基中間體的生成。在這一過程中，漆酶從被氧化的底物分子中提取一個電子，使之形成自由基，該自由基不穩(wěn)定，可進一步發(fā)生聚合或解聚反應。在O2存在下，還原態(tài)漆酶被氧化，O2被還原為水。另一方面，漆酶催化底物氧化和對O2的還原是通過四個銅離子協(xié)同傳遞電子和價態(tài)變化來實現(xiàn)的。漆酶催化4個連續(xù)的單電子轉(zhuǎn)移氧化還原性底物，將分子氧還原為水。還原性底物結合于T1cu位點，T1Cu從中提取1個電子，該電子通過Cys-His途徑傳遞到T2/T3Cu三核中心位點，該位點結合了第二底物分子氧，接受T1Cu的電子，并傳遞給氧，使之還原為水[12]。漆酶底物的專一性漆酶的作用底物具有較大的廣譜性，初步統(tǒng)計，漆酶催化氧化不同類型的底物已達250個，而且還有增加的趨勢，底物結構大致可歸納如下[l2]：酚類及其衍生物:如2，6—二甲氧基酚，愈創(chuàng)木酚等。這一類底物最容易被氧化；芳胺及其衍生物：如鄰聯(lián)茴香胺。這類化合物結構與酚類相似，比較容易被氧化；羧酸及其衍生物：如咖啡酸，阿魏酸等，也可以被氧化；一些人工合成的化合物：如ABTS等非酚類化合物也可以作為漆酶的底物；金屬有機化合物：這類底物主要有二茂鐵類化合物；其它化合物:這類底物主要包括苯環(huán)上連有輕基、烷氧基、氨基、氯代化合物及多環(huán)、稠環(huán)化合物、雜環(huán)化合物等。1.2.2漆酶的應用漆酶作為一種高效，綠色的催化劑，隨著固定化技術的不斷發(fā)展，擴大了漆酶的工業(yè)應用范圍和前景，固定化酶在廢水處理，生物傳感器，食品行業(yè)方面中有著重要的應用價值。廢水處理的應用造紙工藝中需要去除木質(zhì)素，傳統(tǒng)高溫蒸煮去除木質(zhì)素的紙漿得率低且污染環(huán)境，而漆酶能選擇性地催化木質(zhì)素降解的這個特性可用于紙漿生產(chǎn)，減少環(huán)境污染，杜絕廢水。這是漆酶最有前景的應用[13]。漆酶還可用作紙漿的生物漂白。漆酶來源廣泛、使用方便，降解木質(zhì)素效率高，固定化后能更有效的發(fā)揮作用。目前，漆酶介導系統(tǒng)己經(jīng)得到了實際應用[12]。食品工業(yè)中的應用在飲料方面的應用：除去啤酒和果汁等飲料原料中的酚，提高啤酒質(zhì)量和透明度。另外，漆酶還在食品分子的交聯(lián)、改善生面團的性質(zhì)、增加醬油風味、去除食品異味等工藝中發(fā)揮著重要作用。在食用菌和藥用菌方面的應用：在食用菌制種過程中加入漆酶制劑能加速木質(zhì)素的分解，能為菌絲提供更豐富的養(yǎng)料，加快菌絲吃料，縮短培養(yǎng)時間。利用這種方法培養(yǎng)木耳、香菇等將有益于節(jié)約成本和擴大生產(chǎn)規(guī)模[14]。環(huán)境保護中的應用去除氯酚類有機化合物：很多研究表明，漆酶具有轉(zhuǎn)化酚型底物的能力，其中包括氯酚、甲基酚、甲氧基酚等。在底物聚合過程中，有氯離子從溶液中被釋放出來，這表明漆酶具有去除氯酚化合物毒性的作用。染料降解：在印染和造紙等工業(yè)過程中，大量含有染料的廢水釋放，成為當今主要的環(huán)境問題之一。白腐菌漆酶具有廣泛的底物專一性，可以氧化芳香環(huán)化合物，對紡織染料的脫色及降解效果明顯。生物檢測中的應用漆酶在催化過程中消耗氧氣，這一過程很容易被轉(zhuǎn)化為電信號而高靈敏地得到檢測。在免疫檢測中，漆酶有望替代辣根過氧化物酶成為新的標記酶，因為它有如下幾個優(yōu)點：氧氣作為第二底物，不形成非產(chǎn)物型的酶-底復合物；相比于過氧化物酶，漆酶對介質(zhì)中不同價態(tài)的金屬離子濃度的敏感性較低無需特殊的儀器和試劑。