生物芯片技術省公開課一等獎全國示范課微課金獎課件

ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics生物芯片技術溫州醫(yī)學院檢驗醫(yī)學院生命科學學院分子生物學檢驗技術?第九章1/81免疫共沉淀（Co-IP）2/81Pulldownassay3/814/815/81章節(jié)提要生物芯片始于上世紀90年代，伴隨人類基因組計劃而誕生一項新技術。它是由Southern印跡技術衍生而來，是一門多學個交叉綜合技術，這項技術包括到了生命科學、計算機、微機械、微電子、物理、化學、數(shù)學等領域。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics6/81定義：經(jīng)過微加工和微電子技術，在固相基質表面集成了成千上萬密集排列分子微陣列，以實現(xiàn)對組織，細胞，核酸，蛋白質及其它生物分子進行有效、準確、高通量檢測。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics章節(jié)提要7/81種類：基因芯片、蛋白質芯片、組織芯片、液相芯片、縮微芯片試驗室。各類芯片定義。最終目標：把生物和化學等領域所包括樣品制備，生化反應和檢測分析整個過程集成化，并縮微到一張芯片上自動完成，形成縮微芯片試驗室。章節(jié)提要8/81章節(jié)提要芯片技術優(yōu)點：多樣品并行處理、分析速度快、所需樣品量少、污染少。應有領域：基礎研究、臨床診療、藥品篩選，指導用藥與治療、農(nóng)作物優(yōu)育優(yōu)選、環(huán)境檢測、衛(wèi)生監(jiān)督、司法判定。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics9/81以結構與工作機制可分為微陣列芯片與微流體芯片微陣列芯片：由生物材料微陣列組成芯片，以分子間親和結合作為關鍵，以在固相載體表面固定一系列可尋址識別分子陣列為結構特征，如堿基配對，抗原抗體結合，包含基因芯片，蛋白質芯片，組織芯片等。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics章節(jié)提要10/81微流體芯片：以微管道網(wǎng)絡為結構特征，實現(xiàn)對各種生化組分微流控操作和分析，包含毛細管電泳芯片，PCR反應芯片等縮微芯片試驗室優(yōu)勢：將樣品制備、生化反應、檢測等過程集成在一個系統(tǒng)中。它是未來芯片發(fā)展主流方向之一，也是生物芯片發(fā)展最終目標。章節(jié)提要11/81ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics本章節(jié)主要學習內(nèi)容基因芯片（genechip）蛋白質芯片（proteinchip）縮微芯片試驗室（laboratoryonachip）

12/81ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics第一節(jié)基因芯片基因芯片(genechip)又稱DNA芯片（DNAchip）或DNA微陣列（DNAmicroarray）。將大量基因片段有序地、高密度地排列在玻璃片或纖維膜等載體上，稱之為基因芯片。13/81DNAMicroarray原理經(jīng)過標識待測樣品DNA經(jīng)過與芯片上特定位置探針按堿基配對原理雜交后，經(jīng)激光共聚焦熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進行掃描，經(jīng)過檢測雜交信號強度來獲取樣品分子數(shù)量與序列信息，用計算機軟件進行數(shù)據(jù)比較與分析，從而對基因序列及功效進行大規(guī)模，高通量研究。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics14/81一、基因芯片原理基因芯片技術是建立在基因探針和雜交測序技術上一個高效、快速

核酸序列分析伎倆。同時也是最先發(fā)展，最為成熟，最先商品化生物芯片15/81芯片分類載體不一樣：玻璃芯片、膜芯片、硅芯片、陶瓷芯片方法不一樣：原位合成、直接點樣探針不一樣：寡核苷酸、cDNA、基因組芯片用途不一樣：表示譜、測序芯片、診療芯片、SNP分型16/81分析步驟為：

生物芯片制作、樣品處理及標識、雜交或反應、雜交檢測及數(shù)據(jù)處理等。

芯片設計芯片制作PCR擴增靶基因標識原位合成點樣方法實際應用樣品處理芯片雜交數(shù)據(jù)分析雜交檢測放射顯影光化學電化學酶促反應17/81芯片技術發(fā)展關鍵無孔固相載體，如玻璃高密度寡核苷酸片段原位合成技術ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics18/81載體定義與種類定義：用于連接、吸附或包埋各類生物分子使其以水不溶性狀態(tài)行使功效固相材料。

玻片固體片狀硅片瓷片硝酸纖維素膜膜性材料尼龍膜聚丙烯膜19/81含有能夠進行化學反應活性基團，便于與生物分子進行偶聯(lián)。要有惰性與穩(wěn)定性：惰性（非特異吸附和其它性能不干擾生物分子動能）穩(wěn)定性（能承受一定壓力與酸堿條件改變）良好兼容性(便于制作其它類型芯片)載體材料要求20/81載體表面處理原因：核苷酸片段無法直接連接到載體表面，故需要活化，便于固定生物分子。試劑：碳二亞氨，N-羥基琥珀酰亞胺酯?；钚曰鶊F：氨基、羥基、巰基、醛基處理依據(jù)：載體表面性質、生物分子化學特征21/81常見載體薄膜狀載體

