微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)

一、序言1、微生物研究對象：群體2、研究基礎(chǔ)：1）純培養(yǎng)技術(shù)：把特定微生物從自然界混雜存在狀態(tài)中分離、純化出來技術(shù)。

●培養(yǎng)物：在人為要求條件下培養(yǎng)、繁殖得到微生物群體稱為培養(yǎng)物?！窦兣囵B(yǎng)物：只有一個微生物培養(yǎng)物。2）顯微技術(shù)：包含顯微標(biāo)本制作、觀察、測定、分析和記錄。微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第1頁培養(yǎng)基微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第2頁二、微生物操作基本技術(shù)——無菌技術(shù)1、微生物培養(yǎng)慣用器具及其滅菌1）慣用器具：試管、玻璃燒瓶、平皿、接種環(huán)（針）、無菌操作臺、酒精燈等2）滅菌：

●滅菌(sterilization)：殺滅物體上全部微生物方法。即采取強(qiáng)烈理化原因使任何物體內(nèi)、外部一切微生物永遠(yuǎn)喪失其生長繁殖能力辦法。它比消毒要求高，包含殺滅細(xì)菌芽胞在內(nèi)全部病原微生物和非病原微生物。如高溫、輻射、超聲波和激光等。

微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第3頁●消毒(disinfection)：殺死物體上病原微生物方法，并不一定能殺死含芽胞細(xì)菌或非病原微生物。即僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對人體有害病原菌，而對被消毒生物基本無害措施用以消毒藥品稱為消毒劑(disinfectant）●抑菌(bacteriostasis)：抑制體內(nèi)或體外細(xì)菌生長繁殖。常用抑菌劑為各種抗生素?！穹栏?antisepsis)：利用某種理化原因完全抑制霉腐微生物生長繁殖而對被消毒物體基本無害辦法。如低溫、缺氧、干燥、高酸、高滲或防腐劑。細(xì)菌普通不死亡?！駸o菌(asepsis)：不存在活菌。微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第4頁（1）慣用物理消毒滅菌方法

●熱力滅菌法；●輻射殺菌法；●濾過除菌法；●超聲波殺菌法。

A、

熱力滅菌法●干熱滅菌法▲焚燒：廢棄物、尸體；▲灼燒：接種環(huán)、試管口；▲干烤：玻璃器皿；▲紅外線：醫(yī)療器械?！駶駸釡缇á瘢┏合拢骸癜褪舷痉ǎ?1.6-62.8℃30min或71.7℃15-30s,主要用于牛乳消毒?！裰蠓蟹?；微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第5頁巴氏消毒方法有幾個？一個是將牛奶加熱到62-65℃，保持30分鐘。這種方法當(dāng)前在廣東較少使用。采取這一方法，可殺死牛奶中各種生長型致病菌，滅菌效率可達(dá)97.3%-99.9%，經(jīng)消毒后殘留只是部分嗜熱菌及耐熱性菌以及芽孢等，但這些細(xì)菌占多數(shù)是乳酸菌，乳酸菌不但對人無害反而有益健康。第二種方法將牛奶加熱到75-90℃，保溫15-16秒，其殺菌時間更短，工作效率更高。但殺菌基本標(biāo)準(zhǔn)是，能將病原菌殺死即可，溫度太高反而會有較多營養(yǎng)損失。

微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第6頁●間歇蒸汽消毒法：80-100℃15-60min,37℃過夜，循環(huán)三次。主要適合用于不耐熱培養(yǎng)基滅菌。Ⅱ）加壓下：●連續(xù)加壓滅菌：135-140℃下處理5-15s，主要適合用于大規(guī)模發(fā)酵工廠培養(yǎng)基滅菌；●常規(guī)加壓滅菌：121℃（壓力：1kg/cm2或15磅/英寸）15~20min，是一個最為廣泛滅菌方法。▲注意滅菌物體含菌量影響，含菌量越高滅菌時間越長。天然原料＞化學(xué)試劑▲空氣排除程度，必須盡可能驅(qū)盡鍋內(nèi)空氣。是依靠溫度而不是壓力來到達(dá)滅菌目標(biāo)。15磅/英寸：純蒸汽121℃；排除1/2空氣：112

℃；不排除空氣：100

℃。微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第7頁滅菌鍋微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第8頁

