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IP屬地：湖北 上傳時(shí)間：2024-04-24 格式：DOCX 頁數(shù)：13 大?。?5.17KB 積分：12 舉報(bào) 版權(quán)申訴

利用轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)外源基因?qū)肼菪宓姆椒ɡ棉D(zhuǎn)座子介導(dǎo)外源基因?qū)肼菪宓姆椒ɡ棉D(zhuǎn)座子介導(dǎo)外源基因?qū)肼菪宓姆椒ǎ婕耙环N基因工程。以NCBI上已知的藍(lán)藻的序列設(shè)計(jì)多組引物IS1～I(xiàn)S4，從藍(lán)藻上克隆轉(zhuǎn)座子元件即插入序列；供體質(zhì)粒pEGFP-IS-IS-Km的超聲轉(zhuǎn)化和篩選：用EcoRⅠ酶切pEGFP-IS-IS-Km，獲得線狀質(zhì)粒，兩端各有一個(gè)IS序列，轉(zhuǎn)化螺旋藻869s，以GFP和G418(nptII)篩選出插入突變的螺旋藻株。構(gòu)建了包含gfp基因、nptII標(biāo)記基因及轉(zhuǎn)座子序列的螺旋藻整合篩選系統(tǒng)，以利用轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入突變來影響螺旋藻基因結(jié)構(gòu)進(jìn)而改變螺旋藻品質(zhì)。可應(yīng)用于螺旋藻突變文庫的構(gòu)建，還可進(jìn)行外源基因的導(dǎo)入和表達(dá)，以及螺旋藻內(nèi)源基因的反義抑制調(diào)控。【專利說明】利用轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)外源基因?qū)肼菪宓姆椒ā炯夹g(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明涉及一種基因工程，尤其是涉及一種利用轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)外源基因?qū)肼菪宓姆椒??！颈尘凹夹g(shù)】[0002]螺旋藻（Spirulina)在分類學(xué)上屬于藍(lán)藻門，顫藻綱，螺旋藻屬，是一種多細(xì)胞、微型、不分枝、無異形胞的螺旋狀體，靠分裂增殖，光合自養(yǎng)生物。其作為一種新的基因轉(zhuǎn)化載體，具有高安全性、高營(yíng)養(yǎng)性和高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的特點(diǎn)，并且還有許多獨(dú)到之處。如：對(duì)外源蛋白質(zhì)容受力高、繁殖迅速、再生快、培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單等。螺旋藻作為一種具有重要開發(fā)應(yīng)用價(jià)值的原核生物具有巨大的潛力。[0003]近年來，理化誘變廣泛用于篩選目標(biāo)菌株，獲得優(yōu)良螺旋藻的傳統(tǒng)手段一般都是自然馴化和不斷自然篩選而得，改造其基因結(jié)構(gòu)，獲得不同品系的更優(yōu)良螺旋藻也有不少研究。Lijianhong等用紫外誘變螺旋藻獲得了富含藻藍(lán)蛋白的突變體。Cohen等用除草劑SAN-9785作為生長(zhǎng)抑制劑，從鈍頂螺旋藻和紫球藻中篩選獲得突變株，其生長(zhǎng)速度及糖脂含量均高于出發(fā)株，且鈍頂螺旋藻突變株富含Y-亞麻酸。物理誘變因素（Y-射線、紫外線等）和化學(xué)誘變因素（EMS、MNNG等）均能使螺旋藻絲體或細(xì)胞發(fā)生變異，產(chǎn)生耐低溫、耐鹽、富含某種氨基酸或藻藍(lán)蛋白以及藻絲加長(zhǎng)、高產(chǎn)的突變體。[0004]現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因技術(shù)大多只適用于單細(xì)胞的藍(lán)藻，對(duì)于絲狀的螺旋藻尚沒有成熟的遺傳轉(zhuǎn)化方法。螺旋藻之所以難以轉(zhuǎn)化，除了研究者們公認(rèn)的，由于螺旋藻基因組自身的完美性和復(fù)雜性而對(duì)外源基因產(chǎn)生強(qiáng)烈的排斥作用外，尚未建立有效的篩選、純化系統(tǒng)和方法也是限制其轉(zhuǎn)化效率的重要因素之一。Zeng等、茅云翔等分別報(bào)道利用超聲波、電擊等轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化了螺旋藻單細(xì)胞，獲得了具有氯霉素抗性的轉(zhuǎn)化藻株。Kawata等人采用建立基于Tn5基礎(chǔ)上的轉(zhuǎn)座子載體和轉(zhuǎn)座酶進(jìn)行了鈍頂螺旋藻轉(zhuǎn)化體系的研究。