體外分析技術

關于體外分析技術12定義與分類一、體外放射分析技術：在體外實驗條件下，以特異性結合反應為生物學基礎，以結合反應動力學規(guī)律為共同方法學基礎，利用核射線對體內的各種生物活性物質進行體外定量分析的各種方法。二、分類：1、競爭性體外放射分析法（如RIA）2、非競爭性體外放射分析法（如IRMA）3、由體外放射分析技術派生出來的非放射性標記免疫分析技術（酶、化學發(fā)光、時間分辨熒光分析）第2頁,共46頁，2024年2月25日，星期天3第一節(jié)放射免疫分析法radioimmunoassay，RIA

1959年，美國的兩位科學家Berson和Yalow首次將示蹤技術的高度靈敏性和免疫學抗原-抗體結合的高度特異性結合起來，創(chuàng)立了放射免疫分析技術，開創(chuàng)了生物活性物質微量測定技術的新時代。RIA

的特點：靈敏度高、特異性強、準確度高、穩(wěn)定性好。經不斷改進，現在廣泛應用于臨床檢測和科學研究的很多領域。第3頁,共46頁，2024年2月25日，星期天4一、基本原理競爭性抑制

被測量的微量物質Ag（未標記抗原）和標記有放射性核素的該種物質*Ag(標記抗原)對其抗體Ab有相同的結合能力，反應時，Ag和一定量的*Ag競爭有限量的Ab。生成的*AgAb的量隨Ag的增加而減少，呈負相關關系。反應達到平衡后，分離*AgAb（B）與*Ag（F），B、F或B/F與Ag的量呈函數關系，利用這一函數關系求出待測抗原的的濃度。第4頁,共46頁，2024年2月25日，星期天5反應式第5頁,共46頁，2024年2月25日，星期天6具體方法用一系列濃度已知的標準抗原（濃度遞增的標準品）在嚴格相同的條件下與一定量的*Ag和有限量的Ab共同反應，反應達到平衡后，分離B與F，測定B的放射性做為縱坐標，以每一反應管的標準品濃度為橫坐標，繪成標準曲線。根據被測抗原試管中的B的CPM值在標準曲線上求出該抗原的濃度第6頁,共46頁，2024年2月25日，星期天7函數式第7頁,共46頁，2024年2月25日，星期天8標準曲線第8頁,共46頁，2024年2月25日，星期天9得到的標準曲線之所以是曲線而不是直線，這是可逆反應的質量作用定律決定的。函數式見上圖根據放射免疫分析法的基本原理，建立放射免疫分析必須具備以下技術條件：1、可靠的標準品2、高比活度的標記品3、高親和力的抗體4、合適的分離技術5、理想的曲線擬合方式第9頁,共46頁，2024年2月25日，星期天10二、基本方法（一）基本試劑放射免疫分析反應需要三種基本試劑：

1、標準品（非標記標準抗原）

2、標記抗原

3、抗體第10頁,共46頁，2024年2月25日，星期天111、標準品標準品是樣品定量的基礎，它的質和量的變化直接影響待測樣品的測定值。對標準品的要求如下：1）標準品和待測樣品應屬于同一種物質；2）在與抗體反應時，標準品和待測樣品應有相同的活性和親和能力；3）高度純化，不含有影響分析的雜質；4）對標準品的定量一定要精確第11頁,共46頁，2024年2月25日，星期天122、標記抗原標記抗原是樣品測量的基礎對標記抗原的要求是：

1）比活度和放射化學純度必須足夠高——以保證分析的靈敏度標記抗原的放化純必須不小于95%2）放射性核素的半衰期合適

3）標記抗原的生理活性未改變

4）標記抗原的應有較高的穩(wěn)定性第12頁,共46頁，2024年2月25日，星期天133、抗體在放射免疫分析中，抗體質量的好壞是影響放射免疫分析的關鍵因素之一。高質量的抗體必須具備三個條件：高親和力、高特異性、高滴度第13頁,共46頁，2024年2月25日，星期天141）高親和力只有高親和力的抗體才能得到斜率高的標準曲線，而斜率高的標準曲線是高靈敏度和高精密度的必備條件。親和力測定方法最常用的是Scatchard作圖法（P36）

