GB-T微生物高通量適應(yīng)性進(jìn)化測定 微流控芯片法征求意見稿編制說明

一、任務(wù)來源

本國家標(biāo)準(zhǔn)的制定任務(wù)列入國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會2018年第三批國家標(biāo)準(zhǔn)制修訂計

劃，項目編號“20182191-T-424”。該標(biāo)準(zhǔn)由中國標(biāo)準(zhǔn)化研究院提出并歸口，由清華大學(xué)

等單位承擔(dān)該標(biāo)準(zhǔn)的制定任務(wù)。

二、標(biāo)準(zhǔn)制定目的和意義

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了用微流控芯片法進(jìn)行微生物高通量適應(yīng)性進(jìn)化的的原理、試劑材料、儀

器設(shè)備、操作步驟和結(jié)果分析方法。通過逐漸自動添加化學(xué)因子梯度完成菌種適應(yīng)性進(jìn)化

實驗。通過自動測量菌種生長曲線情況，對大腸桿菌、釀酒酵母、畢赤酵母、甲基扭托桿

菌、谷氨酸棒狀桿菌等微生物進(jìn)行高通量篩，從而打造一個便捷、快速、精準(zhǔn)、高效的微

生物實驗平臺。

隨著微生物生產(chǎn)規(guī)模和產(chǎn)品品種不斷增加，成為現(xiàn)代醫(yī)藥、生物、食品、環(huán)境、化工、

農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域的重要生產(chǎn)方式。優(yōu)質(zhì)的工業(yè)菌株是微生物生產(chǎn)的靈魂和命脈，盡管現(xiàn)代生物

技術(shù)在基因工程和代謝工程領(lǐng)域內(nèi)的長足進(jìn)展，通過誘發(fā)變異、基因重組和培養(yǎng)能夠得到

高產(chǎn)菌株。然而這是一個復(fù)雜的生化過程，除了微生物的本身性能，還與外界條件和菌株

狀態(tài)等諸多因素密切相關(guān)，具有高度的非線性、時變性和復(fù)雜性。如何能快速有效篩選出

特定目標(biāo)表型的高質(zhì)量微生物仍然是微生物工業(yè)領(lǐng)域的瓶頸問題之一，因此對微生物進(jìn)行

高通量適應(yīng)性進(jìn)化日益受到重視。

微生物培養(yǎng)通常以搖瓶、多孔板、深孔板等容器為主，并配合搖床使用等操作。尤其

在此過程中，人力依賴嚴(yán)重、過程繁瑣復(fù)雜、污染風(fēng)險大。而用微流控芯片法進(jìn)行微生物

高通量適應(yīng)性進(jìn)化是基于液滴微流控技術(shù)研發(fā)而成的一款微生物培養(yǎng)系統(tǒng)。具有高通量、

自動傳代、化學(xué)因子梯度添加、在線檢測液滴光譜、微生物分選等功能。能充分保證微生

物生長過程中的溶氧、混合和質(zhì)能交換等需求，通過光譜檢測指標(biāo)對微液滴內(nèi)的微生物可

進(jìn)行傳代、多梯度化學(xué)因子添加等種操作，能實現(xiàn)菌種生長曲線測定、自動傳代、梯度化

學(xué)因子添加觀察細(xì)菌耐藥性狀況、通過逐漸增加化學(xué)因子梯度以完成菌種適應(yīng)性進(jìn)化實驗

等，旨在為不同工業(yè)微生物菌株提供生長曲線和適應(yīng)性進(jìn)化的高通量方法。

三、標(biāo)準(zhǔn)制定原則

（一）標(biāo)準(zhǔn)編制原則

1

本標(biāo)準(zhǔn)以現(xiàn)有國內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范為基礎(chǔ)，與現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)相銜接，主要

