培養(yǎng)基的配制與滅菌實(shí)驗(yàn)報(bào)告

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試驗(yàn)二培育基的配制和滅菌

一、試驗(yàn)?zāi)康?/p>

微生物的生長(zhǎng)發(fā)育都有肯定的養(yǎng)分需要，培育基即人工培育微生物、為其生長(zhǎng)發(fā)育供應(yīng)所需養(yǎng)分的基質(zhì)。培育基配好后必需經(jīng)過(guò)滅菌方能用于分別培育微生物試驗(yàn)，因此培育基的配制和滅菌是植物病理試驗(yàn)室中最基本的工作，通過(guò)本次試驗(yàn)學(xué)習(xí)植病試驗(yàn)室中常用培育基的配制方法和高壓滅菌鍋的使用方法。

二、內(nèi)容、材料和方法

(一)培育基的配制

培育基按組成成分及對(duì)這些成分了解的程度分為自然?培育基、半組合培育基和組合培育基三類，從物理性質(zhì)上又分為液體培育基和固體培育基兩類，培育基的種類不同，配制方法也有差異，限于時(shí)間，本次試驗(yàn)僅配制馬鈴薯瓊脂培育基和牛肉膏蛋白胨培育基。1馬鈴薯蔗糖瓊脂培育基（PSA）

這是植病試驗(yàn)室最常用的培育基(簡(jiǎn)稱PSA)，主要用于植物病原真菌的分別和培育，有時(shí)也用于植物病原細(xì)菌。

成分：馬鈴薯200克

蔗糖10~20克

瓊脂17~20克

加水至1000毫升

方法：將馬鈴薯洗凈去皮切塊，加水煮沸半小時(shí)，用雙層紗布濾去薯塊，補(bǔ)足水量，加入瓊脂，加熱熔化，再加糖，待完全化后，乘熱用雙層紗布過(guò)濾分裝，塞好棉塞高壓滅菌。馬鈴薯蔗糖瓊脂培育基略帶酸性，培育真菌無(wú)需調(diào)整pH，培育細(xì)菌則調(diào)整pH至中性，此培育基留作下次試驗(yàn)分別培育病原真菌用，故不必調(diào)整pH。

5人分作一組，1、2組各作此培育基500毫升，其中200毫升分裝試管，每管約10毫升，滅菌后擺成斜面；其余300毫升，分裝在3個(gè)250—300毫升的三角瓶中，每瓶裝100毫升左右，滅菌后妥當(dāng)保存，留待下次試驗(yàn)使用。

2肉汁胨培育基（BPA）

這種培育基主要用于細(xì)菌的分別和培育

成分：牛肉浸膏3克

蛋白胨5~10克

蔗糖10克

酵母浸膏1克

瓊脂17~20克

加水至1000毫升

方法：先將瓊脂加熱熔化于大部水中，再將其它各成分用少量水化開加入，調(diào)整pH至7，趁熱用雙層紗布過(guò)濾，分裝，塞棉塞高壓滅菌。

牛肉浸膏和酵母浸膏非常粘稠，不易稱重，稱重時(shí)用小燒杯盛裝，以玻璃棒沾取，故要先稱好杯和棒的重量后，再開頭沾取浸膏稱重，稱后將杯和棒上粘著的浸膏洗凈于鍋中。調(diào)整培育基pH至中性的方法如下：配成1N的HCl和NaOH，并另分別稀釋配成1/20N的HCl和NaOH。取培育基2毫升，加蒸餾水7.5毫升，加指示劑溴百里酚藍(lán)指示劑5滴，這時(shí)如培育基的測(cè)樣呈黃色則用有刻度吸管加入1/20N的NaOH若呈藍(lán)色則加入1/2ON的

HCl，使培育基最終呈草綠色即調(diào)整到中性，此刻所加酸或堿的毫升數(shù)的25倍即等于在1000毫升培育基中所需要加入lN的NaOH或HCl的毫升數(shù)(留意這次是作500毫升培育基)，加蒸餾水稀釋的目的防止調(diào)整過(guò)程中培育基凝固。

調(diào)整pH至中性的簡(jiǎn)便方法是用石蕊示紙。也可以用多孔白色瓷板，在孔中加少量培育基和溴百里酚藍(lán)或其它指示劑1—2滴，依據(jù)顏色反應(yīng)，在所配的培育液中加入少量lN的NaOH或HCl，然后再取樣測(cè)定，如此反復(fù)多次，達(dá)到所需求的反應(yīng)為止。

5人分為一組，3、4兩組各作此培育基500毫升，其中200毫升分裝試管，每管約100毫升，滅菌后擺成斜面，其余300毫升分裝在3個(gè)250—300毫升的三角瓶中，每瓶裝100毫升左右，滅菌后妥當(dāng)存放，留待下次試驗(yàn)使用。

此外，1、2、3、4各組均制備15管試管裝和2瓶三角瓶裝的無(wú)菌水。

(二)培育基的滅菌

為了得到某種病原物的純培育，配好的培育基必需經(jīng)過(guò)滅菌才能使用，滅菌是指用物理或化學(xué)方法完全殺死器物表面及其內(nèi)部的全部微生物，滅菌與消毒的概念不同，消毒則是指毀滅器物或植物組織表面的某些微生物(能常稱雜菌)，而不是毀滅全部的微生物。

滅菌的方法許多，植病試驗(yàn)室常用的有干熱滅菌和高壓蒸汽滅菌兩種方法，一般培育皿、吸管等玻璃儀器用干熱滅菌法進(jìn)行滅菌。而培育基和試驗(yàn)用的土壤，則用高壓蒸汽滅菌法進(jìn)行滅菌，詳細(xì)滅菌方法和步驟如下：