▲滅菌對象體積；50ml(12min),ml(30min)▲滅菌對象pH值：pH＜6.0最易死亡；而pH6.0~8.0時，微生物最不易死亡。

▲加熱與散熱速度。B、輻射殺菌法；

●

紫外線：波長200-300nm紫外線含有殺菌作用。其主要作用于DNA，使一條DNA鏈上相鄰兩個胸腺嘧啶共價結(jié)合形成二聚體，造成細(xì)菌變異和死亡。

●電離輻射：高速電子、X射線、γ射線

微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第9頁潔凈工作臺微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第10頁●微波：波長1mm~1mC、過濾除菌法

●賽氏濾器；●玻璃濾器；●薄膜濾器D、超聲波殺菌法

●是一個機(jī)械作用原因，每秒超出2萬次振動聲波即為超聲波。慣用超聲波發(fā)生器能產(chǎn)生20-100千赫聲波?？墒辜?xì)菌細(xì)胞壁裂解而死亡。

微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第11頁超聲儀微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第12頁（2）化學(xué)消毒劑：●消毒劑種類：酚類、醇類、重金屬鹽類、氧化劑、表面活性劑、烷化劑。●消毒劑應(yīng)用：病人排泄物與分泌物、皮膚、粘膜、飲水、廁所、空氣、手。微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第13頁3）接種操作●用接種環(huán)或接種針分離分離微生物或在無菌條件下把微生物由一個培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)接到另一個培養(yǎng)皿進(jìn)行培養(yǎng)。

圖-2-1無菌操作轉(zhuǎn)接培養(yǎng)物無菌操作箱紫外照射30min以上；靠近火焰。微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第14頁三、微生物分離和純培養(yǎng)●菌落：單個微生物在適宜固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部生長繁殖到一定程度能夠形成肉眼可見、有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)子細(xì)胞生長群體，稱為菌落。●菌苔：許多菌落連成一片稱為菌苔?！衽囵B(yǎng)基：培養(yǎng)微生物營養(yǎng)物質(zhì)。慣用有：肉湯、LB培養(yǎng)基等?！窆腆w培養(yǎng)基：用瓊脂或其它凝膠物質(zhì)固化培養(yǎng)基。慣用1.5%瓊脂?！衿桨澹杭磁囵B(yǎng)平板簡稱，它是指熔化固體培養(yǎng)基倒入平皿冷卻凝固后，盛有固體培養(yǎng)基培養(yǎng)皿。微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第15頁一）優(yōu)勢微生物分離純培養(yǎng)1、用固體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)●稀釋倒平板法

缺點：熱敏感細(xì)菌易死亡；影響嚴(yán)格好氧菌生長?！裢坎计桨宸ㄗ⒁猓浩桨宀荒芴梢膊荒芴珴瘢瑫r不能損壞平板。

●平板劃線分離法

★扇形；★連續(xù)劃線；★方格劃線。注意：不能損壞平板。●稀釋搖管法

★適宜于嚴(yán)格厭氧菌；★步驟同稀釋倒平板法。微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第16頁微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第17頁滅菌液體石蠟何固體石蠟混合物微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第18頁2、用液體培養(yǎng)基分離純培養(yǎng)

★適宜于不能在固體培養(yǎng)基上生長微生物如一些細(xì)胞大細(xì)菌、原生動物和藻類；

★最終一個稀釋度95%表現(xiàn)為不生長。二）劣勢微生物分離純培養(yǎng)1、單細(xì)胞分離

★必須借助于低倍顯微鏡（較大微生物）或顯微操作儀

（較小微生物）；

★對操作技術(shù)要求高，多限于高度專業(yè)化科學(xué)研究。

微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第19頁2、選擇培養(yǎng)分離★適宜于從自然界中分離、尋找有用微生物或劣勢生長微生物。1）利用選擇培養(yǎng)基直接分離●原理：依據(jù)待分離微生物特點選擇不一樣培養(yǎng)條件。如分離高溫菌，可在高溫條件下培養(yǎng)；分離某種抗生素抗性菌株可在加有抗生素平板上分離。2）富集培養(yǎng)●原理：利用不一樣微生物間生命活動特點不一樣，制訂特定環(huán)境條件，使僅適應(yīng)于該條件微生物生長（即抑制大多數(shù)微生物生長），從而使其在群落中數(shù)量大大增加，進(jìn)而對其進(jìn)行分離。如分離降解對羥基苯甲酸微生物配置以對羥基苯甲酸為唯一碳源培養(yǎng)基。