同時由于漆酶能夠催化多種酚類物質(zhì)生成酚類化合物，固定化漆酶電極作為生物傳感器在酚類物質(zhì)的檢測中應用廣泛[15]。第2章材料和方法2.1實驗材料與儀器2.1.1菌種木蹄層孔菌（東北林業(yè)大學遺傳學實驗室提供）2.1.2實驗材料、試劑馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂、麥麩、玉米、木屑、可溶性淀粉、麥芽糖、酵母汁、蛋白胨、牛肉膏、ABTS(1mM)、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH3）、75%的酒精.表2-1微量溶液的配制藥品含量/LMgSo43gMnSo40.5gNacl1gFeSo4.7H2o0.1gCacl20.1gZnSo4.7H2o0.1gCuSo40.1gKal(So4)2.12H2o10mgNaMoO4.2H2o10mg次氮基三乙酸酯（NTA）1.5g表2-2液體培養(yǎng)基配制藥品含量/L白樺木屑1酒石酸銨0.KH2PO42MgSO40.5CaCl20.琥珀酸（二）甲酯10mM(1.3ml)微量元素70ml硫胺素（VB1）1mg2.1.3實驗儀器紫外可見分光光度計、恒溫箱、烘箱、高壓濕熱滅菌鍋、干熱鼓風超凈臺、可調(diào)控溫度搖床、冰箱、刀、鍋、電磁爐、打孔器、鑷子、三角瓶、燒杯、容量瓶、棕色試劑瓶、移液槍、離心管、高速冷凍離心機、離心機、磁力攪拌器、酸度計。2.2實驗方法2.2.1木蹄層孔菌的培養(yǎng)PDA培養(yǎng)基在燒杯中加入300ml蒸餾水，將土豆去皮切成5mm的小方塊。去除掉蟲蛀和壞的，稱取200g土豆料放入紗布中包好，再講紗布放入燒杯中，將燒杯置于沸水中煮30min，拿出燒杯，將紗布擠干，再稱取葡萄糖20g加入土豆湯中，用蒸餾水定容至1L，加入適當瓊脂（20g左右），用封口膜封口備用。活化菌種在微波爐中溶解土豆培養(yǎng)基，移入超凈工作臺，將培養(yǎng)基分裝在滅菌的培養(yǎng)皿中，等其形成固體后，再分別接上菌種。接菌完成后，用封口膜封好連接口，移入恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，溫度設定為28，在無光條件下培養(yǎng)10天，每天觀察菌的生長情況。配制液體培養(yǎng)基，接菌培養(yǎng)配制液體培養(yǎng)基（表2-2），將配制好的液體培養(yǎng)基平均分配到100ml三角瓶中，每瓶中加入15ml培養(yǎng)基。在超凈工作臺上將活化好的菌種接到液體培養(yǎng)基中，每瓶培養(yǎng)液中用打孔器打入3個菌餅進行培養(yǎng)，為測酶活做準備。2.2.2粗酶液的制備取培養(yǎng)10天的培養(yǎng)物4.5ml，分別加入3個1.5ml的離心管中，20°C，12000r/min，離心20min，棄沉淀，取上清液，此即為測酶活所用的粗酶液。2.2.3漆酶酶學性質(zhì)在大離心管中依次加入100mM的酒石酸鈉（pH4.0）300μL，1mM的ABTS1.5mL，蒸餾水700μL，酶液預熱后取500μL加入到離心管中混勻，轉(zhuǎn)移到比色皿中在420nm波長下進行吸光光度值的測定，計算酶活。不同溫度對漆酶的影響和漆酶的熱穩(wěn)定性最適酶活溫度：將酶和pH的緩沖溶液、ABTS、蒸餾水分別在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃的溫度下預熱3min后混合測酶活，共9個處理，每個處理3個重復，取平均值做曲線圖，找出木蹄層孔菌漆酶的最適酶活溫度。