1干熱滅菌法

(1)將培育皿、吸管等玻璃器皿洗凈干燥后，用舊報(bào)紙包好，或裝入特制的鐵筒中(每個(gè)吸管用紙包好后裝入鐵筒)，包紙時(shí)應(yīng)將吸取的一端放在取時(shí)先折開的一端，以便取用時(shí)手勿觸及要求滅菌的一端。

(2)將包裝好的玻璃儀器擺入電熱烘箱中，彼此間留有肯定的空隙以便流通空氣。

(3)關(guān)緊箱門，打開排氣孔接上電源。

(4)待箱內(nèi)空氣排出到肯定程度時(shí)，閉上排氣孔，連續(xù)加熱至肯定溫度后，用定溫固定溫度，滅菌溫度一般165℃—175℃保持1小時(shí)即可。

(5)待自然降溫冷卻后(60℃以下)才能開門取出玻璃器皿，避開由于溫度突然下降而引起玻璃器皿碎裂。

2高壓蒸汽滅菌法

高壓蒸汽滅菌法又稱濕熱滅菌，它的原理是利用高壓來(lái)提高蒸汽的溫度，達(dá)到滅菌的目的，其操作步驟如下：

(1)關(guān)好排水閥門放入清水至標(biāo)度為止，留意水量肯定要加足，否則簡(jiǎn)單造成事故。

(2)將要滅菌的培育基、滅菌水等裝入鐵絲籠中，并用牛皮紙蓋好后放入滅菌鍋中，關(guān)上器蓋，旋緊螺旋時(shí)，先將每個(gè)螺旋旋轉(zhuǎn)到肯定程度(不要太緊)，然后再旋緊相對(duì)的兩個(gè)螺旋，以達(dá)到平衡旋緊，否則易造成漏氣，達(dá)不到徹底滅菌的目的。

(3)通電加溫，同時(shí)打開排氣活門，排盡鍋內(nèi)的空氣，即活門沖出的全部是蒸氣時(shí)則表示徹底，此時(shí)可關(guān)閉排氣活門，假如過(guò)早關(guān)閉活門，排氣不徹底，也達(dá)不到徹底滅菌的目的。通常當(dāng)壓力表指針升至5磅時(shí)，打開排氣活門放氣，降至零點(diǎn)，再關(guān)閉活門。

(4)壓力表的指針上升時(shí)，鍋內(nèi)溫度也漸漸上升，當(dāng)壓力表指針升至15磅時(shí)，蒸氣溫度相當(dāng)于120℃—121℃(等于一個(gè)大氣壓)，此時(shí)開頭計(jì)算滅菌時(shí)間，掌握熱源，使處于15磅壓力保持30分鐘，即能達(dá)到完全滅菌的目的，然后停止加溫。

(5)略微打開一點(diǎn)排氣活門，使鍋內(nèi)蒸氣緩慢排解，然后漸漸開大活門，氣壓緩緩下降，留意勿使排氣過(guò)快，否則會(huì)使鍋內(nèi)的培育基沸騰而沖脫或沾濕棉花塞，但排氣太慢又使培育基在鍋內(nèi)，受高溫處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，這樣對(duì)培育基也是不利的。一般從排氣到打開鍋蓋以10分鐘左右為好。

(6)當(dāng)壓力表指針降到零、鍋內(nèi)蒸氣完全排盡時(shí)，打開鍋蓋取出培育基，如需制備固體斜面培育基時(shí)，則應(yīng)趁熱將試管斜放在桌上，上面蓋上報(bào)紙以免落灰塵，冷卻后便可收起。(7)最終將高壓滅菌器內(nèi)的剩余水排出。

(8)抽取上述滅菌的培育基，放入25℃溫箱中，48小時(shí)后不見雜菌生出，便證明培育基已達(dá)到滅菌目的，可以使用。

此外，有些培育基在經(jīng)高壓滅菌后，其養(yǎng)分成分簡(jiǎn)單分解而失去使用價(jià)值，此時(shí)可采納間歇蒸氣滅菌法，即將培育基放入高壓滅菌器內(nèi)，加熱至100℃，保持1小時(shí)，每天滅菌一次，連續(xù)進(jìn)行三次，即可達(dá)到滅菌的目的，又不至使養(yǎng)分物質(zhì)分解。

三、思索題

1培育基有哪幾種類別?各有什么特點(diǎn)和用途?

2干熱滅菌和高壓蒸汽法適用范圍如何?電熱烘箱和高壓鍋如何操作?各有哪些使用留意事項(xiàng)?

3怎樣檢查培育基滅菌是否徹底?關(guān)于微生物試驗(yàn)--培育基的配制和滅菌的思索題！急！2022-5-819:32提問(wèn)者：喜愛(ài)和愛(ài)123|掃瞄次數(shù)：1520次1.在一般狀況下為什么試管或三角瓶培育基要用棉花塞而不用軟木塞或橡皮塞？2.高壓蒸汽滅菌過(guò)程中為什么肯定要排放鍋內(nèi)的冷空氣？我來(lái)幫他解答2022-5-819:58滿足回答1.棉花起到過(guò)濾、透氣的作用??！并且棉花的開頭大小是可以盡可能轉(zhuǎn)變的，而不需要非得找到合適的軟木或橡皮塞！2.高壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放在一個(gè)密閉的加壓滅菌鍋內(nèi)，通過(guò)加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸汽。待水蒸汽急劇地將鍋內(nèi)的冷空氣從排氣閥中驅(qū)盡，然后關(guān)閉排氣閥，連續(xù)加熱，此時(shí)由于蒸氣不能溢出，而增加了滅菌鍋內(nèi)的壓力，從而使沸