獸藥殘留檢測技術(shù)

使用獸藥目標(biāo)防治食品動物疾病促進(jìn)生長提升飼料利用率獸藥殘留檢測技術(shù)第1頁獸藥使用情況據(jù)1966~1974年統(tǒng)計(jì),美國大約已經(jīng)有78%~80%食品動物,在其一生中或多或少服用過藥品。獸藥殘留檢測技術(shù)第2頁獸藥殘留獸藥殘留是指動物性產(chǎn)品任何可食部分含有獸藥母化合物或其代謝物。獸藥最高殘留限量（MRL）：是指某種獸藥而在食物中或食物表面產(chǎn)生最高允許獸藥殘留量（單位μg/kg,以鮮重計(jì)）。獸藥殘留主要是因?yàn)楦鞣N正慣用藥和藥品濫用造成,另外,休藥期過短,是造成動物性食品獸藥殘留過量另一個主要原因。休藥期：是指自末次給藥到動物允許屠宰或其動物性產(chǎn)品（乳、蛋等）獲準(zhǔn)上市間隔時(shí)間。獸藥殘留檢測技術(shù)第3頁獸藥危害引發(fā)過敏、致畸、致突變及致癌等不良反應(yīng)。獸藥殘留檢測技術(shù)第4頁立法為預(yù)防動物性食品中可能出現(xiàn)藥品殘留損害人體健康,1984年在CAC提倡下由聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)聯(lián)合發(fā)起組織了食品中獸藥殘留立法委員會(CCRVDF)。CCRVDF主要宗旨是:為控制食品中獸藥殘留,篩選并建立適合用于全球獸藥及其它化學(xué)物殘留分析方法和取樣方法;對獸藥殘留進(jìn)行毒理學(xué)評價(jià);按制訂世界或地域性法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)(CodexStandart)8個步驟,制訂動物組織及產(chǎn)品中獸藥最高殘留限量(MRL)法規(guī)及休藥期法規(guī)。獸藥殘留檢測技術(shù)第5頁一、常見獸藥按用途分類抗微生物藥抗寄生蟲藥激素類藥品生長促進(jìn)劑抗菌藥：磺胺藥、呋喃類藥、喹諾酮類抗病毒藥：干擾素抗蠕蟲藥抗原蟲藥殺蟲藥抗生素：青霉素、鏈霉素、氯霉素獸藥殘留檢測技術(shù)第6頁1、抗微生物藥抗微生物藥是指對病原微生物(細(xì)菌、真菌、支原體、病毒等)具抑制或殺滅作用,主要有用于全身感染抗生素、磺胺藥及其它化學(xué)合成抗菌藥。獸藥殘留檢測技術(shù)第7頁依據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)可分類為:(1)氨基糖苷類：鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、新霉素、大觀霉素、安普霉素等。(2)

β-內(nèi)酰胺類：青霉素、頭孢菌素等。(3)四環(huán)素類：土霉素、金霉素、多西環(huán)素等。(4)氯霉素類：氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考等。(5)大環(huán)內(nèi)酯類：紅霉素、吉他霉素、泰樂菌素等。(6)林可胺類：林可霉素、克林霉素。(7)多肽類：桿菌肽、黏菌素等。獸藥殘留檢測技術(shù)第8頁(8)多烯類：兩性霉素、制霉菌素等。(9)磺胺類及抗菌增效劑：磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺異唑、磺胺甲基異唑、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺對甲氧嘧啶等。(10)硝基呋喃類：呋喃西林、呋喃他酮、呋喃要因、呋喃唑酮等。(11)喹諾酮類：萘啶酸、吡哌酸、嗯喹酸、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、奧比沙星、沙拉沙星、馬波沙星等。獸藥殘留檢測技術(shù)第9頁2、抗寄生蟲藥抗寄生蟲藥是指能殺滅或驅(qū)除動物體內(nèi)外寄生蟲藥品。畜禽寄生蟲病危害性極大,會給國民經(jīng)濟(jì)造成無法估量巨大經(jīng)濟(jì)損失。寄生蟲病不但引發(fā)大批畜禽死亡,而且嚴(yán)重影響動物生長率,使乳、肉、蛋、毛、革等畜產(chǎn)品質(zhì)量下降,數(shù)量降低。一些人畜共患寄生蟲病,還能直接威脅人類健康和生命安全。獸藥殘留檢測技術(shù)第10頁依據(jù)藥品作用特點(diǎn)，抗寄生蟲藥可分為:(1)抗蠕蟲藥：苯并咪唑類、咪唑并噻唑類、有機(jī)磷酸酯類、四氫嘧啶類、水楊酰苯胺類、阿維菌素類、哌嗪衍生物等。(2)抗原蟲藥：聚醚類離子載體抗生素、三嗪類、二硝基類、氯羥吡啶。(3)殺蟲藥：有機(jī)磷化合物、擬除蟲菊酯類化合物等。獸藥殘留檢測技術(shù)第11頁3、激素與其它生長促進(jìn)劑(1)性激素動物生產(chǎn)中使用性激素,包含雌性激素(如:雌二醇、己烯雌酚(己烷雌酚、甲地孕酮、雌烯酮等)和雄性激素(如:甲基睪丸酮、丙酸睪酮、氯睪酮)。(2)生長激素是由動物腦垂體分泌天然蛋白質(zhì)激素,主要經(jīng)過促進(jìn)蛋白質(zhì)合成和脂肪分解來促進(jìn)動物生長,增加瘦肉率,提升飼料轉(zhuǎn)化率。當(dāng)前在畜牧業(yè)生產(chǎn)中使用主要有牛生長激素(BST)和豬生長激素(PST)。獸藥殘留檢測技術(shù)第12頁(3)甲狀腺素,類甲狀腺素及抗甲狀腺素。(4)人工合成蛋白質(zhì)同化激素人工合成蛋白質(zhì)同化激素可促進(jìn)動物腦下垂體生長激素分泌。與抗生素一樣,伴伴隨激素活性物質(zhì)在畜禽生產(chǎn)中使用種類和數(shù)量不停增加,反對使用呼聲也越來越高。(5)鎮(zhèn)靜劑和β-腎上腺素阻斷劑為了控制被運(yùn)輸及等候屠宰動物擔(dān)心,有些畜牧業(yè)會非法使用鎮(zhèn)靜劑和腎上腺素阻滯劑。因?yàn)樨i對于它們所處環(huán)境突然改變尤其敏感,隨之產(chǎn)生新陳代謝和擔(dān)心會影響肉質(zhì)量。獸藥殘留檢測技術(shù)第13頁二、常見獸藥殘留種類與危害

