TLR4 在腦出血繼發(fā)性損傷中腦水腫形成的

TLR4在腦出血繼發(fā)性損傷中腦水腫形成的炎性機(jī)制研究

實(shí)驗(yàn)背景及意義腦出血后繼發(fā)性損傷腦水腫形成是多種機(jī)制的綜合結(jié)果，其中炎性損傷機(jī)制備受矚目[3,4]，各種炎性細(xì)胞的激活，細(xì)胞因子、炎性遞質(zhì)的釋放，共同造成或加重繼發(fā)性腦損傷[5]。研究表明炎性反應(yīng)與腦水腫有著密切聯(lián)系：炎性反應(yīng)是腦水腫形成的重要原因[6,7]。目前在炎癥免疫反應(yīng)的研究領(lǐng)域里，Toll樣受體家族（Toll-likeReceptors,TLRs）是眾多學(xué)者的關(guān)注熱點(diǎn)，其屬于跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體家族，通過感知病原微生物存在，轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的炎性信號，參與多細(xì)胞生命體古老的防御機(jī)制，是連接先天免疫和特異性免疫的紐帶。TLR4參與腦缺血再灌注損傷已被實(shí)驗(yàn)所證[16,17,18]，TLR4激活炎性反應(yīng)是缺血性卒中后腦水腫形成的重要環(huán)節(jié)。Cao等[16]采用大鼠大腦中動脈線栓模型,研究發(fā)現(xiàn)腦缺血6h再灌注24h后,無論是腦水腫程度、腦梗死體積,還是神經(jīng)元損傷程度,TLR4缺陷的小鼠都明顯低于野生型,并且TNF-α和IL-6水平降低,認(rèn)為腦缺血再灌注后TLR4缺陷的小鼠可能通過抑制炎性細(xì)胞的激活,下調(diào)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生來減少炎癥反應(yīng),從而減輕損傷程度。其實(shí)腦出血后血腫周圍也存在缺血現(xiàn)象[19]，出血性卒中與缺血性卒中的損傷機(jī)制在某種程度上有著共性。但TLR4是否參與腦出血后繼發(fā)性損傷,是否通過介導(dǎo)炎性機(jī)制在腦水腫形成的病理生理演變過程中發(fā)揮作用,至今尚不清楚。水通道蛋白4(Aquaporin4,AQP4)是焦點(diǎn)，作為一種與水通透有關(guān)的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，影響水跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境平衡。在正常腦組織中主要分布于鄰近毛細(xì)血管壁的星形膠質(zhì)細(xì)胞足突上和腦室周圍的室管膜細(xì)胞，成為水在細(xì)胞、血管和腦室移動的關(guān)鍵部位[20]。星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤中AQP4表達(dá)明顯上調(diào),并與腦水腫程度、血腦屏障的開放有顯著的相關(guān)性[21]。多種腦水腫實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ途@示AQP4在腦水腫的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色[22，23]。實(shí)驗(yàn)表明：炎性反應(yīng)可上調(diào)AQP4的表達(dá)。在過敏原和IL-13誘導(dǎo)的哮喘小鼠模型中[24],炎性反應(yīng)顯著，基底膜側(cè)的AQP4表達(dá)上調(diào)是特征性的改變。AQP4在實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎模型的腦皮質(zhì)和脊髓中表達(dá)也上調(diào)[25],提示AQP4可能與急性期炎癥的發(fā)展相關(guān)。張新宇等[26]通過在大鼠腦內(nèi)微量注射炎性因子TNF-α后，發(fā)現(xiàn)早期就可出現(xiàn)腦水腫，并測得AQP4明顯上調(diào)、血腦屏障通透性顯著增加，且二者成顯著正相關(guān)。因此，炎性因子誘發(fā)腦水腫的機(jī)制可能是：通過多種途徑破壞血腦屏障，繼而誘導(dǎo)AQP4表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步加重腦水腫，形成惡性循環(huán)。進(jìn)而推測：TLR4作為炎性信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)受體，激活下游強(qiáng)有力的炎性級聯(lián)反應(yīng)，介導(dǎo)炎性損傷,極有可能也通過誘導(dǎo)AQP4表達(dá)上調(diào),參與腦水腫形成。但目前，國內(nèi)外缺乏此方面的研究。實(shí)驗(yàn)研究內(nèi)容本課題采用大鼠尾狀核立體定向注射自體血模型，研究TLR4是否通過介導(dǎo)炎性反應(yīng)，上調(diào)AQP4表達(dá)參與腦出血后腦水腫形成，探索TLR4在腦出血繼發(fā)性損傷中腦水腫形成的炎性機(jī)制。具體內(nèi)容：1、從基因分子水平，研究時間演變過程中TLR4mRNA、TNF-αmRNA表達(dá)與AQP4mRNA表達(dá)、腦出血后腦水腫程度的相關(guān)性。2、并與蛋白、細(xì)胞水平結(jié)合，研究腦出血損傷后TLR4、TNF-α與AQP4在時空上的變化及聯(lián)系。實(shí)驗(yàn)方法3腦含水量的測定：取每只大鼠右側(cè)大腦半球穿刺點(diǎn)前半部的腦組織分別稱重(濕重)，然后置入100℃恒溫烤箱中，24h后取出再稱重(干重)。以(濕重－干重)／濕重×100％計(jì)算腦含水量，以此代表腦水腫的程度。4免疫組化法檢測冠狀腦切片TLR4、TNF-α、AQP4蛋白水平及對腦組織行RT-PCR分析TLR4、TNF-α、AQP4。實(shí)驗(yàn)可行性分析實(shí)驗(yàn)可行性分析實(shí)驗(yàn)預(yù)期結(jié)果1腦出血后TLR4作為炎性信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)受體，激活下游強(qiáng)有力的炎性級聯(lián)反應(yīng)，通過誘導(dǎo)AQP4表達(dá)上調(diào),參與腦水