用于在體外選擇對(duì)黑斑病損傷有抗性的馬鈴薯克隆的方法及由此生成的馬鈴薯的制作方法

用于在體外選擇對(duì)黑斑病損傷有抗性的馬鈴薯克隆的方法及由此生成的馬鈴薯的制作方法專利名稱：用于在體外選擇對(duì)黑斑病損傷有抗性的馬鈴薯克隆的方法及由此生成的馬鈴薯的制作方法技術(shù)領(lǐng)域：一般而言，本發(fā)明涉及為了獲得期望特征而進(jìn)行的植物組織培養(yǎng)。更具體的說，本發(fā)明涉及在體外選擇對(duì)黑斑損傷有抗性的Lemhi和RussetBurbank馬鈴薯克隆。背景技術(shù)：黑斑病是影響操作過程中受損傷的馬鈴薯塊莖的生理學(xué)(非傳染性)紊亂，也稱為青變、青斑、藍(lán)變、損傷、內(nèi)部黑斑、內(nèi)部損傷、內(nèi)部灰斑、和莖端變黑。這種紊亂表現(xiàn)為在將受傷塊莖削皮或切片時(shí)可以看到的內(nèi)部變色和變黑。變黑通常限于表皮與維管環(huán)之間塊莖組織的外部1/4”-1/2”。斑點(diǎn)的顏色可以變化，由淺灰色至藍(lán)灰色至強(qiáng)烈的煤黑色。斑點(diǎn)的大小和強(qiáng)度通常在受傷24小時(shí)內(nèi)達(dá)到最大值，而且一旦形成，變黑區(qū)域?qū)⒉粫?huì)消失。黑斑病通常是由操作、運(yùn)輸、儲(chǔ)藏、或包裝過程中對(duì)塊莖的沖擊(碰撞、掉落、等)引起的，但也可能在不同程度上與其它物理損傷(諸如壓力擦傷和/或散落破裂)有關(guān)。起始黑斑病所需要的力量不必強(qiáng)烈，特別是對(duì)于易感栽培種而言。1912年英國首次報(bào)告并描述了這種紊亂，此后它成為整個(gè)歐洲的嚴(yán)重問題。1940年美國鑒定了這種紊亂，而現(xiàn)在在這個(gè)國家的所有馬鈴薯種植區(qū)也都可以找到它。雖然受影響的馬鈴薯仍可使用，但是因它們的外觀而使它們的商業(yè)價(jià)值受到限制。這種紊亂是特別嚴(yán)重的，因?yàn)槭苡绊懙膲K莖可能不顯示外部損傷，甚至在清洗塊莖之后也如此。在鮮貨市場(chǎng)和加工馬鈴薯(包括切片和油炸食物)中，黑斑損傷常常導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。塊莖易感性和足以破壞細(xì)胞的沖擊力度是對(duì)起始和形成黑斑病負(fù)有責(zé)任的兩個(gè)最重要的因素。這些條件激活了一系列即四步由酚類化合物(由酪氨酸開始)至醌綴合物的生化轉(zhuǎn)變。中間化合物包括咖啡酸和對(duì)香豆酸。由多酚氧化酶作用介導(dǎo)的該系列之后是醌聚合形成黑色素。在健康的、未受傷組織中，這些酚類化合物與多酚氧化酶通常是隔開的，不發(fā)生接觸。然而，細(xì)胞破裂引起內(nèi)含物混和，并發(fā)生變黑反應(yīng)。雖然酪氨酸和多酚氧化酶在黑斑形成中發(fā)揮主要作用，但是塊莖中存在的這些化合物的總量通常與塊莖易感性無關(guān)，不能解釋塊莖和栽培種之間黑斑反應(yīng)的差異。關(guān)于黑斑現(xiàn)象的生物化學(xué)的最近工作指出細(xì)胞內(nèi)游離酪氨酸庫的減小可增加塊莖對(duì)變黑的抗性(Corsini等人，Evidenceforhighlyconservedtubertyrosinelevelsamongpotatogenotypesandimplicationsforblackspotresistance即關(guān)于馬鈴薯基因型間高度保守的塊莖酪氨酸水平的證據(jù)和黑斑抗性的含義，Am.PotatoJ.，66511-512，1989)。這些調(diào)查人員發(fā)現(xiàn)許多馬鈴薯栽培種的酪氨酸總含量顯著相似，盡管這些栽培種的黑斑病易感性差異很大。在那些對(duì)黑斑病具有最大抗性的栽培種中，發(fā)現(xiàn)大部分酪氨酸與蛋白質(zhì)結(jié)合，只有很少的游離酪氨酸可用于形成黑色素。在易感的栽培種中發(fā)現(xiàn)了相反情況。除了上文討論的生化因素，許多環(huán)境和栽培因素也可能促成這種紊亂的顯現(xiàn)。塊莖膨壓、溫度、比重、礦質(zhì)營養(yǎng)、種植日期、土壤濕度、和土壤溫度都可以影響黑斑形成(Hiller等人，Physiologicaldisordersofpotatotubers即馬鈴薯塊莖的生理學(xué)紊亂，PatatoPhysiology，389-455，Academic出版社，紐約，1985)。甚至在考慮了所有誘病因素之后，馬鈴薯栽培種對(duì)沖擊損傷的反應(yīng)仍舊差異顯著。有些栽培種可能對(duì)黑斑病具有高度抗性，而其它栽培種可能高度易感。來自單一植株的塊莖在變黑反應(yīng)中也可能不同。