對用微流控芯片法進(jìn)行微生物高通量適應(yīng)性進(jìn)化的標(biāo)準(zhǔn)方法和流程進(jìn)行規(guī)范，選擇既不影

響微生物生長，又能自動化的檢測的條件指標(biāo)，旨在為不同工業(yè)微生物菌株提供一個統(tǒng)一、

通用的生長曲線和適應(yīng)性進(jìn)化方法。

（二）標(biāo)準(zhǔn)制訂主要依據(jù)

1、標(biāo)準(zhǔn)編寫遵循GB1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則》

的有關(guān)要求。

2、標(biāo)準(zhǔn)編寫內(nèi)容參考的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，包括：

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法。

GB/T27990-2011生物芯片基本術(shù)語。

GB/T14926.43-2001實驗動物細(xì)菌學(xué)檢測染色法、培養(yǎng)基和試劑

3、法律、法規(guī)及文件

《中華人民共和國標(biāo)準(zhǔn)化法》

《中華人民共和國標(biāo)準(zhǔn)化法實施條例》

《國家標(biāo)準(zhǔn)化體系建設(shè)發(fā)展規(guī)劃（2016—2020年）》

《深化標(biāo)準(zhǔn)化工作改革方案》

四、標(biāo)準(zhǔn)主要技術(shù)內(nèi)容

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了恒化培養(yǎng)芯片、微流控恒化培養(yǎng)平臺原理及搭建方法；微生物高通量適

應(yīng)性進(jìn)化儀器設(shè)備及器具、主要試劑、操作步驟和結(jié)果分析。

主要技術(shù)：

微流控技術(shù)（Microfluidic）：是一種在微米量級的微小通道中精確控制和操控微尺

度流體的技術(shù)。其構(gòu)建于面積為平方厘米級的芯片上，在尺度為幾十到幾百微米的通道和

構(gòu)件中承載體積為納升、皮升甚至更小的流體。

微液滴技術(shù)（Mircodroplets）：通過加入適量表面活性劑，一種液體可以以極小的微

滴的形式分散在另一與之不相溶的液體中，形成高度分散的熱力學(xué)穩(wěn)定體系。微滴的形成

類似于乳化現(xiàn)象。根據(jù)分散相和流動相的不同，微滴可分為兩種：W/O型即以油相為連續(xù)

相、水相為分散相的油包水型微滴和與之相對的O/W型微滴。

五、主要工作過程

1、成立標(biāo)準(zhǔn)起草工作組

2

《微生物高通量適應(yīng)性進(jìn)化——基于微流控芯片方法》項目組與2016年接到編制任

務(wù)。隨即制定出了工作程序和工作計劃。2016年下半年開始征集參與標(biāo)準(zhǔn)的單位，其中參

與驗證試驗的有清華大學(xué)、上海交通大學(xué)、天津科技大學(xué)、江南大學(xué)。

2、調(diào)查研究工作

在制定標(biāo)準(zhǔn)的過程中，我們查閱了大量國內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，對標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了分析匯總，在

國內(nèi)還未發(fā)現(xiàn)有相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)出現(xiàn)。

3、編寫過程說明

研究了GB/T6682《分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法》、GB/T27990-2011《生物芯片

基本術(shù)語》。了解了微流控培養(yǎng)的相關(guān)要求，同時收集查閱了相關(guān)資料。為了使編制的標(biāo)