徐虹等利用超聲波轉(zhuǎn)化獲得了具有G418抗性的轉(zhuǎn)化藻株，并使外源基因成功的表達(dá)。張海生等通過自然轉(zhuǎn)化法將帶有GFP報(bào)告基因的表達(dá)載體導(dǎo)入鈍頂螺旋藻Α9細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)了GFP在螺旋藻細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)。在上述試驗(yàn)中普遍采用的篩選標(biāo)記系統(tǒng)是利用抗生素基因作為篩選標(biāo)記，但是選擇何種抗生素以及抗生素的濃度卻眾說紛紜，更為重要的是單單采用抗生素標(biāo)記篩選出的轉(zhuǎn)基因藻在長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)過程中往往會(huì)出現(xiàn)雜交信號(hào)不穩(wěn)定，甚至出現(xiàn)性狀退化等現(xiàn)象。出現(xiàn)這種現(xiàn)象，一方面是由于整合基因丟失，但更為主要的無疑是由于野生藻污染，轉(zhuǎn)化藻純度不高所造成的。[0005]轉(zhuǎn)座子是生物基因組上的可移動(dòng)的遺傳元件，廣泛存在于細(xì)菌和各類真核生物中。轉(zhuǎn)座子的存在和在基因組中的轉(zhuǎn)移可以直接或間接地造成基因重排，在基因組中引起變異。利用轉(zhuǎn)座子可以尋找和確定生物體基因組的功能，改良作物性狀等。HudsonP等利用Tn4001mod轉(zhuǎn)座子構(gòu)建突變株，鑒定雞敗血支原體的毒力相關(guān)因子。Shimamoto等培育了含Ds轉(zhuǎn)座元件和含Ac轉(zhuǎn)座元件轉(zhuǎn)座酶（AcTPase)基因的兩種水稻株系，通過雜交篩選得到了大量矮化、花期改變的突變體。轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽插入突變改造菌株可以用于篩選目標(biāo)菌株，同時(shí)也可以利用其自身帶有的已知標(biāo)簽序列并結(jié)合特定的方法分析轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽插入位點(diǎn)的相鄰區(qū)域，從而確定突變基因，為研究相關(guān)基因功能奠定基礎(chǔ)。轉(zhuǎn)座子技術(shù)已有應(yīng)用于單細(xì)胞藍(lán)藻構(gòu)建突變文庫的報(bào)道，但在螺旋藻中尚未見報(bào)道?！景l(fā)明內(nèi)容】[0006]本發(fā)明的目的旨在提供一種利用轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)外源基因?qū)肼菪宓姆椒?。[0007]本發(fā)明的具體步驟如下：[0008]1)以NCBI上已知的藍(lán)藻（包括螺旋藻）的序列設(shè)計(jì)多組引物IS1、IS2、IS3、IS4，從藍(lán)藻上克隆出最簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)座子元件即插入序列（IS)，其序列如下：[0009]第一組：（模板為聚球藻PCC6803)[0010]ISl-I:5-ATTGCGGCCGCTTTCGACAACGTTA-3[0011]NotI[0012]IS1-2:GATCGATCCCTGGCGGTTCATAGTG[0013]ClaI[0014]IS1-3:5-GGAATTCCTAGGCCACTGACT-3[0015]EcoRI[0016]第二組：（模板為銅綠微囊藻PCC7806)[0017]IS2-1:5-GATCGATTATACAATAGCCATAC-3[0018]ClaI[0019]IS2-2:5-TAGCGGCCGCTGGTAGTTGGTTGTG-3[0020]NotI[0021]IS2-3:5-ACAGTGAGGAATTCTTAAGAGAACG-3[0022]EcoRI[0023]第三組：（模板為螺旋藻869s)[0024]IS3-1:5-TAGCAATCGATAGAACACTTAGGAC-3[0025]ClaI[0026]IS3-2:5-TAGCGGCCGCACAGAACACTTAGGAC-3[0027]NotI[0028]IS3-3:5-TAGGAATTCGTCAAGGTGGTTAG-3[0029]EcoRI[0030]第四組：（模板為螺旋藻869s)[0031]IS4-1:5-GGCGTTATCGATTTAGGGTATGATT-3[0032]ClaI[0033]IS4-2:5-GGCGGCCGCTGATTTAGGGTATGATT-3[0034]NotI[0035]IS4-3:5-GGCGTTGCTGAATTCAGGTATGATT-3[0036]EcoRI[0037]