在一個(gè)塊莖中，由莖端至芽端的易感性也可能不同?？梢酝ㄟ^在生長(zhǎng)季節(jié)采用生產(chǎn)實(shí)踐而將因黑斑病引起的損失控制在某種程度。目前用于控制黑斑損傷的實(shí)踐是通過提供適當(dāng)?shù)募膊『秃οx控制及優(yōu)良的土壤濕度和肥力(特別是鉀)而使植物盡可能的健康。不應(yīng)當(dāng)使土壤在收獲前變干，而且應(yīng)當(dāng)及早處死蔓藤以降低塊莖的水分損失?？刂坪诎咝纬沙潭鹊淖钪匾侄问菧p少收獲過程之中和之后對(duì)塊莖的損傷。可以如下實(shí)現(xiàn)這一要求不在土壤溫度較低(8℃)時(shí)收獲塊莖，調(diào)節(jié)操作速度、掉落距離、和給所有的馬鈴薯操作設(shè)備添加襯墊。選擇對(duì)黑斑病最有抗性的栽培種也是一種重要的考慮。然而，由于生產(chǎn)限制，這并非總是可行。有些栽培種顯示商業(yè)生產(chǎn)的極大潛力，但是因黑斑損傷而受損。栽培種LemhiRusset和RussetBurbank(程度較輕)就是這種情況。Lemhi和RussetBurbank因具有許多特征而使之成為加工工業(yè)的合適且重要的栽培種，包括還原糖水平較低、儲(chǔ)藏性較好、加工極好、和休眠。然而，它們對(duì)黑斑病極其易感。尚未發(fā)現(xiàn)天然有抗性的Lemhi和RussetBurbank。這限制了它們的可接受性，因?yàn)橛刹羵軗p馬鈴薯獲得的加工產(chǎn)品(如切片和油炸食物)的質(zhì)量顯著降低。雖然可以通過傳統(tǒng)育種技術(shù)獲得黑斑抗性，但是這也可能改變使得栽培種在商業(yè)上可接受的其它特征(諸如糖水平、形狀、比重、或產(chǎn)量)。在維持每一種期望特征的基礎(chǔ)上培育改進(jìn)的栽培種是很困難的，而且這種方法將牽涉幾年的雜交和測(cè)試。作為傳統(tǒng)育種技術(shù)的候選，植物細(xì)胞培養(yǎng)提供了機(jī)會(huì)而能夠評(píng)估有潛力再生成有價(jià)值的體細(xì)胞克隆變體的大量細(xì)胞(精確的說是以百萬計(jì))。通常，需要大量的再生植株來鑒定具有期望性狀的體細(xì)胞克隆。增加和測(cè)試這種群體是費(fèi)力的，而且需要大量的溫室和田地空間。這個(gè)問題通常由能夠在再生成植株前在組織培養(yǎng)中對(duì)體細(xì)胞克隆篩選所需特征的開發(fā)技術(shù)來解決。在細(xì)胞培養(yǎng)水平進(jìn)行的評(píng)估極大降低了所要求的空間，并增加了可以檢驗(yàn)的體細(xì)胞克隆系的數(shù)目。體外篩選流程通過消除不需要的材料而在本質(zhì)上增加了鑒定得到具有期望性狀的克隆的可能性。因此，需要提供傳統(tǒng)育種方法的候選方法，用于馬鈴薯栽培種的改進(jìn)和開發(fā)。還需要增加鑒定得到黑斑抗性Lemhi和RussetBurbank馬鈴薯克隆的可能性。還需要增加鑒定并選擇期望黑斑抗性Lemhi和RussetBurbank體細(xì)胞克隆的容易度和功效的技術(shù)。本發(fā)明滿足了這些需要，并提供了其它相關(guān)優(yōu)勢(shì)。發(fā)明概述本發(fā)明涉及使用植物組織培養(yǎng)技術(shù)和使用添加到組織培養(yǎng)培養(yǎng)基中的至少一種黑色素前體(諸如酪氨酸或咖啡酸)而在體外篩選對(duì)黑斑病有抗性的Lemhi和RussetBurbank的方法。本發(fā)明還涉及由體外篩選生成的黑斑抗性塊莖。這些方法基于體外體細(xì)胞分離、培養(yǎng)、篩選、選擇、和再生，但不涉及有性雜交。這些方法通常包括在細(xì)胞層培養(yǎng)基和相關(guān)儲(chǔ)存培養(yǎng)基中培養(yǎng)由馬鈴薯植株獲得的組織，將組織在愈傷組織增殖培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)以獲得愈傷組織形成，將愈傷組織在苗誘導(dǎo)培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)以獲得苗形成，并將苗在生根培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)以確保根形成，從而再生得到馬鈴薯植株，由此可生成對(duì)黑斑病有抗性的塊莖。可以向儲(chǔ)存培養(yǎng)基、愈傷組織增殖培養(yǎng)基、和生根培養(yǎng)基中添加至少一種黑色素前體，以進(jìn)一步增加鑒定得到黑斑抗性克隆的可能性。在使用黑色素前體篩選方法時(shí)，由在各種培養(yǎng)基中存在黑色素前體時(shí)不顯示變黑應(yīng)答的愈傷組織和根再生得到馬鈴薯植株。