最佳耐受溫度：將酶和pH的緩沖溶液、ABTS、蒸餾水分別在20℃、30℃、40℃、50℃下進行預熱，共4個處理，每個處理3個重復，各處理1h，處理完畢迅速放入冰里，混合然后在30℃測酶活。其中20、30、40三組設定24h的對照。不同pH對漆酶的影響和漆酶的pH穩(wěn)定性最適pH：將酶液分別和pH值1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0的緩沖溶液、ABTS、蒸餾水分別在30℃預熱10min，混合測酶活，共8個處理，每個處理3個重復，測量三組酶活數(shù)據(jù)取平均值做曲線圖，找出木蹄層孔菌漆酶酶活最大時候的最適pH值。pH耐受：將酶液分別和pH為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、6.0的緩沖溶液、ABTS、蒸餾水30℃水浴1h后混合測酶活，共9個處理，每個處理3個重復，其中3.5、4.0、5.0三組設定24h的對照，溫度為4，測量三組酶活數(shù)據(jù)取平均值做曲線圖，找出木蹄層孔菌漆酶pH不同金屬離子對漆酶的影響除了底物外，反應體系（100mM酒石酸鈉300μl、1mMABTS1.5ml、酶液500μl、H2O685μl/550μl、0.2M金屬離子和抑制劑15μl（1mM）/150μl（10mM））混合在30°C預熱10min后混合測酶活。15μl（1mM）金屬離子和抑制劑加685μl蒸餾水，150μl（10mM）金屬離子和抑制劑加550μl蒸餾水，以酶液事先滅活后的反應混合液為對照，測定各金屬離子對漆酶酶活力的影響。漆酶酶促動力學Km即酶促反應達到最大半反應速率時的底物濃度。在最適pH和最適溫度下，測定lac在不同濃度ABTS時的酶活。做出lac的酶促動力學曲線，計算酶活。2.2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析根據(jù)查證，漆酶酶活的計算公式如下[16]：酶的活性單位u/L=△A/Min×（106÷ε）×（TV÷SV）和u/L=△A/Min×（103÷mε）×（TV÷SV）。酶的活性單位式中，△A／min為每分鐘吸光度（A）凈增或凈減的數(shù)值；ε為摩爾消光系數(shù)；mε為毫摩爾消光系數(shù)；TV為反應液的總體積（ml）；SV為樣品的體積（ml）。3ml反應體系中稀釋后的酶液為0.5ml，100mM的檸檬酸緩沖液(pH3)為300ul，1mM的ABTS溶液1.5ml，蒸餾水700ul。于420nm處測定其吸光光度值，酶液最后加加完后立即測定，測定漆酶與底物反應1min的吸光度。以同體積的蒸餾水為對照組。已知420nm處ABTS摩爾消光系數(shù)ε420=3.6×104L/(mol·cm)

第3章結果與分析3.1最適反應pH值及pH穩(wěn)定性圖3-1體系pH值對酶活力的影響圖3-2酶的pH穩(wěn)定性在相同溫度下，漆酶相對酶活隨pH的變化如圖3-1所示，漆酶的最適反應pH值為3。漆酶的pH耐受如圖3-2所示。當pH低于2的時候，漆酶的酶活極低；處理1h時，pH為3.5和4時酶活都較高，處理24h后酶活仍能保持在60.30%~63.42%。處理1h時，當pH大于4，酶活降級較快。故在pH為4的時候，漆酶的酶活最穩(wěn)定。3.2最適溫度及熱穩(wěn)定性圖3-3溫度對酶活力的影響圖3-4酶的熱穩(wěn)定性如圖3-3所示，在反應溫度為50°C的時候，酶活最高，故酶的反應最適溫度為50°C。