微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第20頁★富集培養(yǎng)是分離微生物最強(qiáng)有力伎倆之一。它能夠用來分離培養(yǎng)出由科學(xué)家設(shè)計特定環(huán)境中能生長微生物。微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第21頁三）二元培養(yǎng)物分離●二元培養(yǎng)物：假如培養(yǎng)物中只含兩種微生物，而且有意識地保持其二者之間特定關(guān)系培養(yǎng)物稱為二元培養(yǎng)物。

★適宜于不能或極難得到純培養(yǎng)微生物。

★如病毒是二元培養(yǎng)物保留最有效路徑，因為病毒是細(xì)胞生物嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生物。四）不一樣微生物有不一樣最適方法，在實踐中依據(jù)需要采取其最適方法。微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第22頁四、微生物保藏技術(shù)1）目標(biāo)：為了確保微生物研究和應(yīng)用工作順利進(jìn)行，經(jīng)過分離純化微生物必須經(jīng)過各種保藏技術(shù)保藏。2）要求：不死；不被污染；不變異。3）原理：依據(jù)菌種特征及保藏目標(biāo)不一樣，給微生物以特定條件，使其存活而得以延續(xù)。A：利用培養(yǎng)基或宿主對微生物菌株進(jìn)行連續(xù)接種；B：改變其所處環(huán)境條件如干燥、低溫、缺氧等令菌株代謝水平降低，乃至完全停頓，到達(dá)半休眠或完全休眠狀態(tài)，使其在一定時間內(nèi)得以保留。微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第23頁4）保藏方法（1）傳代培養(yǎng)保藏●類型：瓊脂斜面、半固體瓊脂柱及液體培養(yǎng)基●注意：A，在要求時間內(nèi)接種（普通1個月）B，降低培養(yǎng)物代謝或預(yù)防培養(yǎng)物干燥可延長傳代保藏時間。

●優(yōu)點：使用方便?！袢秉c：

★工作繁瑣；★輕易污染；★易造成菌種衰退。

微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第24頁（2）冷凍保藏●原理：將微生物處于冷凍狀態(tài)使其代謝作用停頓以到達(dá)保藏目標(biāo)（降低溫度）?！穹椒ǎ骸镆旱?196℃）；★-70℃低溫冰箱；★-20℃普通冰箱（溫度越低越好）●注意：盡可能減小冰晶對細(xì)胞（主要是細(xì)胞膜）損傷?！锼賰?；★快速升溫；

★加保護(hù)劑如甘油（可加到15-50%），二甲亞砜。微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第25頁液氮罐微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第26頁

（3）干燥保藏法●原理：干燥使其代謝停頓（降低水分）。●方法：

★沙土管保留：適合用于產(chǎn)孢子微生物如芽孢桿菌、放線菌等。特點：簡便易行，并能夠?qū)⑽⑸镩L久保藏。適合于普通實驗室及以放線菌等為菌種發(fā)酵工廠采取。

★冷凍真空干燥保留：冷凍干燥樣品在真空或惰性氣體密閉環(huán)境中保留，使其生命活動處于休眠，能夠到達(dá)長久保留目標(biāo)。特點：用冰升華除去水分伎倆比較溫和，細(xì)胞受損傷程度相對較小，存活率及保藏效果不錯，同時郵寄和使用方便。它是目前使用最普遍、也是最主要微生物保藏方法。

微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第27頁（4）其它方法

●各種微生物保藏方法還很多，如紙片保藏、薄膜保藏、寄主保藏等。

總之●不一樣微生物對不一樣保藏方法有不一樣適應(yīng)性，迄今還沒有一個方法被證實對全部微生物都適應(yīng)。

●對于一些比較主要微生物菌株，則要盡可能多采取各種不一樣伎倆進(jìn)行保藏，以免因某種方法失敗而造成菌種喪失。微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第28頁Sect2顯微鏡和顯微技術(shù)一、顯微鏡種類及其原理一）光學(xué)顯微鏡

1、普通光學(xué)顯微鏡（lightmicroscope)

●適于觀察染色標(biāo)本

2、暗視野顯微鏡（dark-fieldmicroscope)