根據(jù)下文更詳細(xì)的描述，本發(fā)明的其它特色和優(yōu)勢(shì)將變得清晰。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了用于提高黑斑抗性增加的再生Lemhi和RussetBurbank馬鈴薯克隆的數(shù)目的方法及由其生成的馬鈴薯塊莖。用于馬鈴薯葉肉原生質(zhì)體的收集、培養(yǎng)、和再生的流程閱讀下列流程時(shí)應(yīng)當(dāng)參閱下列縮寫和組成來源植株的栽培應(yīng)當(dāng)將馬鈴薯塊莖維持于室溫以中斷休眠。這通常發(fā)生于7-14天內(nèi)。在發(fā)芽起始后，將各塊莖單個(gè)種植到裝有人造土壤混和物諸如Jiffy-Mix(JPA，1400Harvester路，WestChicago，IL60185)或Sunshine-Mix(FisonsWestern公司，Vancouver，BC，加拿大V6H3V1)的20cm陶罐中。應(yīng)當(dāng)用蒸餾水使土壤保持潮濕，但是應(yīng)當(dāng)避免澆水過度。當(dāng)芽的長(zhǎng)度達(dá)到6-10cm時(shí)，由母本塊莖切下芽，并種植到裝有土壤混和物的20cm陶罐中。應(yīng)當(dāng)在相對(duì)濕度70-80％、以冷白色熒光燈照明12小時(shí)光周期的受控環(huán)境室中栽培植物。照明方案應(yīng)當(dāng)包括5小時(shí)的90μEm-2sec-1、2小時(shí)的325μEm-2sec-1、和5小時(shí)的90μEm-2sec-1。將溫度維持在16℃，但是在光照周期的第2-6小時(shí)升高至22℃。如Shepard，J.F.，Mutantselectionandplantregenerationfrompotatomesophyllprotoplasts，GeneticImprovementofCropsEmergentTechniques即由馬鈴薯葉肉原生質(zhì)體選擇突變體和再生植株，農(nóng)作物的遺傳改良新興技術(shù)，明尼蘇達(dá)大學(xué)出版社，第185-219頁，1980所述，兩周一次給植株施肥。也可以由自分生組織培養(yǎng)物起始的植株生成原生質(zhì)體來源植株，并通過節(jié)扦插增加數(shù)目?？梢杂孟挛奶幚砻缪娱L(zhǎng)/根起始的“植物再生指令序列”部分中描述的培養(yǎng)基E和條件來培養(yǎng)并維持它們。原生質(zhì)體的分離(葉片采集)當(dāng)由移植后4-8周的植株收集小葉時(shí)，原生質(zhì)體的產(chǎn)量是相當(dāng)一致的。由第3-7節(jié)(自植株頂端開始)剪下葉子。應(yīng)當(dāng)避免使用很嫩的葉或很老的葉。具有大型末端小葉(＞5cm)的葉通常產(chǎn)生大量的原生質(zhì)體。選擇最大的葉。讓一部分葉柄留在小葉上以便于操作。大約3.5-4.5g葉組織(5-6片小葉)通常將提供足夠的細(xì)胞用于處理。在測(cè)定鮮重后，小葉已經(jīng)準(zhǔn)備就緒，可用于酶促分離的預(yù)處理。原生質(zhì)體分離(小葉預(yù)處理)必須極度小心以確保在下文所述體外操作的整個(gè)過程中維持絕對(duì)無菌條件。在將小葉置于預(yù)處理溶液中之前，必須將小葉滅菌。將每片小葉浸入70％乙醇(1-2秒鐘)，然后轉(zhuǎn)移至裝有1000ml10％漂白劑(Chlorox、Hilex、等)溶液的燒杯中。將小葉在次氯酸鹽溶液中浸沒2-3分鐘，然后轉(zhuǎn)移至裝有500ml無菌蒸餾水的燒杯中。將每片小葉浸入水中大約10次即漂洗，然后轉(zhuǎn)移至裝有無菌蒸餾水的第二個(gè)燒杯中，并重復(fù)漂洗步驟。第二次漂洗后，將小葉浸入70％乙醇(1-2秒鐘)?，F(xiàn)在小葉已經(jīng)準(zhǔn)備就緒，可用于預(yù)處理溶液。將250ml無菌漂浮液無菌轉(zhuǎn)移至大型(20cm)、有蓋的玻璃洗盆(無菌)中將小葉漂浮在漂浮液表面上，背軸(頂)面向下。用箔片覆蓋盆，并于24℃保溫48小時(shí)。保溫后，取出小葉，并如上所述重復(fù)表面滅菌步驟。最后一次浸入70％乙醇后，將小葉在層流罩超凈臺(tái)中在無菌紙巾上空氣干燥。通過在95％乙醇中浸泡5-10分鐘，將尼龍剛毛美工刷滅菌。將刷子空氣干燥，并小心的刷過每片小葉的向軸(底)面。刷的動(dòng)作應(yīng)當(dāng)朝向小葉尖端，而且應(yīng)當(dāng)持續(xù)至由小葉剝?nèi)ケ砥ぁ．?dāng)組織由淺綠色變成深綠色時(shí)，剝離步驟就完成了。由每片小葉除去中脈并丟棄。將刷過的組織無菌切成窄條(1-3mm寬)，并轉(zhuǎn)移至裝有200ml無菌浸泡液的500ml側(cè)臂燒瓶。