1.抗生素類藥品多為天然發(fā)酵產(chǎn)物,是臨床應(yīng)用最多一類抗菌藥品,如青霉素類、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、螺旋霉素、鏈霉素、土霉素、金霉素等。獸藥殘留檢測技術(shù)第14頁2.磺胺類藥品主用于抗菌消炎,如磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶,磺胺瞇,菌得清、新諾明等。近年來,磺胺類藥品在動物性食品中殘留超標(biāo)現(xiàn)象,在全部獸藥當(dāng)中是最嚴(yán)重。獸藥殘留檢測技術(shù)第15頁3.硝基呋喃類藥品主用于抗菌消炎,如呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因等。獸藥殘留檢測技術(shù)第16頁4.抗寄生蟲類藥品主要用于驅(qū)蟲或殺蟲,如苯并咪唑、左旋咪唑、克球酚、吡喹酮等。而慣用苯并咪唑類抗寄生蟲藥品有丙硫苯咪唑、丙氧咪唑、噻苯咪唑、甲苯咪唑、丁苯咪唑等。獸藥殘留檢測技術(shù)第17頁5.激素類藥品主要用于提升動物繁殖和加緊生長發(fā)育速度,使用于動物激素有性激素和皮質(zhì)激素。而以性激素(包含各種內(nèi)源性性激素、人工合成類似性激素類固醇化合物、人工合成含有性激素一些特征非類固醇化合物)最慣用,如孕酮、睪酮、雌二醇、甲基睪酮,丙酸睪酮、苯甲酸雌二醇、己烯孕酮等。獸藥殘留檢測技術(shù)第18頁二、食物中獸藥殘留(1)獸藥殘留獸藥殘留是指動物產(chǎn)品任何食用部分所含獸藥母體化合物及其代謝物，以及與獸藥相關(guān)雜質(zhì)殘留。獸藥殘留檢測技術(shù)第19頁(2)獸藥殘留起源在食品動物體內(nèi)或動物性食品中發(fā)覺違章殘留,大都是由用藥錯誤造成,其原因主要有:①不正確地應(yīng)用藥品,如用藥劑量、給藥路徑、用藥部位和用藥動物種類等不符適用藥指示,這些原因有可能延長藥品殘留在體內(nèi)時(shí)間,從而需要增加休藥天數(shù);②在休藥期結(jié)束前屠宰動物;③屠宰前用藥掩飾臨床癥狀,以逃避屠宰前檢驗(yàn);④以未經(jīng)同意藥品作為添加劑飼喂動物;獸藥殘留檢測技術(shù)第20頁⑤藥品標(biāo)簽上使用方法指示不妥,造成違章殘留物;⑥飼料粉碎設(shè)備受污染或?qū)⑹⑦^抗菌藥品容器用于貯藏飼料;⑦接觸廄舍糞尿池中含有抗生素等藥品廢水和排放污水(如豬經(jīng)常攝入這種污水);⑧任意以抗生素藥渣喂豬或其它食品動物等濫用抗生素,是出現(xiàn)抗生素殘留主要原因。獸藥殘留檢測技術(shù)第21頁(3)獸藥殘留種類(形式)第一類是以游離或結(jié)合形式存在原藥及其主要代謝物(除高親脂性化合物外),因代謝和排泄快速,不會在動物體內(nèi)蓄積。但這些物質(zhì)可能含有毒性作用,而且被人攝入后在體內(nèi)可生成高度活化中間產(chǎn)物(親電子基團(tuán)、自由基等),因而對消費(fèi)者含有潛在危害性。第二類是共價(jià)結(jié)合代謝物,因其從機(jī)體排出相對較慢,它們存在對于靶動物有潛在毒性作用,而對于消費(fèi)者,因?yàn)榻Y(jié)合殘留在人體內(nèi)不可能再活化,其生物利用率和含量均低,可能只顯示很低毒性。獸藥殘留檢測技術(shù)第22頁殘留毒理學(xué)意義較大獸藥按其用途分類主要包含:抗生素類、合成抗菌素類、抗寄生蟲類藥、生長促進(jìn)劑和殺蟲劑等?？股睾涂咕亟y(tǒng)稱抗微生物藥品,是最主要獸藥添加劑和獸藥殘留,約占藥品添加劑60%。獸藥殘留檢測技術(shù)第23頁(4)影響食品動物組織中藥品殘留原因經(jīng)內(nèi)服或注射給藥動物,其組織中存在藥品及其代謝物或降解產(chǎn)物殘留。組織中藥品殘留隨藥品種類、劑量、給藥路徑、藥品及其代謝物特征不一樣而異。在有些情況下,飼料也會影響動物組織中藥品殘留,但藥品休藥期執(zhí)行情況是影響組織殘留最主要原因。屠宰后胴體加工過程也是影響藥品殘留檢出率原因之一。烹調(diào)和貯藏溫度亦影響殘留藥品在組織中穩(wěn)定性。獸藥殘留檢測技術(shù)第24頁對于大多數(shù)抗微生物藥來說,藥品從動物體內(nèi)消除屬一級動力學(xué),而大多數(shù)組織中藥品殘留抗微生物活性喪失是一個零級動力學(xué)過程。這表示藥品殘留量越多,它們從食用組織中消除所需時(shí)間就越長。假如藥品添加劑是親脂性,那么它們會蓄積在脂肪組織中,而且其消除速度顯著比親水性藥品慢。實(shí)際上,存在于家禽食用組織、牛肉、羊肉、乳和蛋中藥品殘留種類和發(fā)生率差異較大。這是動物屠宰前或其乳和蛋上市前停頓用藥時(shí)間長短一個反應(yīng)。獸藥殘留檢測技術(shù)第25頁四、獸藥殘留現(xiàn)實(shí)狀況與法規(guī)獸藥殘留主要是因?yàn)椴缓侠硎褂盟幤分委焺游锛膊『妥鳛轱暳纤幤诽砑觿┒l(fā)。1990年出口日本1萬噸肉雞,因?yàn)闄z測出抗球蟲藥氯羥吡啶殘留量超標(biāo),要求我國政府銷毀全部產(chǎn)品,給我國造成很大經(jīng)濟(jì)損失。出口到德國蜂蜜因?yàn)檗r(nóng)藥“殺蟲脒”殘留超標(biāo)而被退貨,接著歐共體、美國、日本也相繼拒絕進(jìn)口我國蜂蜜,使我國蜂蜜在世界市場上銷售發(fā)生嚴(yán)重因難。1998年4月,從內(nèi)地出口到香港生豬,其內(nèi)臟食后造成17人中毒。其原因是內(nèi)臟中含有違禁藥“鹽酸克侖特羅”。另外,我國出口畜禽產(chǎn)品還屢次出現(xiàn)安眠酮類、雌性激素、抗生素等藥品殘留超標(biāo)而被取消出口事件。獸藥殘留檢測技術(shù)第26頁1995年、1996年,歐盟獸醫(yī)委員會派員對我國進(jìn)行了考查和評定,認(rèn)為我國獸醫(yī)衛(wèi)生情況達(dá)不到歐盟要求,于是做出了從1996年8月1日起,禁止從我國進(jìn)口禽肉決定。1997年、1998年歐盟又派員來華考查,結(jié)果仍達(dá)不到其要求。當(dāng)前,我國肉、蛋、奶出口形勢仍相當(dāng)嚴(yán)峻。我國已開始重視動物性食品中獸藥殘留問題,制訂了各種獸藥殘留法律和法規(guī),修訂了《動物性食品中獸藥殘留最高限量標(biāo)準(zhǔn)》,并開始建立了全國范圍獸藥殘留監(jiān)控體系。獸藥殘留檢測技術(shù)第27頁獸藥殘留檢測技術(shù)第28頁第六章獸藥殘留檢測技術(shù)第二節(jié)樣品前處理獸藥殘留檢測技術(shù)第29頁樣品前處理是指樣品制備和對樣品中待測組分進(jìn)行提取、凈化、濃縮過程。樣品前處理目標(biāo)是消除基質(zhì)干擾、保護(hù)儀器、提升檢測方法靈敏度、選擇性、準(zhǔn)確度、精密度。