KA值越大（即直線斜率越大），抗體的親和力越大方法的靈敏度和精密度越高第14頁,共46頁，2024年2月25日，星期天152）高特異性抗體必須與反應系統(tǒng)中抗原以外的物質尤其是抗原類似物結合得少，以免影響分析結果抗體特異性的測定：方法：測抗體的交叉反應率交叉反應率越小，抗體的特異性越高第15頁,共46頁，2024年2月25日，星期天163）高滴度滴度是抗體實際應用時的稀釋倍數抗體的滴度越高，其中的干擾物質的影響就越小。滴度的測定：以一定濃度的*Ag與稀釋度不同的抗體進行反應，當*Ag的結合率為50%時對應的抗體的稀釋度即為該抗體的滴度。這時的抗體濃度就是實際使用時的濃度。

第16頁,共46頁，2024年2月25日，星期天17（二）分離技術1、聚乙二醇（PEG）沉淀法2、雙抗體沉淀法3、雙抗體+PEG法4、葡萄球菌A蛋白（SPA）沉淀法5、活性炭吸附法：葡聚糖包被的活性炭6、微孔濾膜過濾法：玻璃或醋酸纖維濾膜7、磁化分離技術：氧化鐵-活性炭（-抗體）8、固相分離技術：

1）第一抗體與試管聯接

2）第二抗體與試管聯接第17頁,共46頁，2024年2月25日，星期天18（三）數據處理1、logit-log模型2、四參數logistic模型：3、四參數質量作用定律模型U={（A-D）/[1+（X/C）B]}+D其中U為各試驗管結合率（含NSB）A、B、C、D分別為0劑量時的結合率，logit-log函數的斜率，各點實際結合率下降一半時X的量，NSB。第18頁,共46頁，2024年2月25日，星期天19三、質量控制

QualityControl,QC（一）定義：質量控制就是控制誤差，即對分析工作中的誤差進行經常性的檢查，遇有質量異常則及時采取對策，以保證分析誤差控制在可接受的范圍內。放射免疫分析是一類高靈敏度的超微量分析技術，極易受各種因素的影響而使檢測結果失真，因此必須有嚴格的質量控制體系。第19頁,共46頁，2024年2月25日，星期天20（二）誤差的來源1、系統(tǒng)誤差：這種誤差表現為檢測結果呈傾向性的偏高或偏低，常有一些可以確定的因素導致，如：量器不準、試劑不純、標準品的定量不準、儀器狀態(tài)不佳、分離效果不好、不適當的曲線擬合模型等等，系統(tǒng)誤差是通過努力可以消除的。2、隨機誤差：這種誤差多由難以確定且無法控制的原因引起，誤差的出現是隨機的，由各種偶然因素造成，符合正態(tài)分布，如量取液體或分離時的誤差。第20頁,共46頁，2024年2月25日，星期天21（三）實驗室內部質量控制實驗室內部質量控制側重對檢測質量的控制，它保證從收集樣本開始到發(fā)出報告為止的全過程中，能及時發(fā)現檢測過程中出現的各種誤差，分析產生的原因，找出糾正的辦法，以確保檢測的質量。常用以下指標對檢測結果做可靠性評價：精密度、準確度、特異性、靈敏度、穩(wěn)定性、有效性第21頁,共46頁，2024年2月25日，星期天221、精密度（precision）是指在相同條件下對某一樣品多次檢測所得結果的符合程度，即復管的重復性，它是最重要的質量參數。常用精密度圖來評價實驗室內部的精密度水平。2、準確度（accuracy）是指測定值與真值的接近程度，用回收率來評價，回收率是反應測定值偏差的質控指標。3、靈敏度（sensitivity）是指檢測能與零劑量區(qū)分的最小檢測量。累計10次測定結果，計算出零標準管的結合率為X—2SD時對應的劑量值，即為靈敏度。第22頁,共46頁，2024年2月25日，星期天234、特異性（specificity）是指該反應體系不受干擾物質物質影響的程度。常用的指標是交叉反應率。5、穩(wěn)定性（stability）是指測定試劑在合理保存和正確使用條件下，在規(guī)定的有效期內，保持其全部原有性能不變的能力。常用指標有：零標準管結合率（B0%≥20%）、非特異性結合率（NSB%≤5%）、標準曲線上的質控指標等。6、有效性（effectivity）主要指臨床診斷符合率及臨床使用評價，檢測結果在正常和異常之間有良好的區(qū)分，得出可信的結論。第23頁,共46頁，2024年2月25日，星期天24第二節(jié)免疫放射分析