將燒瓶漩渦晃動(dòng)，使組織片均勻分布在溶液中。用箔片覆蓋燒瓶，并于4-10℃保溫24小時(shí)。原生質(zhì)體分離(小葉消化)浸泡階段完成后，由燒瓶小心的倒出液體，并換入100ml酶溶液。將小葉切片真空浸潤(rùn)(25-27英寸Hg)7分鐘，并將燒瓶置于旋轉(zhuǎn)搖床(100rpm)上，于室溫(27℃)保溫至組織分離(3-5小時(shí))。消化時(shí)間隨栽培種、組織年齡、溫度、搖床速度、和酶溶液的比重而變化。原生質(zhì)體分離(原生質(zhì)體收獲)通過無菌Babcock(乳試驗(yàn))瓶中的離心浮選來收集原生質(zhì)體(除去細(xì)胞壁的細(xì)胞)。將消化燒瓶的內(nèi)容物和緩的倒入裝有幾層粗棉布的無菌漏斗內(nèi)。漏斗尖端經(jīng)一段塑料管裝配了51/4英寸巴氏吸管。吸管尖端應(yīng)當(dāng)靠在Babcock瓶頸的內(nèi)側(cè)，距離瓶口大約1/2-1/3距離。原生質(zhì)體極端脆弱，因此應(yīng)當(dāng)使原生質(zhì)體懸浮液沿瓶壁流下，而不是直接濺落瓶底。新鮮分離的原生質(zhì)體還對(duì)光敏感，因此收集步驟應(yīng)當(dāng)在柔和的光照下進(jìn)行。將無菌漂洗液倒到滯留在粗棉布濾器上的碎片上，同時(shí)用吸管尖端溫和搖動(dòng)濾器。漂洗碎片至注滿3個(gè)Babcock瓶。用無菌漂洗液注滿第四個(gè)瓶。將該瓶用于平衡離心機(jī)。將4個(gè)瓶以500rpm離心10分鐘(IECHN-SII離心機(jī)，配備轉(zhuǎn)頭215和套管367A)。碎片離心到瓶底，而完整原生質(zhì)體漂浮在頂部。由平衡瓶取出5-10ml無菌漂洗液。用無菌9英寸巴氏吸管將其它3個(gè)瓶的原生質(zhì)體層轉(zhuǎn)移至漂洗瓶。將吸管尖端插入漂洗液，然后將原生質(zhì)體緩慢且溫和的注入溶液。將瓶子傾斜大約45度角并旋轉(zhuǎn)幾分鐘，使原生質(zhì)體均勻分布于漂洗液中。加入新鮮漂洗液至Babcock瓶頸(#8)上的頂級(jí)并再次離心。若在CL培養(yǎng)基中使用1X鹽，則現(xiàn)在就可以涂布生成的漂浮原生質(zhì)體。若CL培養(yǎng)基含有4X鹽，則必須在涂布前將原生質(zhì)體在保持液中適應(yīng)至少1小時(shí)。由瓶頸讀取原生質(zhì)體層占據(jù)的分區(qū)數(shù)目，以估計(jì)收集的細(xì)胞數(shù)目(一個(gè)大分區(qū)包含大約250萬個(gè)原生質(zhì)體)。通過幾次漂洗用保持液包被無菌巴氏吸管的內(nèi)壁，排出原生質(zhì)體層，并用保持液將原生質(zhì)體稀釋至濃度1百萬個(gè)細(xì)胞/ml。將原生質(zhì)體在保持液中于22-24℃維持最少1小時(shí)。體外選擇黑斑抗性原生質(zhì)體衍生的馬鈴薯克隆的方法植株再生順序(原生質(zhì)體培養(yǎng))在塑料四分板中培養(yǎng)原生質(zhì)體。準(zhǔn)備平板，即用電焊槍沿每個(gè)分區(qū)的底部割一條縫。向兩個(gè)相對(duì)分區(qū)的每一個(gè)都注入10mlR培養(yǎng)基。R培養(yǎng)基的工作濃度如下制備原生質(zhì)體細(xì)胞層培養(yǎng)基(CL培養(yǎng)基)，即混和4份SLLX溶液與1份CL成分。CL培養(yǎng)基的工作濃度如下將混和的CL/SLLX培養(yǎng)基冷卻至室溫(10-15分鐘)。然后將原生質(zhì)體懸浮液稀釋至期望濃度(20,000-40,000細(xì)胞/ml)。使用無菌吸管尖端，將原生質(zhì)體在培養(yǎng)基中溫和的混勻成均一的懸浮液。將3ml懸浮液轉(zhuǎn)移至每個(gè)空的四分板分區(qū)，合計(jì)每個(gè)板6ml。用Parafilm石蠟?zāi)っ芊馄桨?，并在恒定照?冷白色熒光燈)下于24℃保溫10-14天。在這一起始生長(zhǎng)階段需要低光照強(qiáng)度(大約600lux)。植物再生順序(愈傷組織培養(yǎng))用無菌解剖刀將凝膠形式的細(xì)胞層切成小片，并將這些凝膠片轉(zhuǎn)移至裝有20mlC培養(yǎng)基(＝C1)(愈傷組織增殖培養(yǎng)基)的皮氏培養(yǎng)皿。一個(gè)四分區(qū)的整個(gè)內(nèi)容物應(yīng)當(dāng)涂布在一個(gè)C培養(yǎng)基平板上。用Parafilm石蠟?zāi)っ芊馄桨?，并在大約3000lux的恒定照明(冷白色熒光燈)下于24℃保溫。2-3周后，愈傷組織(小型細(xì)胞聚集體)應(yīng)當(dāng)是淺綠色的，直徑大約1-2mm。