準(zhǔn)能更好的適用微生物高通量定向進(jìn)化-篩選的應(yīng)用，同時有效地促進(jìn)微生物培養(yǎng)效率的

提高，在2016年10月提出了標(biāo)準(zhǔn)討論提綱，確定了編制原則和主要內(nèi)容。該標(biāo)準(zhǔn)于2017

年10月在全國標(biāo)準(zhǔn)信息公共服務(wù)平臺上進(jìn)行公示，于2018年2月召開專家會，聽取專家

意見。

六、方法驗證及結(jié)果

方法驗證1：微生物連續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)微流控平臺

方法驗證1.1：微生物連續(xù)培養(yǎng)芯片

驗證過程：芯片兩端設(shè)計Y型通道，利用水、油兩相在Y型通道交叉處的剪切力作用

可生成油包水的液滴。芯片上通道需足夠長，以實現(xiàn)在芯片上多個液滴的往復(fù)運(yùn)動即菌體

的高通量培養(yǎng)，可通過設(shè)計彎曲的管道實現(xiàn)。芯片中部設(shè)計約1cm長的檢測區(qū)域，兩邊留

出插入光纖及光源的孔槽，便于實時檢測液滴內(nèi)菌體濃度。芯片中部分別設(shè)計十字型通道

和T字型通道，同時留出灌錫的凹槽，以實現(xiàn)液滴的分割和介電融合。為便于控制其長度

以滿足實驗要求，可使用PLC控制器控制水相和油相的電磁閥交替開啟并循環(huán)，通過改變

電磁閥開啟和關(guān)閉的時間，可以任意控制兩相的長度。芯片有11個外接口，6個連泵，其

中1，3,5直接連泵；2,4,6連液壓瓶再連泵。4個對稱連兩套約1.5m長管路，為主培養(yǎng)

通道。1個連電磁閥，為系統(tǒng)總出口。芯片主通路從1號泵出發(fā)到1號長管路再到2號長

管路，最后到3號泵，左右往復(fù)。示意圖如圖1示。

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圖1.MMC芯片連接示意圖

方法驗證1.2：液滴生成

驗證過程：在3號蠕動泵（即通路口）連接B口。如圖2所示利用蠕動泵將液相推動

經(jīng)過十字型通道，從垂直方向的通道注入油相，可將液滴進(jìn)行分割（該過程可用PLC控制

器控制，實現(xiàn)液滴的定量分割）。生成的液滴繼續(xù)往復(fù)運(yùn)動，實現(xiàn)液滴內(nèi)菌體的恒化培養(yǎng)

和適應(yīng)性進(jìn)化。

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圖2.液滴生成示意圖

方法驗證2：生長檢測

驗證過程：檢測區(qū)域兩端分別接有光纖光譜儀的光源光纖與接收光纖。當(dāng)液滴往復(fù)運(yùn)

動以經(jīng)過檢測區(qū)域時會吸收掉部分光纖光譜儀光源發(fā)出的光，剩余光進(jìn)入檢測光纖后根據(jù)

標(biāo)定的空白樣品吸收光強(qiáng)度計算出該微滴的吸光度數(shù)值并實時反饋到電腦的軟件上，根據(jù)

波長600nm處微滴的吸光度可折算出微滴內(nèi)菌體的濃度。光纖光譜儀采集數(shù)據(jù)的頻率可調(diào)，

可選取同一平臺3-5個誤差為±0.001的數(shù)據(jù)點(diǎn)并取平均值作為該水相液滴的吸光度數(shù)值。

圖3.生長檢測示意圖

方法驗證3：生長曲線測定

5

驗證材料：大腸桿菌E.coliMG1655，E.coliS17-GFP，變異的大腸桿菌，谷氨酸棒

桿菌13032，LB培養(yǎng)基，油相、微生物連續(xù)培養(yǎng)芯片、液壓瓶

方法驗證3.1：大腸桿菌E.coliMG1655搖瓶、孔板和高通量微生物液滴培養(yǎng)系統(tǒng)里

的生長曲線對比，對比圖如圖4所示。

圖4.大腸桿菌E.coliMG1655搖瓶、孔板和MMC里的生長曲線對比圖

方法驗證3.2：大腸桿菌E.coliS17-GFP搖瓶、孔板和高通量微生物液滴培養(yǎng)系統(tǒng)里

的生長曲線對比，對比圖如圖5所示。

圖5.大腸桿菌E.coliS17-GFP搖瓶、孔板和高通量微生物液滴培養(yǎng)系統(tǒng)里的生長曲線對

比圖

6

方法驗證3.3：谷氨酸棒桿菌13032搖瓶、孔板和高通量微生物液滴培養(yǎng)系統(tǒng)里的生

長曲線對比，對比圖如圖6所示。

圖6.谷氨酸棒桿菌13032搖瓶、孔板和高通量微生物液滴培養(yǎng)系統(tǒng)里的生長曲線對比圖

驗證結(jié)果：高通量微生物液滴培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)菌體，生長狀況在搖瓶和酶標(biāo)儀之間，能