immunoradiometricassay,IRMA免疫放射分析技術是1968年由Miles和Hales創(chuàng)立的，IRMA是非競爭性體外放射分析技術的代表。第24頁,共46頁，2024年2月25日，星期天25一、基本原理用放射性核素標記抗體作示蹤劑，在反應系統(tǒng)中加入過量的標記抗體，抗原與標記抗體進行全量反應，多余的抗體用一定的手段除去，測定復合物的放射性，其活度與待測抗原量正相關。第25頁,共46頁，2024年2月25日，星期天26RIA和IRMA低劑量區(qū)的不確定因素示意圖第26頁,共46頁，2024年2月25日，星期天27IRMA的標準曲線第27頁,共46頁，2024年2月25日，星期天28IRMA的特點1、屬于非競爭性抗原抗體結合反應；2、抗原抗體復合物的與抗原的量正相關3、在低劑量區(qū)不會有不確定因素4、IRMA的非特異性結合對低劑量區(qū)的影響大第28頁,共46頁，2024年2月25日，星期天29二、基本方法1、雙抗體夾心法2、標記第三抗體法3、生物素-親和素系統(tǒng)的應用第29頁,共46頁，2024年2月25日，星期天30第30頁,共46頁，2024年2月25日，星期天31第31頁,共46頁，2024年2月25日，星期天32RIA和IRMA的區(qū)別第32頁,共46頁，2024年2月25日，星期天33體外分析常用檢查項目項目方法及正常值臨床意義T3放免1.0-3.2nmol/l判斷甲狀腺功能及腎病\肝病\

糖尿病\腫瘤心肌梗死等引起的低T3T4綜合征T4放免70-180nmol/l同上FT3放免3.2-9.2pmol/l同上，判斷甲亢復發(fā)及妊娠時甲狀腺功能FT4放免8.2-26pmol/l

同上甲狀腺球放免〈30%甲狀腺自身免疫疾病特異指蛋白抗體標，橋本氏甲狀腺炎第33頁,共46頁，2024年2月25日，星期天34甲狀腺微放免〈20%甲狀腺自身免疫疾病特異指粒體抗體標，橋本氏甲狀腺炎TSH免放0.4-3.1μIU/ml鑒別原發(fā)與繼發(fā)甲低,評價下丘腦-垂體-甲狀腺軸功能,垂體瘤,庫欣綜合征甲狀腺放免4-14.5μg/ml診斷甲癌\慢性淋巴細胞性球蛋白甲狀腺炎/甲亢,尤其監(jiān)測甲癌復發(fā)反T3放免0.5-1.2nmol/l

診斷甲狀腺疾病,對非甲狀腺疾病嚴重程度的判斷\預后\療效觀察均有重要意義,甲減替代治療觀察TSH受體放射受體<9U/l甲亢\甲亢預后,甲亢ATD?？贵w藥指標.判斷甲亢有無復發(fā).第34頁,共46頁，2024年2月25日，星期天35促甲狀腺素放免法43±25pg/ml鑒別原發(fā)和繼發(fā)性釋放激素甲低甲狀旁腺素放免<70.5pmol/l

甲狀旁腺病,判斷骨代謝.