不一樣品前處理方法選擇，需要依據(jù)樣品中危害殘留物質(zhì)特點(diǎn)。殘留分析中樣品主要是各種食用組織(肌肉、脂肪、肝、腎、皮、血液、蛋、奶及其加工食品)?；铙w檢測中普通采集血漿、尿液和糞便;屠宰場主要采集某種藥品靶組織及其它高濃度樣本,如肝、腎、膽汁、注射部位組織等。獸藥殘留檢測技術(shù)第30頁一、生物樣品類型獸藥殘留分析中,最慣用生物樣品是組織樣品,其次是奶、血液和尿液樣品。(1)動物組織肌肉(除去可見脂肪)中水分約占75%,蛋白質(zhì)(肌漿蛋白、肌原蛋白、膠原蛋白和彈性蛋白)占19.0%、脂肪(中性脂肪、脂肪酸和磷脂)占2.5%、糖類1.2%,以及一些無機(jī)鹽、維生素和酶類。肌漿蛋白(肌紅蛋白、糖解酶)可溶于水,肌原蛋白(肌球蛋白、肌動蛋白)溶于濃鹽水,膠原蛋白和彈性蛋白(結(jié)締組織)在上述溶劑中均不溶。獸藥殘留檢測技術(shù)第31頁不一樣種類動物食物組成和肌肉成份,如家禽和牛肌紅蛋白和脂肪含量存在差異,這些改變會影響分析方法回收率或干擾檢測,所以一個動物組織殘留分析方法對其它動物組織樣品不一定適用。比如,用水提取雞肉和牛肉組織中呋喃唑酮,回收率在75%以上;一樣方法提取豬肌肉樣品,回收率僅為10%,改用25%乙腈提取時(shí)回收率顯著提升,推測呋喃唑酮與豬肉中某種蛋白質(zhì)結(jié)合較強(qiáng)。肝或腎組織為代謝或排泄器官,殘留物濃度高,消除遲緩,所以常被作為殘留檢測靶組織。獸藥殘留檢測技術(shù)第32頁(2)尿樣尿液主要成份是水、尿素及鹽類。它是一個良好細(xì)菌培養(yǎng)基,因而需馬上冷藏或防腐處理。冷藏條件普通可置4℃冰箱內(nèi)。若欲在室溫下保留,應(yīng)在搜集尿樣后,馬上加入防腐劑。慣用防腐劑有甲苯、氯仿或改變尿液酸堿性,以抑制細(xì)菌繁殖。加入防腐劑是否干擾測定或與被測組分發(fā)生化學(xué)反應(yīng),應(yīng)由試驗(yàn)驗(yàn)證,方便選取適當(dāng)防腐辦法。獸藥殘留檢測技術(shù)第33頁在全部體液樣品中,尿樣最輕易取得,而且樣品量多,內(nèi)含藥品(母體藥品及代謝物)濃度高;正常尿液中僅含微量蛋白質(zhì),不需去蛋白處理。尿中藥品大多呈結(jié)合狀態(tài),主要以葡萄苷酸和硫酸酯結(jié)合物存在,所以不論直接測定或萃取分離之前,都必須將結(jié)合態(tài)藥品水解,使藥品游離出來。尿樣pH改變范圍大,分析前需調(diào)整到一致pH值。獸藥殘留檢測技術(shù)第34頁(3)血樣血液采集好之后,因?yàn)榧せ盍艘幌盗心蜃?血中纖維蛋白原形成纖維蛋白,血液逐步凝固,上層析出澄清黃色液體稱為血清(serum)。分離血清時(shí),可將凝結(jié)后血液置離心機(jī)中離心,將上層血清轉(zhuǎn)入另外容器中保留,得到血清,普通可占全血量40%左右。獸藥殘留檢測技術(shù)第35頁若采血后馬上將血液轉(zhuǎn)入有抗凝劑(慣用肝素)容器中,并輕輕搖勻,則血液不再凝結(jié),放置后血細(xì)胞會緩緩沉降,1~2h沉降完全,上層黃色液體稱為血漿(plasma)。離心使上層血漿與下層血細(xì)胞充分分離,將血漿轉(zhuǎn)移至另一容器內(nèi)供分析。血液經(jīng)過抗凝取得血漿量,普通比血清稍多,靠近全血量50%。獸藥殘留檢測技術(shù)第36頁獸藥殘留檢測技術(shù)第37頁若抗凝血不離心,保持血漿和血細(xì)胞混合在一起,則稱為全血(wholeblood)。全血樣品可冷凍貯存或直接供分析。全血樣品放置或自貯存處取出解凍之后,可顯著分為上、下兩層,上層為血漿,下層為血細(xì)胞,但輕微搖動即可混勻。血漿和血清化學(xué)成份與組織液相近,測定血漿或血清中藥品濃度,比全血更能反應(yīng)作用部位藥濃改變,測定方法普通也可相互通用。因?yàn)閺目鼓苽溲獫{速度較快,而且分離出血漿量比血清多,所以應(yīng)用血漿比較方便;若血漿中含有抗凝劑對測定有影響,則應(yīng)使用血清樣品。獸藥殘留檢測技術(shù)第38頁通常藥品在血漿中均與血漿蛋白(白蛋白、球蛋白、糖蛋白、脂蛋白)發(fā)生一定程度結(jié)合,一些藥品甚至蛋白結(jié)合率可達(dá)90%以上。所以在萃取之前,必須將結(jié)合態(tài)藥品游離出來。獸藥殘留檢測技術(shù)第39頁(4)奶樣牛奶含水量約87%,蛋白質(zhì)(以酪蛋白為主)為3.3%,脂肪(甘油三酯)為3.7%,糖類(乳糖)為4.7%,以及一些無機(jī)鹽、維生素和酶類(過氧化物酶、脂肪酶等)。奶是一個復(fù)雜非均相體系。乳脂球主要成份為乳脂,表面包以由酪蛋白、類脂、酶、無機(jī)鹽和水分組成膜,使乳球能穩(wěn)定地懸浮在奶中并保護(hù)內(nèi)部乳脂免遭脂肪酶水解,當(dāng)猛烈振蕩時(shí)球膜被破壞,脂肪球即相互黏合析出。奶中還含有大量由酪蛋白或脂蛋白組成膠束體系,當(dāng)酸化或加熱時(shí),膠束結(jié)構(gòu)解體,蛋白質(zhì)沉淀析出。獸藥殘留檢測技術(shù)第40頁非解離性或極性較低藥品易由血漿向奶中擴(kuò)散,造成奶中殘留。與血漿樣品類似,奶中藥品可與蛋白質(zhì)結(jié)合。所以在萃取之前,必須將結(jié)合態(tài)藥品游離出來。獸藥殘留檢測技術(shù)第41頁(5)蛋禽蛋包含蛋黃和蛋清。蛋黃含水量約50%、蛋白質(zhì)16.5%、脂肪33%、糖類0.2%,以及一些無機(jī)鹽、維生素和酶類(淀粉酶、脂肪酶、磷酸酶、肽酶和過氧化氫酶)蛋清含水量達(dá)88%,蛋白質(zhì)10.5%和極少許碳水化合物和脂肪。與蛋清相比較,蛋黃基本上為疏水性環(huán)境,低極性藥品殘留較多。獸藥殘留檢測技術(shù)第42頁假如需要分別測定蛋黃和蛋清中殘留,最好將剛產(chǎn)出后蛋分離蛋黃和蛋清,防止藥品由蛋黃向蛋清擴(kuò)散。與尿液類似,蛋成份pH改變范圍大,分析前需調(diào)整pH值。獸藥殘留檢測技術(shù)第43頁二、樣品制備和貯存樣品制備方法，依據(jù)法規(guī)要求不一樣和食品本身特征差異而不一樣。有要以全樣計(jì),有以脂肪計(jì)。普通來說是取可食部分制備樣品(除非有其它要求)。如對于肉類有國家法枧要求要以脂肪計(jì)算食品安全危害物量,有要求以全樣來計(jì)算。獸藥殘留檢測技術(shù)第44頁為確保取樣準(zhǔn)確性、降低污染和便于保留,對組織樣品宜分取一個完整解剖部分,如一個肝葉或一側(cè)完整腎,小動物應(yīng)摘取完整臟器,并馬上密封。樣品被絞碎或勻漿后進(jìn)行縮分。生物樣品采樣后除馬上分析外,都需要在適當(dāng)條件下保留,目標(biāo)是防止被測組分發(fā)生分解或產(chǎn)生其它化學(xué)改變。獸藥殘留檢測技術(shù)第45頁貯存冷凍保留是最慣用方法,普通冷凍溫度為-20℃,此時(shí)生物樣品如血漿、尿液和組織樣品均被凍凝,能夠終止樣品中酶活性,又能夠貯存樣品。在一些情況下若搜集樣品來不及冷凍處理,可先將其置冰屑中,然后再行冷凍貯存,臨用前再融化并放至室溫后供測定。獸藥殘留檢測技術(shù)第46頁對于一些易代謝藥品,如磺胺類、聚醚類、同化激素,它們肝和腎臟樣品不宜長久存放,理想冷凍溫度應(yīng)為-40℃~-80℃