其中在IS序列的上游引物分別設(shè)置了NotI和ClaI位點(diǎn)，下游引物設(shè)置了EcoRI酶切位點(diǎn)，以藍(lán)藻（包括螺旋藻，第一組為銅綠微囊藻6803)染色體為模板，分別以第一條和第三條引物，第二條和第三條引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出插入序列，擴(kuò)增的兩種產(chǎn)物大小都約為L(zhǎng)Okb;隨后，將擴(kuò)增的第一個(gè)插入序列片段經(jīng)EcoRI/NotI雙酶切回收IS序列，并與經(jīng)EcoRI/NotI雙酶切的實(shí)驗(yàn)室原有的質(zhì)粒載體pEGFP-recA-KET4連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5a，以氨芐青霉素（Ap)和卡那霉素（Km)篩選克隆子，得重組質(zhì)粒pEGFP-IS;用EcoRI和ClaI雙酶切PCR擴(kuò)增的片段后，電泳回收片段，將重組質(zhì)粒pEGFP-IS用EcoRI和ClaI雙酶切，回收；然后將兩回收片段連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliDH5ci，以氨芐青霉素（Ap)和卡那霉素（Km)篩選克隆子，獲得包含有兩個(gè)插入序列、gfp基因、nptll標(biāo)記基因和Ap標(biāo)記基因的螺旋藻整合篩選質(zhì)粒pEGFP-IS-IS-Km;[0038]2)供體質(zhì)粒pEGFP-IS-IS-Km的超聲轉(zhuǎn)化和篩選：用EcoRI酶切pEGFP-IS-IS-Km，獲得線狀質(zhì)粒，兩端各有一個(gè)IS序列，與轉(zhuǎn)座子特征結(jié)構(gòu)類似，超聲轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化螺旋藻869s，以GFP和G418(nptll)篩選出插入突變的螺旋藻株。[0039]本發(fā)明按照設(shè)計(jì)從藍(lán)藻（包括螺旋藻）染色體DNA上PCR擴(kuò)增出轉(zhuǎn)座子IS序列，構(gòu)建了含兩個(gè)插入序列、gfp基因、nptll標(biāo)記基因的供體質(zhì)粒pEGFP-IS-IS-Km。螺旋藻轉(zhuǎn)座子外源基因介導(dǎo)整合篩選系統(tǒng)含有螺旋藻基因整合必須的轉(zhuǎn)座子IS序列，本發(fā)明提高了螺旋藻的轉(zhuǎn)基因效率，為轉(zhuǎn)基因螺旋藻優(yōu)良品種的遺傳改造和選育打下了基礎(chǔ)。[0040]本發(fā)明構(gòu)建了包含gfp基因、nptll標(biāo)記基因及轉(zhuǎn)座子序列的螺旋藻整合篩選系統(tǒng)，以利用轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入突變來影響螺旋藻基因結(jié)構(gòu)進(jìn)而改變螺旋藻品質(zhì)。本發(fā)明可以應(yīng)用于螺旋藻突變文庫的構(gòu)建，還可以進(jìn)行外源基因的導(dǎo)入和表達(dá)，以及螺旋藻內(nèi)源基因的反義抑制調(diào)控?！緦＠綀D】【附圖說明】[0041]圖1為通過轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)系統(tǒng)獲得的不同螺旋藻轉(zhuǎn)化株（顯示有綠色熒光蛋白表達(dá)的螺旋藻絲狀體）。[0042]圖2為通過轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)系統(tǒng)獲得的不同螺旋藻轉(zhuǎn)化株（顯示形態(tài)發(fā)生改變的另外一種螺旋藻轉(zhuǎn)化株）?！揪唧w實(shí)施方式】[0043]下面由實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。[0044]步驟一螺旋藻轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)系統(tǒng)的構(gòu)建[0045]I.1藍(lán)藻轉(zhuǎn)座子序列（IS)的克隆[0046]以第一組為例，其他三組步驟與之相同。根據(jù)NCBI上提供的藍(lán)藻IS基因序列設(shè)計(jì)一組引物IS1-1、IS1-2、IS1-3,其中在IS1-1、IS1-2、IS1-3上分別設(shè)置了NotI、ClaI和EcoRI位點(diǎn)：[0047]ISl-I:5-ATTGCGGCCGCTTTCGACAACGTTA-3[0048]NotI[0049]IS1-2:GATCGATCCCTGGCGGTTCATAGTG[0050]ClaI[0051]IS1-3:5-GGAATTCCTAGGCCACTGACT-3[0052]EcoRI[0053]在0·5ml無菌離心管中依次加入：ddH2037μ1，IOXTaq酶緩沖液5μ1，4XdNTP(2.5mmol/L)4y1，IS1-1引物1μl，ISl-3引物1μ1，模板（銅綠微囊藻6803基因組DNA)1μ1，Taq酶1μ1，總體積50μ1。