用無菌解剖刀片尖端由凝膠挑取個(gè)別愈傷組織，并轉(zhuǎn)移至裝有新鮮C培養(yǎng)基的平板(25-50愈傷組織/平板)。如上所述將這些C培養(yǎng)基平板(＝C2)保溫。C培養(yǎng)基的工作濃度如下植物再生順序(愈傷組織分化)當(dāng)愈傷組織變成深綠色時(shí)(3-5周)，將來自C培養(yǎng)基平板的愈傷組織轉(zhuǎn)移至裝有苗誘導(dǎo)培養(yǎng)基(6D培養(yǎng)基)的平板(10-25愈傷組織/平板)。用Parafilm石蠟?zāi)っ芊馄桨?，并在冷白色熒光燈?大約3000-4000lux)以每日周期16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗于24℃保溫。苗誘導(dǎo)通常發(fā)生于6-8周后。然而，有些栽培種只在苗再生培養(yǎng)基上長(zhǎng)期培養(yǎng)(6-8個(gè)月)后才生成苗。6D培養(yǎng)基的工作濃度如下植物再生順序(苗延長(zhǎng)/根起始)當(dāng)愈傷組織上的苗長(zhǎng)到2-10mm長(zhǎng)時(shí)，由各愈傷組織切下苗，并轉(zhuǎn)移至裝有15mlE培養(yǎng)基的玻璃試管(25×150mm)。將每根苗的基部壓入培養(yǎng)基，蓋上試管帽，并用濾紙條密封。將試管在冷白色熒光燈下(大約1500-2000lux，每天8小時(shí)黑暗期)于24℃保溫。根起始應(yīng)當(dāng)發(fā)生于2-5周內(nèi)。E培養(yǎng)基的工作濃度如下植物再生順序(再生小植株的栽培)由試管中取出小植株，并用蒸餾水洗去根上的瓊脂。將每株小植株轉(zhuǎn)移至裝有Jiffy-Mix的8cm陶罐。用大約100mlPeters20-20-20肥料(0.5g/L)給陶罐澆水。將每個(gè)陶罐密封在干凈的塑料袋中。將袋裝的陶罐在熒光燈下于室溫(22-27℃)保溫。一周后，打開袋子的頂部。隨后7-10天擴(kuò)大開口，然后除去整個(gè)袋子。讓植株繼續(xù)生長(zhǎng)2-4周。當(dāng)植株長(zhǎng)到15-25cm高時(shí)，應(yīng)當(dāng)將它們移植到裝有Jiffy-Mix的更大陶罐(20-30cm)中。然后在溫室中栽培植株直至完成塊莖結(jié)果(2-4個(gè)月)。收獲前大約1周，切斷蔓藤，并讓陶罐中的土壤干燥。將每個(gè)原生質(zhì)體衍生克隆的塊莖收集到紙袋中并冷藏，用于田間擴(kuò)大。上文所述技術(shù)基于Shepard，J.F.，Mutantselectionandplantregenerationfrompotatomesophyllprotoplasts，GeneticImprovementofCropsEmergentTechniques即由馬鈴薯葉肉原生質(zhì)體選擇突變體和再生植株，農(nóng)作物的遺傳改良新興技術(shù)，明尼蘇達(dá)大學(xué)出版社，第185-219頁，1980描述的流程，并經(jīng)過Taylor，R.J.和Secor，G.A.，Ashootinductionprocedurealteredforincreasedshootefficiencyofpotatoprotoplast-derivedcalli即為了提高馬鈴薯原生質(zhì)體衍生愈傷組織的苗效率而改變的苗誘導(dǎo)流程，PotatoResearch，31651-658，1988的修改(收入本文作為參考)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，依照上文所述流程進(jìn)行馬鈴薯葉肉原生質(zhì)體的收集、培養(yǎng)、和再生，只是在有些組織培養(yǎng)培養(yǎng)基中包含至少一種黑色素前體諸如酪氨酸或咖啡酸。這種方法能夠額外增加黑斑抗性克隆的數(shù)目。如上所述不含至少一種黑色素前體的培養(yǎng)誘導(dǎo)篩選方法自身將導(dǎo)致一些黑色素抗性克隆。在黑色素前體篩選方法的第一階段，在普通CL培養(yǎng)基(不含黑色素前體)中稀釋(40,000細(xì)胞/ml)原生質(zhì)體，然后轉(zhuǎn)移至裝有含0.25mM酪氨酸或咖啡酸的R培養(yǎng)基(儲(chǔ)存培養(yǎng)基)的培養(yǎng)平板。正常保溫期后，將原生質(zhì)體和原生質(zhì)體衍生微小愈傷組織與細(xì)胞層培養(yǎng)基(CL)一起轉(zhuǎn)移至含0.5mM酪氨酸的C培養(yǎng)基。此第一次轉(zhuǎn)移至C培養(yǎng)基是該方法的第二階段。標(biāo)準(zhǔn)保溫期后，只選擇不顯示變黑應(yīng)答的愈傷組織，并轉(zhuǎn)移至含1.0mM酪氨酸或咖啡酸的新鮮C培養(yǎng)基，用于第三階段的篩選。