。為預(yù)防含酶樣品中被測組分深入代謝,采樣后必須馬上終止酶活性。常采取方法有:液氮中快速冷凍、微波照射、勻漿及沉淀、加入酶活性阻斷劑(通常加入氟化鈉)等。一些生物樣品中藥品易被空氣氧化,如兒茶酚類中阿樸嗎啡,含有鄰苯二酚結(jié)構(gòu),易被空氣氧化產(chǎn)生醌類雜質(zhì),若搜集血漿樣品不加抗氧劑直接在-15℃冷藏,僅能穩(wěn)定4周;但加入抗壞血酸后,則可穩(wěn)定10周。獸藥殘留檢測技術(shù)第47頁冷凍時(shí),若使用玻璃容器貯存樣品,需注意預(yù)防溫度驟降使容器破裂,造成樣品損失或污染。而塑料容器常含有高沸點(diǎn)增塑劑,可能釋放到樣品中造成污染,而且還會吸留一些藥品,引發(fā)分析誤差。一些藥品尤其是堿性藥品還會被玻璃容器表面吸附,影響樣品中藥品定量回收,所以,必要時(shí)應(yīng)將玻璃容器進(jìn)行硅烷化處理。獸藥殘留檢測技術(shù)第48頁三、樣品均勻化對于血漿、奶、尿液樣品,可置渦旋混合器上混勻,以免造成測定誤差。對于肌肉、組織、糞便等半固體樣品都存在均勻化這一問題。其中肌肉和組織樣品可置勻漿機(jī)中均質(zhì),糞便樣品可加入少許甲醇或其它液體攪勻。同時(shí)還應(yīng)注意取樣代表性問題。獸藥殘留檢測技術(shù)第49頁四、去蛋白處理生物樣品如肝臟、腎臟、血漿等含有大量蛋白質(zhì),它們能結(jié)合藥品,所以對于一些藥品測定,必須先將與蛋白結(jié)合藥品游離之后再作深入處理。為何要除去蛋白？？因?yàn)樯飿悠泛写罅康鞍踪|(zhì),蛋白質(zhì)在測定過程中會形成泡沫、渾濁或出現(xiàn)沉淀而干擾測定。蛋白質(zhì)還會污染儀器或惡化測定條件,如直接進(jìn)樣用液相色譜分析含蛋白質(zhì)體液樣品時(shí),蛋白質(zhì)會沉積在色譜柱上,這不但影響柱效,而且大大縮短色譜柱使用壽命。當(dāng)前已經(jīng)有很多去蛋白方法可供使用,但使用各種方法之前應(yīng)了解該方法是否會造成生物樣品中藥品發(fā)生分解或影響藥品提取等。注意方法選擇獸藥殘留檢測技術(shù)第50頁通常去蛋白過程是將蛋白質(zhì)變性處理后,把與蛋白結(jié)合藥品解離出來,離心分離以除去蛋白。通常除蛋白方法是在含蛋白樣品中加入適當(dāng)沉淀劑或變性劑,使蛋白質(zhì)脫水而沉淀(如有機(jī)溶劑、中性鹽),有是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)形成不溶性鹽而析出(如一些酸類:三氯醋酸、高氯酸、磷酸、苦味酸),離心后取上清液用于分析。獸藥殘留檢測技術(shù)第51頁1、有機(jī)溶劑沉淀甲醇、乙腈、丙酮和乙醇是沉淀蛋白慣用有機(jī)溶劑,尤以甲醇和乙腈為最慣用。甲醇與蛋白形成絮狀沉淀易于離心分離,得到澄清上清液;乙腈與蛋白形成致密沉淀,易離心除去,沉淀效率較甲醇高。使用時(shí)應(yīng)加入足量沉淀劑,通常加入量為樣品體積1.5~2倍。獸藥殘留檢測技術(shù)第52頁2、酸性沉淀慣用酸性沉淀劑有三氯醋酸和高氯酸,其它還有鎢酸、鉬酸、磷鎢酸、磷鉬酸和苦味酸等。酸性沉淀劑能同蛋白質(zhì)陽離子形成不溶鹽而沉淀,必要條件是溶液pH要低于蛋白等電點(diǎn)。加入沉淀劑之后馬上形成白色沉淀(必要時(shí)可加熱使沉淀完全),離心后可得到澄明上清液。獸藥殘留檢測技術(shù)第53頁三氯醋酸(慣用10%溶液)沉淀蛋白作用很強(qiáng),所以最常使用,但應(yīng)注意試劑中含有雜質(zhì),將它們引入離心后上清液中,可能會干擾藥品分析。其次應(yīng)注意,當(dāng)上清液再用乙醚等有機(jī)溶劑萃取時(shí),三氯醋酸則連同溶入其內(nèi)雜質(zhì)會進(jìn)入有機(jī)相,也可能干擾藥品分析。采取高氯酸作為蛋白沉淀劑時(shí),其優(yōu)點(diǎn)是殘留在上清液中ClO4-可加入鉀鹽除去。獸藥殘留檢測技術(shù)第54頁3、無機(jī)鹽沉淀一些無機(jī)鹽如硫酸銨、硫酸鈉和氯化鈉等,能使蛋白質(zhì)膠體脫水并中和其電荷,使蛋白質(zhì)失去膠體性質(zhì)而沉淀下來。無機(jī)鹽中以硫酸銨最慣用。慣用重金屬鹽類有汞鹽、銅鹽和鋅鹽等,它們能與蛋白質(zhì)形成不溶鹽而沉淀析出。如可用HgCl2作為蛋白沉淀劑處理血漿樣品,離心后用比色法測定上清液中水楊酸濃度。采取蛋白沉淀劑,只要加入足量,普通可除去98%以上蛋白。蛋白沉淀后是否與之相結(jié)合藥品能游離釋出,當(dāng)前尚缺乏系統(tǒng)研究資料,僅觀察到少數(shù)現(xiàn)象。獸藥殘留檢測技術(shù)第55頁4、透析法透析法與超濾法也是除去樣品中蛋白方法。透析法很費(fèi)時(shí),溶質(zhì)透過膜程度與被測物性質(zhì)、溫度相關(guān),膜需經(jīng)常更新,極難自動化,所以透析法普通不用于常規(guī)分析,而用于藥品在生物樣品中蛋白結(jié)合率研究。獸藥殘留檢測技術(shù)第56頁5、超濾法超濾法是另一個除去樣品中蛋白和其它大分子方法,也是一個薄膜分離技術(shù)。與蛋白沉淀法相比,其優(yōu)點(diǎn)是適合用于小量樣品,不稀釋試樣,也不改變試樣pH,尤其適于含對酸堿不穩(wěn)定化合物樣品,用于樣品濃縮、脫鹽、不一樣分子尺寸分離。假如待測物易被某種酶分解,那么超濾除去該酶后就防止了待測物分解。在殘留分析中超濾法慣用于牛奶、血液中游離藥品濃度和藥品-血漿蛋白結(jié)合率測定。