夠有效進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)。同時，經(jīng)過實驗得出本儀器適用于單細(xì)胞類微生物：細(xì)菌、酵母等

方法驗證3.4：出發(fā)菌株在無辛酸10mM辛酸培養(yǎng)基中的生長曲線

驗證材料：大腸桿菌E.coliMG1655，LB培養(yǎng)基，M9培養(yǎng)基，辛酸，卡那霉素，油

相，微生物連續(xù)培養(yǎng)芯片，液壓瓶

圖7.出發(fā)菌株在無辛酸10mM辛酸培養(yǎng)基中的生長曲線

7

驗證結(jié)果：辛酸微溶于水、易溶于有機(jī)溶劑，對比圖7中兩條曲線的生長速率及達(dá)到

的最大OD值，可以得出辛酸并未被體系中的油完全萃取，在高通量微生物液滴培養(yǎng)系統(tǒng)

培養(yǎng)過程中對菌株起到了抑制作用。

方法驗證3.5：發(fā)菌株在10g/L山梨糖濃度培養(yǎng)基中的生長曲線

驗證材料：馬紅球菌，LB培養(yǎng)基，底物4-硝基乙酰苯胺，油相，微生物連續(xù)培養(yǎng)芯

片，液壓瓶

驗證過程：誘變及未誘變馬紅球菌在高通量微生物液滴培養(yǎng)系統(tǒng)平臺培養(yǎng)16h左右的

生長曲線如圖8所示：通過分析發(fā)現(xiàn)誘變菌株77號、78號、79號、80號、108、109號

液滴較其它誘變及未誘變菌株液滴的產(chǎn)CDA酶量高，OD值均達(dá)到1以上，因此將其進(jìn)行提

取。液滴提取后，余下液滴又在平臺上繼續(xù)培養(yǎng)，分析OD數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，其中72號液滴OD

值最高可達(dá)到3.8左右。提取該液滴，通過活化，平板畫線，鏡檢，發(fā)現(xiàn)活化菌株為馬紅

球菌，保菌。

圖8.出發(fā)菌株在10g/L山梨糖濃度培養(yǎng)基中的生長曲線

方法驗證4：適應(yīng)性進(jìn)化

方法驗證4.1：大腸桿菌E.coliMG1655在甲醇脅迫下的適應(yīng)性進(jìn)化

驗證材料：大腸桿菌E.coliMG1655，LB培養(yǎng)基，甲醇，油相、微生物連續(xù)培養(yǎng)芯

片、液壓瓶

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圖9.大腸桿菌E.coliMG1655在甲醇脅迫下傳代圖

方法驗證4.2：耐高濃度辛酸大腸桿菌篩選實驗

驗證材料：大腸桿菌E.coliMG1655，LB培養(yǎng)基，M9培養(yǎng)基，辛酸，卡那霉素，油

相，微生物連續(xù)培養(yǎng)芯片，液壓瓶

驗證過程：實驗過程中電腦故障自動重啟了一次，之后手動繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，所以結(jié)果

分為兩個圖；傳代時間設(shè)定為9h；第一輪進(jìn)化由5mM-10mM，設(shè)定5、6、7、8、9、10mM

這6個梯度，每個梯度傳代至少5次；圖10中紅線位置為該辛酸濃度下第一次傳代時達(dá)

到的OD值；5mM-9mM每個濃度各傳了5代，10mM傳了14代。

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圖10.第一輪適應(yīng)性進(jìn)化實驗曲線圖