[0054]PCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)置：94°C預(yù)變性，5min;[0055]然后94°C變性，45s;52°C復(fù)性，45s;72°C延伸，Imin;30個(gè)循環(huán)[0056]最后72°C延伸，8min。[0057]反應(yīng)結(jié)束后，取5μ1進(jìn)行0.8%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在電泳圖譜上出現(xiàn)唯一的一條符合預(yù)期大小的I.OKb片段，將其連接在T載體上并且測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明這個(gè)擴(kuò)增片段就是所要的藍(lán)藻轉(zhuǎn)座子序列片段。同理，PCR擴(kuò)增出含EcoRI和ClaI酶切位點(diǎn)的轉(zhuǎn)座子片段。[0058]1.2重組質(zhì)粒pEGFP-IS的構(gòu)建[0059](1)將以ISl-I，IS1-3為引物，PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)EcoRI和NotI雙酶切后，用膠回收試劑盒回收IS序列，同時(shí)將實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的重組綠色熒光蛋白載體pEGFP-recA-KET4用NotI和EcoRI雙酶切，膠回收較大的DNA載體片段，然后用T4DNA連接酶將IS序列和載體片段在12°C下進(jìn)行過夜連接，轉(zhuǎn)化。[0060]⑵將100μL感受態(tài)細(xì)胞（CaCl2法制備）加入到裝有10μL連接產(chǎn)物的離心管中，混勻，冰浴30min。[0061](3)42°C熱激90s，然后冰浴2min，加入400μL新鮮LB培養(yǎng)基，置37°C搖床復(fù)蘇4〇!1^11，取20(^1^涂平板（含4?10(^8/1111)。37°培養(yǎng)過夜。[0062](4)小量提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，獲得預(yù)期片段。[0063]1.3螺旋藻轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)質(zhì)粒pEGFP-IS-IS-Km的構(gòu)建[0064]用EcoRI和ClaI雙酶切pEGFP-IS，電泳回收較大DNA片段，然后將以IS1-2，IS1-3為引物，PCR擴(kuò)增中獲得的IS序列用EcoRI和ClaI雙酶切，回收DNA片段，然后將兩回收片段進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5a，在具有氨芐青霉素和卡那霉素的培養(yǎng)基上篩選出雙抗的克隆子，并小量提取質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，獲得包含有兩端有插入IS序列、gfp基因、nptll標(biāo)記基因的完整的螺旋藻轉(zhuǎn)化子介導(dǎo)整合質(zhì)粒pEGFP-IS-IS-Km。[0065]步驟二轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化螺旋藻及篩選。[0066]具體操作如下：[0067]在最適條件下培養(yǎng)螺旋藻869s至0D560=0.5?I.0,4000r/min離心收集藻細(xì)胞，更換新鮮的無Mg2+的Zarrouk培養(yǎng)基（并加入2mM/LEDTA)靜置培養(yǎng)2?3天。取20mL藻液，4000r/min離心IOmin,收集藻細(xì)胞，用新鮮Zarrouk培養(yǎng)基洗一次。再低速離心并將藻細(xì)胞懸浮在原體積1/10的新鮮Zarrouk培養(yǎng)基中。分成4管（每管0.5mL)。然后將裝有藻液的Eppendorf管置于冰水浴中，進(jìn)行下列操作：[0068]管1一2:將超聲波破碎儀的探頭插入Eppendorf管中離液面約Icm處，并使之居中不接觸管壁。超聲波處理5?6次，輸出功率為10W，每次10s，間隔20s，鏡檢觀察藻絲斷裂為3?5個(gè)細(xì)胞的短藻絲段，立即加入2?3μg供體質(zhì)粒（質(zhì)粒pEGFP-IS-IS-Km預(yù)先用EcoRI消化成線狀片段），再用相同的參數(shù)超聲處理兩次，每次5?8s，間隔20s。