超濾法缺點(diǎn)是待測物可能被結(jié)合在濾膜上而影響回收率,而且一些能與大分子蛋白結(jié)合藥品也會伴隨蛋白質(zhì)被除去而丟失。獸藥殘留檢測技術(shù)第57頁五、冷凍干燥冷凍干燥是貯存和預(yù)處理一些生物樣品有效方法,適合于處理量大樣品。比如,一些樣品中所含藥品水溶性很強(qiáng)(不輕易被有機(jī)溶劑萃取),可凍干后再進(jìn)行液-固萃取。凍干法也適合用于一些含揮發(fā)性藥品樣品以及對熱不穩(wěn)定樣品。另外,還有一些生物樣品中藥品需進(jìn)行衍生化,若采取常規(guī)液-液萃取,在一定溫度下?lián)]發(fā)去有機(jī)溶劑后再進(jìn)行衍生化,則在加熱過程中會造成藥品分解或隨溶劑一起揮發(fā),所以也宜將這些樣品經(jīng)凍干處理后再行衍生化。獸藥殘留檢測技術(shù)第58頁生物樣品凍干時(shí),可先將其置干冰-丙酮浴中、液氮中或其它低溫條件下,半固體樣品如糞便、組織等冷凍時(shí)間約1~10min。冷凍后水分在樣品表面形成“冰殼”,增加了揮發(fā)面積,再將其放入凍干機(jī)內(nèi)減壓,冰則直接升華,和其它揮發(fā)性雜質(zhì)一起被除去,使樣品干燥。凍干后樣品通?？芍苯蛹尤胗袡C(jī)溶劑萃取。凍干時(shí)應(yīng)注意一些揮發(fā)性強(qiáng)藥品可能揮發(fā)損失。操作步驟獸藥殘留檢測技術(shù)第59頁六、結(jié)合物水解以結(jié)合狀態(tài)存在藥品大多存在于尿中,但也存在于肝臟和血液中。慣用結(jié)合物水解方法有:(1)酸水解酸水解通常使用無機(jī)酸,如尿樣中結(jié)合物水解可加入適量鹽酸液。加入鹽酸濃度、酸化時(shí)間以及是否需要加熱等,隨藥品而異,但最終應(yīng)經(jīng)過試驗(yàn)確定。水解后樣品呈強(qiáng)酸性,必要時(shí)可用堿液調(diào)整pH后再進(jìn)行萃取。藥品在體內(nèi)經(jīng)代謝反應(yīng)之后,形成葡糖苷酸及硫酸酯等結(jié)合物獸藥殘留檢測技術(shù)第60頁(2)酶水解酶水解是專一性很強(qiáng)水解結(jié)合物方法。通常使用水解酶是β-葡糖苷酸酶或芳基硫酸酯酶,前者可專門水解藥品葡萄糖醛酸苷,后者水解藥品硫酸酯。也可用二者混合物,將生物樣品中藥品葡萄糖醛酸苷及硫酸酯同時(shí)水解。尿液中通常存在以上兩種結(jié)合物,所以混合酶水解法含有實(shí)用價(jià)值。獸藥殘留檢測技術(shù)第61頁(3)溶劑解一些藥品或內(nèi)源化合物硫酸酯,可隨加入萃取溶劑,在萃取過程中發(fā)生分解,通常稱為溶劑解。溶劑解也是分解結(jié)合物較溫和一個方法。獸藥殘留檢測技術(shù)第62頁七、樣品提取和凈化1、液-液萃取液-液萃取是經(jīng)典提取方法之一,它基于被測組分在不相溶兩種溶劑中分配。與其它方法相比,液-液萃取法仍是當(dāng)前最慣用樣品處理方法,其原因是:①經(jīng)過萃取可將被測組分自大量內(nèi)源性物質(zhì)中分離出來,降低雜質(zhì)對測定干擾;②操作簡單快速、經(jīng)濟(jì)實(shí)用;③可將萃取液蒸發(fā),使組分富集;④可一次進(jìn)行同類組分萃取。提取→凈化→濃縮→色譜分析獸藥殘留檢測技術(shù)第63頁液-液萃取溶劑選擇液-液萃取慣用有機(jī)溶劑有甲醇、乙腈、丙酮、氯仿、二氯甲烷、四氯化碳、乙醚、叔丁基甲醚、乙酸乙酯、苯、甲苯、正己烷。溶劑選擇應(yīng)注意以下幾點(diǎn):①溶劑極性，依據(jù)相同相溶原理,極性組分易溶于極性溶劑,反之亦然,應(yīng)依據(jù)被測組分極性選擇相同極性溶劑。實(shí)際萃取被測組分時(shí),還常于萃取溶劑中加人第二種溶劑,以調(diào)整極性,使到達(dá)選擇性萃取。獸藥殘留檢測技術(shù)第64頁②溶劑沸點(diǎn)，萃取分離后有機(jī)相通常需置溫水浴中通壓縮空氣(或氮?dú)?使揮發(fā),將被測組分濃集,所以萃取溶劑沸點(diǎn)就不應(yīng)靠近或高于水沸點(diǎn),不然揮發(fā)困難。③溶劑毒性，使用對人體有害溶劑萃取時(shí),應(yīng)在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行。在慣用溶劑中,乙酸乙酯既安全又無毒,對不一樣極性被測組分都有較高萃取回收率,又易于揮發(fā),萃取物中混入內(nèi)源雜質(zhì)量少,是較理想首選溶劑。獸藥殘留檢測技術(shù)第65頁④溶劑與水互溶性有溶劑如乙醚,萃取后可混入大約1.2%水分,所以伴隨帶入一些水溶性雜質(zhì)。乙醚萃取能力強(qiáng),又易于揮發(fā)濃縮,為慣用萃取溶劑,除去混入水分方法是加入無水Na2SO4脫水,降低混入水溶性雜質(zhì)量。萃取時(shí)于水相中加入有機(jī)相后,普通只萃取一次。特殊情況下(如雜質(zhì)不易除去),則必須將第一次萃取分出含藥有機(jī)相,再用一定pH水溶液反萃取,最終再從水相將藥品萃回到有機(jī)相中。獸藥殘留檢測技術(shù)第66頁萃取溶劑與水百分比萃取過程中加入有機(jī)溶劑并非越多越好,而應(yīng)適量。普通有機(jī)相與水相容積比以1:1或2:1為佳,據(jù)被測組分性質(zhì)及方法需要,有時(shí)也增加有機(jī)相百分比。另外,萃取時(shí)若往水相中加入少許比重大有機(jī)溶劑(如氯仿),而該溶劑對藥品溶解度又比較大,則可將藥品從水相中濃集于小體積有機(jī)相中,若萃取時(shí)使用是尖底試管,則富含藥品有機(jī)相沉積于管尖部位,可直接取樣分析,或?qū)⑵浞蛛x出來。獸藥殘留檢測技術(shù)第67頁離子對試劑一些酸性或堿性較強(qiáng)有機(jī)藥品在體液中呈離解狀態(tài),成為親水性極強(qiáng)帶電荷離子,即使控制pH也不能抑制它們電離,不能用有機(jī)溶劑將其自體液中提取出來。對于上述呈離解狀態(tài)藥品,可加入離子對試劑,使它們形成含有一定脂溶性離子對絡(luò)合物,用有機(jī)溶劑將其從水相中萃取出來。陽離子藥品配正確離子對試劑則為陰離子,其中以烷基磺酸鹽類(RSO3H)為最慣用。獸藥殘留檢測技術(shù)第68頁陰離子藥品配正確離子對試劑主要為烷基季銨類化合物,可用通式R4N+·X-表示,X-可為酸根或氫氧基,R為烷基。烷基碳鏈長度慣用C4~C12,甚至可選取C20,碳鏈越長，則生成離子對絡(luò)合物脂溶性越高。