在相同pH下，漆酶溫度的耐受性見圖3-4。處理1h時，30°C酶活力最高，20°C次之，而40°C酶活損失一半多，50°C基本喪失。處理24h時，20°C漆酶耐受性最好，同時發(fā)現(xiàn)處理1h和處理24h的漆酶酶活相差很小。因此可知該酶熱穩(wěn)定性較差，溫度低于40°C還較穩(wěn)定，高于50°C就基本失活。3.3金屬離子及抑制劑對漆酶活性的影響表3-1激活劑和抑制劑對漆酶活力影響抑制劑種類不同濃度抑制劑（mmol/L）作用下的相對活力（%）110EDTA103.4692.23DDT1.771.38NaN31.561.28圖3—5金屬離子對酶活影響如圖3—5所示，10mM/L的ba2+、ca2+、co+、fe3+、na+、k+這六個金屬離子對漆酶酶活的抑制作用都很強，其中fe3+對漆酶酶活的抑制作用最強，Cu2+、zn2+、mn2+、mg2+對漆酶酶活的抑制作用一般。1mM/L時，fe3+的抑制作用最弱。激活劑和抑制劑對酶活影響如表3—1所示，10mM/LDDT、EDTA、NaN3均對漆酶的酶活性有著抑制作用，其中NaN3的抑制作用最強。1mM/LEDTA對酶活有激活作用。3.4Km圖3—6漆酶圖3—7米—曼氏方程雙倒數(shù)圖由圖3—6得出，當ABTS的濃度為0.35mM/L時，漆酶的吸光度數(shù)值為最高。此時酶活為213.36u/L。根據(jù)圖3—7雙倒數(shù)圖公式，計算得Km=0.05mmol/L。第4章討論白腐真菌木蹄層孔菌漆酶酶活的溫度和pH耐受實驗表明，木蹄層孔菌產(chǎn)漆酶的最佳培養(yǎng)溫度為20°C，溫度過高則會引起漆酶減產(chǎn)，超過50°C漆酶酶活喪失。漆酶在溫度為50°C的時候酶活最高，但時間久了酶活會逐漸喪失。故測定漆酶酶活最佳溫度為50°C。隨著溫度的升高，漆酶的酶活下降很快，所以持續(xù)的高溫會嚴重影響漆酶的酶活性。對漆酶pH的耐受和最適反應實驗表明，當反應體系的pH為3的時候，漆酶的酶活最高。當培養(yǎng)體系的pH為3.5的時候，漆酶的酶活最穩(wěn)定。隨著pH的波動，酶活的衰減并不嚴重，所以pH對漆酶酶活的影響系數(shù)不大。10種不同的金屬離子對兩種漆酶的活性影響表明：10mM/L的ba2+、ca2+、co+、fe3+、na+、k+這六個金屬離子對漆酶酶活的抑制作用都很強，Cu2+、zn2+、mn2+、mg2+對漆酶酶活的抑制作用一般，其中fe3+對漆酶酶活的抑制作用最強，這可能是因為它占據(jù)了底物與酶的結合位點(酶的活性中心)，改變了酶的構象，從而使酶活性受到了明顯的抑制.由于這6種離子對漆酶的活性中心均有毒害作用，在應用漆酶時應避免在溶液中加入這6種離子。1mM/L時，fe3+的抑制作用最弱。，而Mg2+，Cu2+對兩種漆酶均有激活作用，這與Mg2+是很多氧化還原酶的催化激活劑的特性比較一致，而漆酶也是一種氧化還原酶;Cu2+對漆酶有激活作用與Cu2+是漆酶的一個活性中心，也是漆酶分子的一個重要組成成分的特點一致。致謝本文是在導師尚潔講師悉心指導下完成的。尚潔老師平易近人，指導認真負責，經(jīng)常在實驗室親自指導我的實驗，解答各種疑問。實驗雖然簡單，但其中數(shù)據(jù)的獲取耗費了大量的時間，總共跨度達到三個月，在此期間尚潔老師一直給我們指導，幫我們答疑解惑，才使得我們的實驗能順利完成。畢業(yè)論文定稿前尚潔老師每次修改都認真負責，小到標點符號的錯誤，大到文章的整體布局和數(shù)據(jù)的處理，她都會提出需要改進的地方。在此對尚潔老師的悉心指導表示衷心的感謝！參考文獻[1]程東升.兩類木蹄層孔菌在酶蛋白水平上的遺傳分化[J].苗物系統(tǒng),2