●適于觀察細(xì)菌運動性3、相差顯微鏡（phasecontrastmicroscope)

微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第29頁●經(jīng)過特殊光學(xué)裝置——環(huán)狀光闌和相差板，利用光干涉現(xiàn)象，將光相位差轉(zhuǎn)變成肉眼能夠覺察振幅差（明暗差），從而使原來透明物體表現(xiàn)出顯著明暗差異，對比度增強(qiáng)?！襁m于觀察不染色活細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)一些細(xì)微結(jié)構(gòu)。4、熒光顯微鏡（fluorescencemicroscope)

●原理：是紫外線、熒光素（如FITC）、抗體分子（必要時）一起工作顯微鏡。標(biāo)本用用熒光素覆蓋，紫外線直接照射標(biāo)本。紫外線將熒光染料中電子激發(fā)，使之呈高能量水平。然后電子返回到它們初發(fā)能量水平時，經(jīng)過發(fā)射不一樣顏色光來釋放額外能量。

●在免疫學(xué)、環(huán)境微生物學(xué)、分子生物學(xué)中應(yīng)用十分普遍如抗原組織定位等。微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第30頁

普通光學(xué)顯微鏡分辨率為0.25um。普通細(xì)菌都大于0.25um，故可用普通光學(xué)顯微鏡觀察。微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第31頁暗視野顯微鏡微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第32頁相差顯微鏡微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第33頁熒光顯微鏡微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第34頁（一）形態(tài)和染色球狀桿狀螺旋狀基本形態(tài)微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第35頁一、細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及其功效（一）形態(tài)和染色1、球狀

細(xì)胞個體呈球形或橢圓形，不一樣種球菌在細(xì)胞分裂時會形成不一樣空間排列方式，常被作為分類依據(jù)。微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第36頁一、細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及其功效（一）形態(tài)和染色2、桿狀

細(xì)胞呈桿狀或圓柱形，普通其粗細(xì)（直徑）比較穩(wěn)定，而長度則常因培養(yǎng)時間、培養(yǎng)條件不一樣而有較大改變。微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第37頁枯草芽孢桿菌地衣芽孢桿菌微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第38頁銅綠假單胞菌（綠膿桿菌）微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第39頁結(jié)核分枝桿菌Mycobacteriumtuberculosis微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第40頁炭疽病病原菌-------炭疽桿菌微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第41頁破傷風(fēng)梭菌微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第42頁一、細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及其功效（一）形態(tài)和染色3、螺旋狀弧菌螺旋菌螺旋體菌微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第43頁弧菌：菌體只有一個彎曲，其程度不足一圈，形似“C”字或逗號，鞭毛偏端生。蛭弧菌霍亂弧菌微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第44頁螺旋菌：菌體回轉(zhuǎn)如螺旋，螺旋數(shù)目和螺距大小因種而異。鞭毛二端生細(xì)胞壁堅韌，菌體較硬。微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第45頁螺旋體菌：菌體柔軟，用于運動類似鞭毛軸絲位于細(xì)胞外鞘內(nèi)。梅毒密螺旋體微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第46頁個體小:測量單位：微米或鈉米火星隕石中發(fā)覺細(xì)菌化石（直徑10nm）微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第47頁

德國科學(xué)家H.N.Schulz等1999年在納米比亞海岸海底沉積物中發(fā)覺一個硫磺細(xì)菌(sulfurbacterium),其大小可達(dá)0.75

mm，Thiomargaritanamibiensis,---“納米比亞硫磺珍珠”微生物的純培養(yǎng)和顯微技術(shù)第48頁二）、電子顯微鏡1、透射電子顯微鏡（transmissionelectronmicroscope,TEM)●原理：用一束電子作為它能源，電子波長很短，能夠檢測極細(xì)微物體，如病毒和分子?！駪?yīng)用：經(jīng)過細(xì)胞超薄切片，觀察細(xì)胞內(nèi)部詳細(xì)結(jié)構(gòu)如細(xì)胞膜、細(xì)胞核等。（可放大幾萬倍）2、掃描電子顯微鏡（scanningelectronmicroscope,SEM)●原理：類似于電視或電傳真照片。即利用電子“探針”，在樣品表面進(jìn)行“掃描”，激發(fā)樣品表面