慣用烷基季銨中有四丁基銨、四戊基銨等,商品試劑慣用其鹽,如磷酸四丁基銨、硫酸氫四丁基銨,或?yàn)槠錃溲趸瘔A,如氫氧化四丁基銨。獸藥殘留檢測技術(shù)第69頁注意事項(xiàng)：液-液提取有時(shí)會發(fā)生乳化現(xiàn)象以及被測組分損失。為了預(yù)防乳化,可應(yīng)用較大致積有機(jī)溶劑,防止猛烈振搖或加入適當(dāng)試劑改變其表面張力而破乳,若已發(fā)生嚴(yán)重乳化現(xiàn)象,可將試管置于冰箱中冷凍破乳。萃取過程中所用玻璃容器壁對一些藥品吸附是不可忽略,尤其是當(dāng)藥品濃度較低時(shí)更是如此。除對萃取所用器具進(jìn)行硅烷化處理以外,還常在萃取劑中加入異戊醇。異戊醇能降低玻璃壁吸附,還可降低萃取過程中乳化形成。也能夠加入二乙胺,二乙胺能顯著降低吸附作用,提升萃取回收率。獸藥殘留檢測技術(shù)第70頁2、固相萃取(SPE)固相萃取法(Solidphaseextraction,SPE)是近十幾年快速發(fā)展起來一個樣品預(yù)處理技術(shù),它是以液相色譜分離機(jī)制為基礎(chǔ)建立起來分離和純化方法。固相分離有兩種實(shí)現(xiàn)樣品純化路徑。一個是保留雜質(zhì),待測組分不被保留而自然流出或者被洗脫;更為慣用一個路徑是先使待測物完全保留在柱上,使干擾雜質(zhì)隨樣品溶劑或洗滌液洗出,然后以小體積溶劑洗脫待測物。獸藥殘留檢測技術(shù)第71頁優(yōu)點(diǎn)：與經(jīng)典液-液萃取法相比,固相萃取優(yōu)點(diǎn)有:①快速,普通l~2min即可完成;②回收率高,通常超出90%;③精密度比很好;④樣品用量少,有一定選擇性,無乳化現(xiàn)象等。獸藥殘留檢測技術(shù)第72頁SPE柱SPE柱能夠是一個玻璃(或塑料)小柱,裝入適當(dāng)填料(固相提取劑),自制固相萃取柱填充疏松,溶劑能自然流出?，F(xiàn)在已經(jīng)有許多不一樣形式商品化固相萃取柱,大多數(shù)商品化柱都是聚丙烯管型柱,底部壓縮裝入100~500mg填料。使用時(shí)將液體樣品從柱上口加入,樣液經(jīng)過固相萃取柱下端流出,液體樣品經(jīng)過柱子時(shí)必須施加外力,可在柱下端出口處減壓,或于柱上口加壓,使樣液經(jīng)過柱床,柱下端流出液可用另一支試管搜集。獸藥殘留檢測技術(shù)第73頁固相萃取裝置和操作過程獸藥殘留檢測技術(shù)第74頁SPE采取固定相與液相色譜慣用固定相類型相同,慣用固定相有活性炭、硅膠、氧化鋁等吸附劑、高分子大孔樹脂、離子交換樹脂和鍵合硅膠等。鍵合硅膠固相提取普通操作步驟以下:①以適當(dāng)強(qiáng)溶劑濕潤固相萃取柱使其溶劑化;②以弱溶劑通常是水或緩沖溶液洗滌固定相,使其到達(dá)良好分離狀態(tài);③將溶于弱溶劑常是緩沖溶液中樣品加到固相提取柱上;④以強(qiáng)度適當(dāng)弱溶劑,如含有少許甲醇水或緩沖溶液洗滌、除去基質(zhì)或干擾組分;⑤用強(qiáng)度較高溶劑洗脫待測組分,搜集洗脫液,直接或適當(dāng)濃縮后進(jìn)行色譜分析。獸藥殘留檢測技術(shù)第75頁選擇SPE柱選擇SPE固定相時(shí),主要依據(jù)兩個原因:需要提取溶質(zhì)和樣品溶劑。（1）溶質(zhì)極性：分析物極性與固定相極性非常相同時(shí)得到分析物最正確保留。二者極性越相同保留越好以要盡可能選擇極性相同固定相。比如萃取碳?xì)浠衔铮ǚ菢O性）要采取反相柱（非極性）。當(dāng)分析物極性適中時(shí)、反相固定相都可使用。獸藥殘留檢測技術(shù)第76頁（2）溶劑強(qiáng)度固定相選擇還受樣品溶劑強(qiáng)度制約。樣品溶劑強(qiáng)度相對該固定對應(yīng)該較弱溶劑會增強(qiáng)分析物在吸附劑上保留。假如溶劑太強(qiáng)得不到保留或保留很弱。舉例：樣品溶劑是正己烷時(shí)，反相柱就不適當(dāng)，因?yàn)檎和槭菑?qiáng)溶劑，分析物不會有保留；當(dāng)樣品溶劑是水時(shí)，能夠用反相柱，因?yàn)樗侨跞軇挥绊懛治鑫锉Ａ?。獸藥殘留檢測技術(shù)第77頁（3）其它原因其它還應(yīng)該考慮以下幾點(diǎn)：①分析物在極性或非極性溶劑中溶解度；②分析物有沒有可能離子化，從而決定可否用離子交換固定相；③分析物有沒有可能與固定相形成共價(jià)鍵；④不要組分與分析物在固定相結(jié)合點(diǎn)上競爭程度。獸藥殘留檢測技術(shù)第78頁3、基質(zhì)固相分散技術(shù)（MSPD）基本操作：將樣品(固態(tài)或液態(tài))直接與適量反相鍵合硅膠一起混合研磨，使樣品均勻分散于固定相顆粒表面，制成半固態(tài)裝柱，然后后采取類似于SPE操作進(jìn)行洗脫。所用填充料普通為C18或C8，樣品和填充料百分比通常為1:4。獸藥殘留檢測技術(shù)第79頁MSPD是一個在SPE基礎(chǔ)上改進(jìn)后樣品處理方法，相對于SPE法，它優(yōu)點(diǎn)在于：依靠機(jī)械剪切力、C18鍵合相去垢效應(yīng)和巨大表面積，使樣品結(jié)構(gòu)破碎而且在填料表面均勻分散，濃縮了傳統(tǒng)樣品前處理中所需樣品勻化、組織細(xì)胞裂解、提取、凈化等過程，防止了樣品勻化、轉(zhuǎn)溶、乳化、濃縮造成待測物損失，而且固定相處理樣品比容量大，提取凈化效率較高。MSPD處理樣品耗時(shí)短、節(jié)約溶劑、樣品用量少，該方法已被用于近40種獸藥殘留分析。獸藥殘留檢測技術(shù)第80頁4、柱切換技術(shù)柱切換技術(shù)是色譜分析中處理復(fù)雜樣品方法之一。利用切換閥改變不一樣色譜系統(tǒng)，到達(dá)在線樣品凈化、組分富集等目標(biāo)。此法慣用一個長3~5cm，填以粒徑25~40μm填料（類型取決于待測物保留能力）預(yù)柱，經(jīng)過切換閥與分析柱連接。進(jìn)樣后流動相Ⅰ攜帶樣品進(jìn)入色譜柱，被測組分保留于預(yù)柱上，而雜質(zhì)則隨流動相Ⅰ作為廢液流出。然后按預(yù)先設(shè)定程序改變切換閥流路，將流動相Ⅱ引入預(yù)柱中，流動相Ⅱ洗脫出被測組分隨即進(jìn)入分析柱，經(jīng)分離后進(jìn)入檢測器檢測。