驗證結(jié)果：根據(jù)第一輪進(jìn)化曲線圖（圖10），選擇了生長狀況較優(yōu)的9、15、17、23

這四個液滴進(jìn)行提取和保存；在50mL離心管體系中進(jìn)行培養(yǎng)（4mL培養(yǎng)基，10mM辛酸），

23號菌株（編號1-23）生長狀況優(yōu)于其他3株（培養(yǎng)過夜后OD增長量較大），但與出

發(fā)菌株相比并不明顯；對菌株1-23和出發(fā)菌株進(jìn)行生長曲線測定（10mM辛酸培養(yǎng)基），

對比結(jié)果見圖11，菌株1-23生長速率較出發(fā)菌株有所提高。

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圖11.菌株在10mM辛酸培養(yǎng)基中的生長曲線

驗證過程：傳代時間設(shè)定為9h；由于第一輪進(jìn)行效果不明顯，第二輪進(jìn)化提高了適

應(yīng)因子濃度。由10mM-20mM，設(shè)定12、16、18、21mM這4個梯度，同時增加了每個梯度

的傳代次數(shù)（至少10次），以期菌株能更好的適應(yīng)高濃度辛酸。

圖12.第二輪適應(yīng)性進(jìn)化實驗曲線圖

驗證結(jié)果：根據(jù)第二輪進(jìn)化曲線圖（圖12），24號液滴（編號2-24，紅色箭頭指向）

在多次傳代中生長狀況都優(yōu)于其他液滴，進(jìn)行提取后劃線保存；對菌株2-24和出發(fā)菌株

進(jìn)行生長曲線測定（20mM辛酸培養(yǎng)基），對比結(jié)果見圖13，菌株2-24生長速度明顯優(yōu)于

出發(fā)菌株，即辛酸耐受性有一定的提高；在50mL離心管體系中進(jìn)行培養(yǎng)（4mL培養(yǎng)基，

20mM辛酸），菌株2-24生長狀況優(yōu)于出發(fā)菌株（培養(yǎng)過夜后OD增長量較大），將此菌株

保存。后續(xù)對菌株2-24發(fā)酵后的產(chǎn)物進(jìn)行了檢測，總脂肪酸產(chǎn)量相對于出發(fā)菌株提高了

15%-20%，OD600提高了約25%。

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圖13.菌株在20mM辛酸培養(yǎng)基中的生長曲線

方法驗證5：篩選耐高濃度山梨糖的大腸桿菌突變菌株

驗證材料：大腸桿菌，LB培養(yǎng)基，Amp，油相，微生物連續(xù)培養(yǎng)芯片，液壓瓶

驗證過程：實驗過程中軟件故障，之后手動調(diào)整參數(shù)后繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，所以結(jié)果分為

兩個圖；紅線位置為該山梨糖濃度下第一次傳代時達(dá)到的OD值；傳代時間設(shè)定為6h；圖

14濃度設(shè)定為10.00、13.33、16.67、20.00g/L這4個梯度，每個梯度傳代2次；圖14

濃度設(shè)定為10.00、20.00、30.00g/L這3個梯度，每個梯度傳代至少5次。

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20.00g/L

16.67g/L

13.33g/L

10.00g/L

10.00g/L20.00g/L30.00g/L

圖14.耐高濃度山梨糖的大腸桿菌第一輪進(jìn)化曲線圖

驗證結(jié)果：根據(jù)第一輪進(jìn)化曲線圖（圖14），將全部液滴進(jìn)行提取和保存，對1-18號

菌（圖中紅色圓圈標(biāo)記）進(jìn)行劃線傳代，準(zhǔn)備進(jìn)行驗證及第二輪進(jìn)化；對菌株1-18和出

發(fā)菌株進(jìn)行生長曲線測定（30g/L山梨糖培養(yǎng)基），對比結(jié)果見圖