將愈傷組織繼續(xù)保溫2-4周，并通過無菌解剖刀片的切割使那些保持綠色(不顯示變黑)的愈傷組織受損。24小時(shí)后，對(duì)割傷的愈傷組織評(píng)估受損區(qū)域的變黑情況。此第四階段篩選后，只將存活的綠色愈傷組織轉(zhuǎn)移至普通6D培養(yǎng)基(苗誘導(dǎo)培養(yǎng)基)(不含黑色素前體)，用于小植株起始。將再生植株轉(zhuǎn)移至含0.5mM酪氨酸或咖啡酸的E培養(yǎng)基(生根培養(yǎng)基)，用于最后第五階段的篩選。回收所有在培養(yǎng)基中形成不展示根變黑的苗，作為潛在的黑斑抗性克隆。將這些植株轉(zhuǎn)移至陶罐中，并在溫室中栽培，用于生成塊莖。每株植株通常生成6-24個(gè)塊莖，保留它們直至下一個(gè)田間種植季節(jié)。隨后將選定克隆的塊莖擴(kuò)大1或2次田間世代。在溫室和田間兩個(gè)場(chǎng)所檢驗(yàn)克隆的解剖特征，并對(duì)收獲的塊莖測(cè)試黑斑損傷?？赡苡欣氖侵辉谟行╇A段添加酪氨酸或咖啡酸，因?yàn)榉駝t的話原生質(zhì)體和愈傷組織可能受傷并因而不能用。表1篩選和再生順序所牽涉的最短時(shí)間的概述討論用于鑒定可生成黑斑抗性植株的細(xì)胞和愈傷組織的流程基于的是受傷塊莖中通常發(fā)生的生化過程。上文所述標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)培養(yǎng)基中包含酪氨酸(通過一系列生化反應(yīng)轉(zhuǎn)變成黑色素的主要化合物)或咖啡酸(黑色素途徑中的中間化合物)作為額外成分。在組織培養(yǎng)過程的幾個(gè)階段對(duì)由單個(gè)原生質(zhì)體衍生的愈傷組織評(píng)估黑色色素形成。丟棄那些在存在酪氨酸或咖啡酸時(shí)展示變黑應(yīng)答的愈傷組織(推測(cè)是易感體)，保留那些在整個(gè)生長(zhǎng)和再生過程中不顯示變黑的愈傷組織(可能是抗性克隆)。將由這些愈傷組織生成的植株進(jìn)行溫室和田間擴(kuò)大，以生成足夠數(shù)量的塊莖用于隨后的損傷和黑斑評(píng)估。黑斑測(cè)試(所用方法和評(píng)估系統(tǒng))使用與Kunkel等人，Improvementsoftechniquesforblackspotevaluationandsomeerrorsassociatedwithmeasurements即用于黑斑評(píng)估的技術(shù)改進(jìn)和與測(cè)量有關(guān)的一些誤差，Am.PotatoJ.，6313-23，1986(收入本文作為參考)所述相似的器械，在受控條件下使塊莖受傷。對(duì)每個(gè)克隆的5個(gè)塊莖進(jìn)行測(cè)試，方法是將一個(gè)115g砝碼由45或50cm高度落下而沖擊塊莖，每個(gè)塊莖接受9次沖擊(莖端3次、中部3次、芽端3次)。將塊莖于75℃維持24小時(shí)，然后評(píng)估。在測(cè)試的第一年，可用再生塊莖的數(shù)量因環(huán)境條件而是最小的。在第一年和第三年，每個(gè)克隆測(cè)試5個(gè)塊莖，每個(gè)塊莖接受9次沖擊，合計(jì)45次擦傷斑點(diǎn)。在第二年，每個(gè)克隆重復(fù)測(cè)試3次，即每個(gè)克隆15個(gè)塊莖，每個(gè)塊莖9次沖擊，合計(jì)135個(gè)擦傷斑點(diǎn)。下文所示第二年的結(jié)果反映了三次試驗(yàn)的平均值。對(duì)于有些克隆，第二年是測(cè)試該克隆的第一年。用刀在沖擊區(qū)域切片，目視測(cè)定黑斑形成。平行于塊莖表面切下薄薄的組織切片直至獲得最大直徑的變黑強(qiáng)度。使用3種標(biāo)準(zhǔn)來量化黑斑病易感性(1)依照5分等級(jí)來評(píng)估每個(gè)沖擊點(diǎn)的損傷嚴(yán)重程度(S)，其中0＝不形成斑點(diǎn)1＝很小的斑點(diǎn)，稍微黑2＝小斑點(diǎn)，有限變黑3＝中等斑點(diǎn)，中度變黑4＝大斑點(diǎn)5＝很大的斑點(diǎn)，強(qiáng)烈變黑(2)對(duì)斑點(diǎn)計(jì)數(shù)，并由該信息測(cè)定形成斑點(diǎn)的沖擊區(qū)域的百分比(PC)。(3)依照下面的公式，由上述信息計(jì)算黑斑指數(shù)(BI)BI＝S×PC將栽培種的易感性/抗性表述成由所有受傷塊莖計(jì)算得到的平均黑斑指數(shù)。結(jié)果下表以百分比顯示了結(jié)果*它們?cè)诮y(tǒng)計(jì)上比母本克隆更有抗性。下表鑒定了由未進(jìn)行黑色素前體體外選擇篩選流程的Lemhi愈傷組織系再生的克隆。