獸藥殘留檢測技術(shù)第81頁柱切換法優(yōu)點(diǎn)①操作簡單，全自動化，含蛋白樣品可直接進(jìn)樣或簡單地沉淀蛋白離心后即可進(jìn)樣；②分析結(jié)果精密度高，普通無需內(nèi)標(biāo)，進(jìn)樣體積普通為0.2~1.0mL（血漿、血清因黏度較大，需稀釋后進(jìn)樣），在線處理全過程由計(jì)算機(jī)程序控制，每個樣品在同一預(yù)柱相同條件下處理，分析結(jié)果RSD普通小于5%。③適于不穩(wěn)定樣品，如易光解、熱不穩(wěn)定樣品分析，全部過程在封閉狀態(tài)下進(jìn)行，防止了分離、濃縮等操作；④富集作用，提升了檢測靈敏度，尤其是極性較大組分，無法用液-液萃取時(shí)，柱切換技術(shù)尤其奏效。獸藥殘留檢測技術(shù)第82頁5、超臨界流體萃?。⊿FE）超臨界流體萃取是一個較新樣品預(yù)處理技術(shù)，以超臨界流體（慣用二氧化碳）作為提取溶劑。超臨界流體性質(zhì)如密度、粘度和擴(kuò)散性等處于氣體和液體之間，而且與溫度、壓力和流體組成相關(guān)。密度越高,其性質(zhì)越靠近液體;密度越低,其性質(zhì)越靠近氣體。超臨界流體既能溶解各種氣體不溶解物質(zhì),又有氣體黏度小、滲透力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),能夠快速、高效地將被測物從樣品中萃取出來。獸藥殘留檢測技術(shù)第83頁超臨界二氧化碳萃取流程圖二氧化碳液體由高壓泵輸入處于恒溫預(yù)熱管中轉(zhuǎn)化為超臨界流體并進(jìn)入樣品管進(jìn)行萃取。萃取物隨流體經(jīng)過限流管降溫后進(jìn)入有少許填料吸收管內(nèi),最終被搜集瓶搜集。超臨界流體萃取過程大致可分為下面三步:①待測物質(zhì)從樣品基質(zhì)中釋放出來并擴(kuò)散、溶解進(jìn)入超臨界流體中；②待測物質(zhì)從萃取器轉(zhuǎn)移至搜集系統(tǒng)；③降低超臨界流體壓力，有效地搜集被萃取待測物。獸藥殘留檢測技術(shù)第84頁對于極性較大或者離子型化合物,可選擇氨等萃取劑。壓力改變能夠改變超臨界流體對物質(zhì)溶解度,所以采取程序升壓就能夠把溶解度從大到小物質(zhì)先后從樣品中分離出來。依據(jù)被萃取物溶解度大小,能夠采取動態(tài)、循環(huán)和靜態(tài)不一樣操作方法。動態(tài)法是讓流體一次經(jīng)過樣品,這種方法適合溶解度較大樣品。靜態(tài)法是將樣品在流體中浸泡一段時(shí)間后,再使被萃取物從樣品中分離出來。循環(huán)法是讓一定量流體循環(huán)屢次經(jīng)過樣品,循環(huán)法既能夠萃取難溶物質(zhì)同時(shí)又比靜態(tài)法萃取速度快。獸藥殘留檢測技術(shù)第85頁6、固相微萃?。⊿PME）固相微萃取原理與SPE不一樣，是建立在待測物在固定相和水相之間達(dá)成平衡分配基礎(chǔ)上。其樣品前處理和操作也有很大差異。固相微萃取采取熔融石英光導(dǎo)纖維為固相吸附劑,將其浸泡在樣品溶液中時(shí),樣品中有機(jī)物被吸附在光導(dǎo)纖維表面。吸附平衡后經(jīng)過加熱可使被吸附物質(zhì)解吸,被解吸物質(zhì)可伴隨載氣流入氣相色譜儀進(jìn)行分離測定。獸藥殘留檢測技術(shù)第86頁光導(dǎo)纖維是裝在類似于微量注射器固相微萃取針頭內(nèi),針頭起著導(dǎo)向和保護(hù)光導(dǎo)纖維不被折斷作用。萃取時(shí)將針頭浸入被萃取液中,吸附平衡后再插入氣相色譜進(jìn)樣口。光導(dǎo)纖維吸附量和原始液濃度有一定關(guān)系。所以固相微萃取是一個簡便、快速、無溶劑前處理技術(shù)。獸藥殘留檢測技術(shù)第87頁固相微萃取法被廣泛地應(yīng)用于樣品分析中。包含固態(tài)(如沉積物、土壤等)、液態(tài)(地下水、地表水、飲用水、廢水)及氣態(tài)(空氣及廢氣)中鹵代烴(包含鹵代芳烴)、有機(jī)氨農(nóng)藥、多環(huán)芳烴、胺類化合物以及石油類等。已經(jīng)有大量應(yīng)用文件報(bào)道。獸藥殘留檢測技術(shù)第88頁7、免疫親和色譜IAC免疫親和色譜(Immμno-afinitychromatograplly,IAC)是以抗原抗體特異性、可逆性免疫結(jié)合反應(yīng)為原理色譜技術(shù),其基本過程為將抗體與惰性基質(zhì)(如珠狀瓊脂糖、鍵合相硅膠)偶聯(lián)制成固定相,裝柱。當(dāng)含有待測組分樣品經(jīng)過IAC柱時(shí),固定抗體選擇性地結(jié)合待測物,其它不被識別樣本雜質(zhì)則不受妨礙地流出IAC柱,經(jīng)洗滌除去雜質(zhì)后將抗原-抗體復(fù)合物解離,待測物被洗脫,樣品得到凈化。IAC最顯著優(yōu)點(diǎn)在于對待測物高效、高選擇性保留能力,尤其適合用于復(fù)雜樣品痕量組分凈化與富集。獸藥殘留檢測技術(shù)第89頁獸藥殘留檢測技術(shù)第90頁第六章獸藥殘留檢測技術(shù)第三節(jié)樣品衍生化技術(shù)獸藥殘留檢測技術(shù)第91頁一、衍生化衍生化是將樣品中待測組分制成衍生物,使其更適合于特定分析方法。衍生化在色譜分析中作用歸納起來主要有以下幾點(diǎn):①提升檢測靈敏度;②改改變合物色譜性能,改進(jìn)分離效果;③適合深入做化合物結(jié)構(gòu)判定;④擴(kuò)大色譜分析應(yīng)用范圍。獸藥殘留檢測技術(shù)第92頁(1)柱前衍生化柱前衍生化是在色譜分離前,預(yù)先將樣品制成適當(dāng)衍生物,然后進(jìn)行分離和檢測。優(yōu)點(diǎn)：衍生化試劑、反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)條件選擇都不受色譜條件限制,衍生化后樣品能用各種預(yù)處理方法進(jìn)行純化和濃縮,也不需要附加特殊儀器設(shè)備。缺點(diǎn)：操作比較繁雜費(fèi)時(shí),輕易引發(fā)誤差,影響測定準(zhǔn)確度。當(dāng)衍生化試劑分子量相對大時(shí),其引入還可能減小組分間因?yàn)榉肿哟笮〔町惗a(chǎn)生色譜保留行為差異。獸藥殘留檢測技術(shù)第93頁(2)柱后衍生化柱后衍生化是樣品經(jīng)色譜分離后,使衍生化試劑與色譜流出組分在系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行反應(yīng),然后檢測衍生物。