慢性腎衰\甲旁亢\甲旁腺瘤時增高,

甲旁減\高鈣尿癥時減低腫瘤標志物鐵蛋白放免,男25~264μg/l缺鐵性貧血,輔助診斷再障\急女25~264μg/l慢性白血病\惡性淋巴瘤\多發(fā)性骨髓瘤。原發(fā)性肝癌部分升高，腫瘤骨髓、肝、脾轉移時顯著增加前列腺特放免，<2.6μg/l前列腺癌\前列腺肥大\前列腺炎診異抗原斷及療效觀察.前列腺癌時顯著升高,肥大時輕度升高.第35頁,共46頁，2024年2月25日，星期天36CEA放免，<20μg/l結腸\直腸\胃\肺\乳腺惡性腫瘤時動態(tài)升高,對腫瘤診斷\復發(fā)\預后判斷\療效觀察有意義.AFP放免，<25μg/l診斷原發(fā)性肝癌.急慢性活動性肝炎\

胎兒畸形也可升高.可作肝癌手術和化療后預后觀察.NSE放免，<15μg/l小細胞未分化肺癌\腦神經母細胞瘤\神經內分泌腫瘤\腦損傷降鈣素放免，<29.3pmol/l甲狀腺隋樣瘤,早期診斷小細胞肺癌,甲亢時異常升高,判斷腎功能\鈣磷代謝.前列腺酸性放免，<4μg/l前列腺癌時明顯升高,肥大時輕度升高,磷酸酯酶可作前列腺癌療效監(jiān)測.血β2微球放免，<2300μg/l多發(fā)性骨髓瘤\肝胃結腸癌\白血病時蛋白顯著升高.慢性腎炎和腎衰時血濃度升高.第36頁,共46頁，2024年2月25日，星期天37糖類抗原放免<20mg/l腫瘤診斷\預后,放化療及手術后的療CA-50效觀察CA-199放免<37U/ml胰腺癌\膽管癌陽性檢出率高,結腸癌\胃癌\肝癌等輔助診斷和療效隨訪.CA-242放免<25U/ml胰腺癌\肝癌診斷,高特異CA-125放免<35U/ml婦科腫瘤的診斷與鑒別診斷有重要價值CA-153放免<30U/ml乳癌診斷特異,乳癌肝及骨轉移\卵巢癌\

子宮內膜癌一定程度增高腎上腺及腎臟

尿免疫球蛋白放免<8mg/l早期診斷腎臟受損\受損部位及程度判斷尿白蛋白放免<10mg/l同上尿β2微球蛋白放免<230mg/l同上第37頁,共46頁，2024年2月25日，星期天38血漿皮質醇RIA判斷腎上腺皮質\垂體功能.Cushing

上午8時:50~280μg/l綜合征,腎上腺腫瘤、腫瘤、應激午夜:20~80μg/l妊娠、服用避孕藥等增高，腎上腺胰島激素皮質功能減退時減低胰島素放免4~16.8mU/l升高時有利于糖尿病分型診斷C肽放免0.8~4.0μg/l糖尿病分型\治療\判斷預后胰高血糖素放免11~37pmol/l糖尿病\急性低血糖時升高,胰高血糖素瘤時顯著升高.胰島素抗體放免陽性:>5%IDDM早期診斷,胰島素治療糖尿病的療效判斷,評價胰島素產品質量.骨鈣素放免1.8~8.4μg/l判斷骨代謝\骨質疏松情況,了解甲狀腺\甲狀旁腺功能第38頁,共46頁，2024年2月25日，星期天39肝臟急性黃疸型肝炎\慢性活動性肝炎\肝硬化膽酸放免<300μg/dl肝癌\膽汁淤積時明顯升高,慢性遷延性肝炎及膽囊炎輕度升高。妊娠膽淤明顯升高。透明質酸放免<120μg/l肝硬化\肝纖維化\慢性肝炎時升高,肝硬化惡變時顯著升高,可鑒別慢性活動性與遷延性肝炎層粘連蛋白放免<120μg/l同上III型膠原放免<120μg/l同上IV型膠原放免35~65μg/l同上,肝纖維化早期診斷指標丙氨酸氨基轉移酶酶法:5~40U/l肝細胞損害靈敏指標,常見于急性病毒性肝炎\慢性活動性肝炎及其他原因所致肝損害.門冬氨酸氨基轉移酶酶法:8~40U/l同上Γ谷氨酰基轉移酶酶法:男11~50U/l診斷肝膽疾病,原發(fā)性肝癌\

女7~23U/l胰腺癌時增高.第39頁,共46頁，2024年2月25日，星期天40性激素

RIA男:4~87ng/l不孕癥及胎盤功能判斷雌二醇女:24~315ng/lLHRIA男:5~30IU/L性腺功能狀態(tài),睪丸精原細胞癌\原女:卵泡期2~30IU/L發(fā)性閉經,性早熟等排卵期40~200IU/L