該群體代表了人們對(duì)于不含黑色素前體的體外篩選所預(yù)期的黑斑抗性變體的分布。可以看出，組織培養(yǎng)過程自身可增加黑斑抗性Lemhi克隆的數(shù)目，因?yàn)長(zhǎng)emhi在自然界通常顯示相對(duì)較少(如果有的話)的抗性。組織培養(yǎng)篩選Lemhi克隆群體的黑斑反應(yīng)克隆編號(hào)黑斑指數(shù)第一年第二年第三年84-39182.792-101.2*84-1143.5*5.0*55.0*84-210B5.4*98.5102.884-19610.6*144.262.684-11711.4*60.413.0*84-25612.1*78.883.184-25416.7*102.347.7*84-820.7*84-14842.697.9126.884-1642.6113.1163.384-30547.9158.6172.392-2564.153.2*19.2*84-231101.029.5*84-155105.036.2*-84-1106.4151.4180.784-5121.7206.4218.884-143141.3255.9163.384-9160.2133.6101.384-63203.3137.2188.881-1237.2135.1161.384-249236.684-329181.984-163125.584-3199.284-18470.998.769.884-27879.584.884-351A74.684-2773.260.584-2069.284-31450.9*105.784-49246.1*113.984-39346.0*105.184-45924.9*50.5*84-780.4*1.2*92-3125.0115-3103.6103.291-6439.1*81-836.3*120-111.7*84-402199.584-16647.3*LemhiMC51.5124.1147.4(原生質(zhì)體來源)Lemhi47.994.5160.5(國家種子分生組織計(jì)劃)*＝顯著比栽培種Lemhi更有抗性(p＝0.05)第一年的數(shù)據(jù)基于1次損傷測(cè)試試驗(yàn)(5個(gè)塊莖)第二年的數(shù)據(jù)基于3次損傷測(cè)試試驗(yàn)(15個(gè)塊莖)第三年的數(shù)據(jù)基于1次損傷測(cè)試試驗(yàn)(5個(gè)塊莖)這些結(jié)果證明容易發(fā)生黑斑病易感性的變化，而且能夠在Lemhi體細(xì)胞克隆的篩選群體中找到黑斑損傷抗性增強(qiáng)的體細(xì)胞克隆。下表鑒定了由進(jìn)行了黑色素前體體外篩選流程但不顯示變黑應(yīng)答的Lemhi愈傷組織系再生的克隆。如下所述在不同階段篩選這些克隆。用黑色素前體(酪氨酸或咖啡酸(CA))在體外篩選的Lemhi克隆群體的黑斑反應(yīng)克隆編號(hào)篩選階段(添加黑色素前體的階段)黑斑指數(shù)第一年第二年第三年L-DB27(CA)12340.0*68.353.0*L-DB23(CA)12341.2*83.675.9L-DB14(CA)12343.0*27.6*93.0L-DB18(CA)12343.4*90.6105.2L-DB21(CA)12344.9*144.6170.5L-DB24(CA)123436.8241.392-7(CA)360.5109.1128.6111-6235203.889.6103-13235174.569.4111-4235157.0136.7111-17235107.32.598-2235104.894-1597.4103.3111-1323584.451.3*97-1923583.650.7*111-2023577.783.2111-1223575.8111-1423575.4134.498-123566.6103-323562.6106.391-95555.3*33.8*97-1823553.6*21.0*97-2623546.6*36.1*111-323545.6*100.891-13542.1*54.7*103-223541.7*199.4111-2823538.5*94.892-67535.3*15.3L-DB4123431.8*91-62523.8*59.2*L-DB6123418.6*35.1*91-28515.2*L-DB25(CA)123414.6*2.5*114-823513.4*83.8*97-302359.5*132.992-6652.5*91-751.9*L-DB22(CA)12340.5*115-12350.4*57.5111-33350.1*55.884-5155L-DB19(CA)1234114.4114-52345102197-43395.5110