優(yōu)點(diǎn)：操作簡便、重復(fù)性好,色譜分離相衍生化連續(xù)自動進(jìn)行,而且衍生化不影響組分色譜分離。缺點(diǎn)：需要附加輸液泵、混合室和反應(yīng)器等裝置,因?yàn)橹隹谥翙z測器間有較長流程,可能發(fā)生色譜峰展寬。獸藥殘留檢測技術(shù)第94頁實(shí)現(xiàn)柱后衍生化必須滿足以下條件:①衍生化試劑足夠穩(wěn)定,對檢測器響應(yīng)能夠忽略,不產(chǎn)生干擾;②衍生化試劑溶液與色譜流動相能相互混溶,混合后不產(chǎn)生沉淀或分層,而且色譜流動相適宜作衍生化反應(yīng)介質(zhì);③衍生化試劑與色譜柱流出液速度要匹配,混合快速且均勻,以免產(chǎn)生噪聲;④衍生化反應(yīng)必須快速和重現(xiàn)性好,反應(yīng)器設(shè)計(jì)要合理,以盡可能降低峰展寬。獸藥殘留檢測技術(shù)第95頁二、HPLC柱后衍生化(1)柱后衍生化裝置柱后衍生化使色譜柱至檢測器之間增加了混合器與反應(yīng)器及多個連接部件,這些都將產(chǎn)生柱外效應(yīng),造成峰展寬。連接部件產(chǎn)生峰展寬決定于所用材料、長度和內(nèi)徑,需要仔細(xì)選擇。高效率混合器管式反應(yīng)器：螺旋型、編織型獸藥殘留檢測技術(shù)第96頁(2)固相衍生化將固體微粒(硅膠或高分子微球)填充于內(nèi)徑5~6mm、長度25~30cm柱子內(nèi)就是一個固相衍生化器。固體微粒表面通常經(jīng)過處理連接有反應(yīng)基團(tuán),叫作固相反應(yīng)劑。固相反應(yīng)劑種類很多,包含氧化型、還原型、基團(tuán)轉(zhuǎn)移型和催化劑型,可適應(yīng)各種衍生化反應(yīng)需要。樣品經(jīng)過時(shí)與反應(yīng)劑發(fā)生衍生化反應(yīng),這是一個非均勻體系反應(yīng)。大分子只能與擔(dān)體表面試劑作用,而小分子能夠進(jìn)入擔(dān)體全部反應(yīng)部位,所以當(dāng)有大分子干擾物存在時(shí),只有痕量大分子發(fā)生衍生化,不干擾小分子待測物檢測。柱后衍生化一個形式獸藥殘留檢測技術(shù)第97頁特點(diǎn)：①反應(yīng)試劑局部濃度很高,有利于反應(yīng)進(jìn)行完全;②過量衍生化試劑不會進(jìn)入檢測器,降低了檢測本底,提升靈敏度;③反應(yīng)速度取決于溶液接觸表面積(填料粒度),因?yàn)樘盍狭６刃?因而反應(yīng)速度快;④反應(yīng)受色譜流動相影響小;⑤不需額外混合器、管線、接頭等,降低了峰展寬原因。獸藥殘留檢測技術(shù)第98頁(3)固定化酶衍生化最早期把一個酶連接于螺旋管內(nèi)壁就是最早最簡單酶反應(yīng)器。當(dāng)代固定化酶反應(yīng)器都是將酶固定在擔(dān)體上,這實(shí)際上是一個特殊催化劑型固相衍生化試劑。優(yōu)點(diǎn)：酶反應(yīng)專一性很強(qiáng),所以方法選擇性很高。固定化后,酶穩(wěn)定性大大提升,而且能夠重復(fù)使用。缺點(diǎn)：固定化酶工作穩(wěn)定性受擔(dān)體、溫度、溶劑、pH和酶抑制劑影響。假如溶劑及其pH不適當(dāng),就可能使酶快速失去活性。HPLC流動相中固體微粒、細(xì)菌、一些金屬離子等都有可能使酶失去活性,應(yīng)該除去。固相衍生化一個特殊型式獸藥殘留檢測技術(shù)第99頁(4)光化學(xué)衍生化光化學(xué)衍生化是使色譜柱流出組分在光照射下發(fā)生某種反應(yīng),所產(chǎn)生衍生物再被檢測器檢測。只需在色譜柱與檢測器間安裝一個光源和一段反應(yīng)管。光源：高強(qiáng)度紫外燈、激光反應(yīng)管能夠纏繞在光源上,或者編織成套直接套在光電管上。檢測器：紫外-可見檢測器、熒光檢測器或電化學(xué)檢測器。柱后衍生化一個形式獸藥殘留檢測技術(shù)第100頁成功光化學(xué)衍生化必須符合以下條件:①待測組分能夠吸收適宜波長光,能夠想象它們應(yīng)該是芳香或共軛不飽和化合物;②色譜洗脫液對上述波長光應(yīng)該透明;③光源在上述波優(yōu)點(diǎn)有足夠光通量(光強(qiáng));④光反應(yīng)足夠快速;⑤反應(yīng)產(chǎn)物足夠穩(wěn)定,而且能用上述檢測器之一進(jìn)行檢測。獸藥殘留檢測技術(shù)第101頁光化學(xué)衍生化主要特點(diǎn)：①價(jià)格低廉,光可能是最廉價(jià)衍生化試劑;②設(shè)備簡單,不需額外儀器(泵等),也不需要任何衍生化試劑,降低了污染;③在恒流條件下,有恒定和重現(xiàn)動力學(xué)參數(shù)。所以,使反應(yīng)不完全甚至未達(dá)平衡,能進(jìn)行定量測定。獸藥殘留檢測技術(shù)第102頁三、GC柱后衍生化(1)柱后裂解器裂解器是一個石英或金線圈或者是一個氧化還原器,在反應(yīng)器后檢測分析各色譜組分裂解產(chǎn)生C、H、O和N元素。柱后裂解能對色譜峰進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)判定,這一點(diǎn)與MS作用相同。(2)柱后濃集器柱后濃集器主要用于GC-MS,不過也能改進(jìn)其它檢測器信噪比。濃集器主要有四類,即噴射分離器、燒結(jié)玻璃分離器、多孔膜和高聚膜。獸藥殘留檢測技術(shù)第103頁(3)柱后反應(yīng)器有一個含有鎳-硅藻土催化劑微型反應(yīng)器,加熱至425℃時(shí),能允許氫氣自由經(jīng)過,而其它組分則裂解成甲烷和水。除去水后,以熱導(dǎo)池檢測甲烷。氫反應(yīng)器能使色譜峰中含有鹵素或氮組分還原成氫鹵酸和氨,然后進(jìn)行庫侖檢測或電導(dǎo)檢測。另一個氫反應(yīng)器將含氮化合物轉(zhuǎn)變成氨后,再流進(jìn)一個裝置與鄰苯二甲醛(OPA)和巰基乙醇反應(yīng),并進(jìn)行熒光檢測。獸藥殘留檢測技術(shù)第104頁四、用于液相色譜化學(xué)衍生化須滿足要求：①反應(yīng)能快速、定量地進(jìn)行,而且對反應(yīng)條件要求不苛刻;②反應(yīng)選擇性高,最好只與待分析組分發(fā)生反應(yīng);