黃體期0~20IU/L

絕經期35~210IU/L孕酮RIA男0.35±0.19μg/L妊娠時增高,葡萄胎比正常妊娠時女:卵泡期0.75±0.38μg/L高,先兆流產\絨毛膜上皮細胞癌\

排卵期2.05±1.11μg/L嚴重妊毒癥等降低黃體期11.6±6.7μg/L

絕經期0.31±0.22μg/L第40頁,共46頁，2024年2月25日，星期天41睪酮RIA男:260~1250ng/dl性腺功能判斷.睪丸良性間質細胞瘤女:2~54ng/dl女性男性化腫瘤升高;隱睪炎,垂體\

性腺功能減退.hCGβRIA<3.1μg/L早孕,絨毛膜上皮細胞癌,葡萄胎及療亞單位效觀察,宮外孕,睪丸腫瘤,先兆流產的動態(tài)觀察.垂體催RIA男:6.2~13μg/L下丘腦\,垂體病變,內分泌疾病,惡性乳素女:9~14μg/L腫瘤,腎功能衰竭,生理月經期或泌乳期ACTHRIA原發(fā)性腎上腺皮質功能減退\先天性腎上腺皮質

8AM:2.3~17.9pmol/l增生,異源性分泌\庫欣病升高;繼發(fā)性

4PM:1.7~16.6pmol/l皮質功能減退,皮質腫瘤,醫(yī)源性降低

第41頁,共46頁，2024年2月25日，星期天42生長激素RIA<3.0μg/L巨人癥\肢端肥大癥\低血糖時升高;侏儒癥\垂體前葉功能減退癥\某些激素藥物影響減低FSHRIA男:5~30IU/L

女:卵泡期3~30IU/L性功能狀態(tài),睪丸精原細胞癌,原發(fā)性排卵期12~30IU/L閉經,性早熟等黃體期5~15IU/L

絕經期323~333IU/L抗利尿RIA1~5μg/L腎性尿崩\急性腦出血\肝病\慢性腎激素衰時升高,中樞性或繼發(fā)性尿崩降低消化及其他縮膽囊素RIA5~800ng/L胰腺功能不足\縮膽囊素腹瀉綜合癥\

胃泌素瘤升高;小腸疾病降低.胃動素RIA268~384ng/L胃泌素瘤\VIP瘤\急性感染腹瀉時增高神經降RIA20~60pmol/l消化功能障\惡性腫瘤\精神神經疾病壓素研究P物質RIA11~15pmol/l肝昏迷\胰性霍亂時明顯升高胃泌素RIA<100ng/L診斷胃泌素腫瘤\各種慢性胃炎\惡性貧血\胃酸缺乏\消化性潰瘍.第42頁,共46頁，2024年2月25日，星期天43心鈉素RIA0.15~0.91μg/L慢性心腎功能不全,原發(fā)性醛固酮增多\高血壓\甲亢肝硬化時增高.肌紅蛋白RIA12.7~45.3μg/L急性心肌梗死早期診斷,估計梗死范血清轉運圍及判斷預后及再梗死.鐵蛋白RIARIA2.7~3.88g/L缺鐵性貧血\惡性腫瘤\肝硬化地高辛RIA<2μg/L指示地高辛治療水平,監(jiān)測洋地黃中毒內皮素RIA45±60ng/L心力衰竭\急性心肌梗死\急性腎功能衰竭\高血壓時明顯升高,肝硬化時降低紅細胞RIA15~30U/L高血壓與惡性腫瘤可使EPO升高,慢性生成素腎性貧血時EPO下降血管活RIA10~15pmol/l休克病人VIP大量釋放,血管活性腸肽性腸肽瘤\短腸綜合征\肝功能不良等血清VIP升高.第43頁,共46頁，2024年2月25日，星期天44生長抑素RIA3~17ng/l十二指腸內PH下降SS升高,SS瘤綜合征血清FHbRIA<40mg/l血管內溶血時顯著升高;珠蛋白生成障礙性貧血\自身免