[0069]管3-4:用相同的參數(shù)超聲波打斷藻體，但不加質(zhì)粒，作為空白對(duì)照。[0070]將處理后的管1一4置于冰浴Ih后，各轉(zhuǎn)入2mLZarrouk培養(yǎng)基中，避光孵育過夜。將孵育后的藻液涂布于覆蓋在Zarrouk固體培養(yǎng)基上的Millipore濾膜上（9cm，孔徑0.45μm，Millipore濾膜先用紫外燈滅菌30min)，每個(gè)板涂100μL，正常生長(zhǎng)條件下培養(yǎng)48h。轉(zhuǎn)移濾膜至含200μg/mLAmp和60μg/mlG418的Zarrouk固體培養(yǎng)基上，繼續(xù)培養(yǎng)10?15天后，未加供體質(zhì)粒的對(duì)照板沒有藻落出現(xiàn)，而轉(zhuǎn)化組在含有G418和Amp的抗性平板上長(zhǎng)出綠色藻落，即為轉(zhuǎn)化藻株。[0071]本發(fā)明依據(jù)數(shù)據(jù)庫中已有的轉(zhuǎn)座子IS序列，利用原核藍(lán)藻染色體DNA為模板，用PCR技術(shù)擴(kuò)增出不同的轉(zhuǎn)座子序列，構(gòu)建了包含簡(jiǎn)單轉(zhuǎn)座子IS序列、gfp基因、nptll標(biāo)記基因的供體質(zhì)粒pEGFP-IS-IS-Km，建立了有效的螺旋藻外源基因整合平臺(tái)和篩選系統(tǒng)，以利用轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入突變來影響螺旋藻基因結(jié)構(gòu)進(jìn)而改變螺旋藻品質(zhì)。該方法可以應(yīng)用于螺旋藻突變文庫的構(gòu)建，還可以進(jìn)行外源基因的導(dǎo)入和表達(dá)，以及螺旋藻內(nèi)源基因的反義抑制調(diào)控。[0072]本發(fā)明利用轉(zhuǎn)座子IS序列進(jìn)行螺旋藻外源基因的整合插入，轉(zhuǎn)座子IS序列包括上述例子但不僅僅是上述序列，能在螺旋藻中進(jìn)行轉(zhuǎn)座的序列都包括其中。[0073]通過轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)系統(tǒng)獲得的不同螺旋藻轉(zhuǎn)化株（顯示有綠色熒光蛋白表達(dá)的螺旋藻絲狀體）參見圖1。通過轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)系統(tǒng)獲得的不同螺旋藻轉(zhuǎn)化株（顯示形態(tài)發(fā)生改變的另外一種螺旋藻轉(zhuǎn)化株）參見圖2。由圖1和2可說明，轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)可以在螺旋藻轉(zhuǎn)基因中發(fā)生非定點(diǎn)突變，可以應(yīng)用于藻細(xì)胞突變庫的構(gòu)建和篩選。[0074]本發(fā)明構(gòu)建了有效的螺旋藻轉(zhuǎn)基因的方法。構(gòu)建了包含gfp基因、nptll標(biāo)記基因及轉(zhuǎn)座子序列的螺旋藻整合篩選系統(tǒng)，以利用轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入突變來影響螺旋藻基因結(jié)構(gòu)進(jìn)而改變螺旋藻品質(zhì)。本發(fā)明可以應(yīng)用于螺旋藻突變文庫的構(gòu)建，還可以進(jìn)行外源基因的導(dǎo)入和表達(dá)，以及螺旋藻內(nèi)源基因的反義抑制調(diào)控?！緳?quán)利要求】1.利用轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)外源基因?qū)肼菪宓姆椒?，其特征在于其具體步驟如下：1)以NCBI上已知的藍(lán)藻的序列設(shè)計(jì)多組引物IS1、IS2、IS3、IS4,從藍(lán)藻上克隆出最簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)座子元件即插入序列（IS)，其序列如下：第一組：IS1-1:5-ATTGCGGCCGCTTTCGACAACGTTA-3NotIIS1-2:GATCGATCCCTGGCGGTTCATAGTGClaI151-3:5-GGAATTCCTAGGCCACTGACT-3EcoRI第二組：152-1:5-GATCGATTATACAATAGCCATAC-3ClaIIS2-2:5-TAGCGGCCGCTGGTAGTTGGTTGTG-3NotI152-3:5-ACAGTGAGGAATTCTTAAGAGAACG-3EcoRI第三組：153-1:5-TAGCAATCGATAGAACACTTAGGAC-3ClaIIS3-2:5-T