-1734572.697-173563.597-4413557.791-14538.9*103-1423533.1*91-61532.3*L-DB15(CA)123431.1*97-123527.6*91-12526.9*111-3723522.4*98-534521.2*115-214.1*111-29234511.8*LemhiMC51.5124.1147.4(原生質(zhì)體來源)Lemhi47.994.5160.5(國家種子分生組織計(jì)劃)*＝顯著比栽培種Lemhi更有抗性(p＝0.05)第一年的數(shù)據(jù)基于1次損傷測(cè)試試驗(yàn)(5個(gè)塊莖)第二年的數(shù)據(jù)基于3次損傷測(cè)試試驗(yàn)(15個(gè)塊莖)第三年的數(shù)據(jù)基于1次損傷測(cè)試試驗(yàn)(5個(gè)塊莖)下列克隆是由進(jìn)行了黑色素前體體外篩選流程且在至少一個(gè)階段顯示變黑應(yīng)答的Lemhi愈傷組織系再生的?？寺【幪?hào)篩選階段黑斑指數(shù)第一年第二年第三年111-15235133.4103-1235121.230.2*110-23575.491-51557.7111-1123539.7*97-83536.7*16.1*115-92350.2*7.4*111-352345584*92-125535.6*Lemhi母本克隆51.5124.1147.4(原生質(zhì)體來源)Lemhi47.994.5160.5(國家種子分生組織計(jì)劃)*＝顯著比栽培種Lemhi更有抗性(p＝0.05)第一年的數(shù)據(jù)基于1次損傷測(cè)試試驗(yàn)(5個(gè)塊莖)第二年的數(shù)據(jù)基于3次損傷測(cè)試試驗(yàn)(15個(gè)塊莖)第三年的數(shù)據(jù)基于1次損傷測(cè)試試驗(yàn)(5個(gè)塊莖)這些結(jié)果證明可以在體外選擇的體細(xì)胞克隆群體中鑒定黑斑損傷易感性，暗示通過在組織培養(yǎng)的同時(shí)篩選材料可以提高黑斑抗性克隆的比例。結(jié)論來源種質(zhì)Lemhi通常不如過去對(duì)損傷易感。Lemhi通常是高度易感的，預(yù)期BI值250-300。相反，長(zhǎng)出的Lemhi塊莖的平均BI在第一年是51.1，第二年是124.1，第三年是147.4。這證明了這種紊亂的表達(dá)是多么密切依賴環(huán)境條件和植物生理學(xué)。將Lemhi的黑斑應(yīng)答用作評(píng)估體細(xì)胞克隆的比較手段。清楚的是，可以通過體外選擇獲得顯示黑斑損傷抗性增強(qiáng)的克隆?？梢宰C明，起作用的黑斑抗性體外篩選系統(tǒng)是如何控制這種紊亂的一個(gè)因素。應(yīng)用這種系統(tǒng)可能是有意義的，因?yàn)榭梢澡b定出大比例的黑斑抗性增強(qiáng)的體細(xì)胞克隆。這將極大增加獲得具有最初栽培種所有重要特征的克隆的可能性。找到除了黑斑抗性以外還顯示其它性狀改進(jìn)的體細(xì)胞克隆的概率也將增加。雖然為了例示目的已經(jīng)詳細(xì)描述了本發(fā)明的具體實(shí)施方案，但是可以進(jìn)行各種修改而不違背本發(fā)明的精神和范圍。因此，本發(fā)明將不受限制，除了所附權(quán)利要求。權(quán)利要求1.由通過組織培養(yǎng)獲得的再生馬鈴薯植株體外選擇黑斑抗性塊莖的方法，包括下列步驟a)在細(xì)胞層培養(yǎng)基和相關(guān)儲(chǔ)存培養(yǎng)基中培養(yǎng)由馬鈴薯植株獲得的組織；b)將所述組織在愈傷組織增殖培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)以獲得愈傷組織形成；c)將所述愈傷組織在苗誘導(dǎo)培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)以獲得苗形成；d)將所述苗在生根培養(yǎng)基上傳代培養(yǎng)以確保根形成，從而再生得到馬鈴薯植株，由此可生成黑斑抗性塊莖；并e)向至少一種所述儲(chǔ)存培養(yǎng)基、愈傷組織增殖培養(yǎng)基、和生根培養(yǎng)基中添加至少一種黑色素前體，從而由在添加黑色素前體時(shí)不顯示變黑應(yīng)答的愈傷組織和根再生得到所述馬鈴薯植株。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述黑色素前體是酪氨酸或咖啡酸。3.權(quán)利要求2的方法，其中酪氨酸或咖啡酸的濃度是a)儲(chǔ)存培養(yǎng)基中為0-大約0.25mM；b)愈傷組織增殖培養(yǎng)基中為0-大約1.0mM；c)生根