優(yōu)點：與核酸親和力強、技術成熟。膜結合玻璃片

優(yōu)點：親和性、剛性ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics22/81處理載體基本要求修飾后表面要均勻且硬質有效固定各種類型生物材料在激發(fā)光下，熒光背景低高密度，大量，均勻點陣，變異系數(shù)小23/81ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics探針固定到固相支持物上，方法有兩種：

光去保護并行合成法原位合成分子印章原位合成法噴印合成法（壓電打印法）合成點樣經(jīng)過特定高速點樣機器人直接將探針點在芯片上技術。24/81合成cDNA探針標準設計于目標cDNA3’端。防止長片段重復序列長度為0.1-2.5kbZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics25/81寡核苷酸探針長度16-26bp，G+C在40-60%探針內(nèi)不用大于4bp堿基互補配對序列，同一個堿基連續(xù)出現(xiàn)小于4個與非靶序列同源性低于70%，小于8個堿基相同。設置多個序列相近參考寡核苷酸探針。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics26/81點突變檢測核苷酸探針設計方法：等長移位設計法按靶序列從頭到尾依次去一定長度互補核苷酸序列組成一套探針組合。這套探針是野生型探針，然后對每一野生型探針中間某一堿基用其它三種堿基替換。主要目標：進行點突變掃描ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics27/81探針在載體表面固定（一）合成點樣法：經(jīng)過PCR擴增或人工合成序列，經(jīng)過計算機控制三坐標工作平臺，用針頭和微噴頭分別把探針溶液分配在固相載體表位點上，經(jīng)過物理或化學法固定探針。優(yōu)點：技術成熟，靈活性大，適合用于單位自行合成。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics28/81在硬質表面上直接合成寡核苷酸探針序列原位光刻合成法、壓電打印合成法，分子原位合成法。技術瓶頸：高空間分辨率模板點位技術、高合成效率DNA化學合成技術優(yōu)點：標準化，規(guī)?；痁hejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics探針在載體表面固定（二）29/81ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics原位合成原理基因芯片原位合成法是基于組合化學合成原理。它經(jīng)過一組定位模板來決定基片表面上不一樣化學單體偶聯(lián)位點和次序，如要合成AGCT四種堿基全部序列組合四聚體(44種)。30/81ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics原位光刻合成法主要步驟為：1.首先用光敏保護支持物活化基團2.選擇適當蔽光膜保護不需要聚合地方，暴露需要聚合位點3.在激光點光源照射下，去除光敏感保護基團，使該位點顯露出活性羥基或者氨基4.加入單核苷酸，與活化端發(fā)生化學反應5.然后更換蔽光膜，重復上步驟，完成核苷酸固定連接（見圖）。優(yōu)點：在較小區(qū)域制造大量不一樣探針。31/81圖9-2基因芯片原位合成原理示意圖

32/81ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics噴印合成法（壓電打印法）原理：

墨盒內(nèi)所用ATCG四種堿基而非碳粉。步驟：將特定DNA堿基合成試劑噴灑到特定位置上，以固相合成原理與支持物發(fā)生偶聯(lián)，然后固定，沖洗，去保護，偶聯(lián)，直至合成完所需長度探針。33/81ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics分子印章原位合成法分子印章制備和壓印過程如見圖34/81ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics（三）合成點樣

由含有多個微細加樣孔陣列復制器(arrayingandreplicatingdevice，ARD)或陣列器及由電腦控制機器人來完成。機器人準確、快速地將不一樣探針樣品定量(0.25～1.0μl)點樣于預處理好基板對應位置上，在基板上產(chǎn)生直徑為100～150μm斑點，再由紫外線交聯(lián)固定后即得到DNA微陣列或芯片。35/81合成點樣法分類接觸式點樣噴墨式打印定位準確，重復性好

斑點大，大小分布不均，密度低。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics36/81ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics二、樣品制備及標識（一）樣品制備樣品擴增在標識和分析前對樣品進行適當程度擴增，以提升閱讀靈敏度。待測樣品標識

多采取熒光標識（cy3、cy5和FAM）方法，對于陣列密度較小基因芯片能夠用同位素檢測法。37/81熒光標識優(yōu)點激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間STOCK’s位移大，故分辨率強，靈敏度高能夠進行定量檢測防止放射性同位素好污染。ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics38/81三樣品與基因芯片雜交本質：DNA探針與靶基因堿基雜交形成DNA雙鏈或DNA/RNA雜合鏈。影響原因：靶分子濃度探針濃度序列組成鹽濃度雜交溫度反應時間基因表示檢測——低溫，高鹽，長時間突變檢測——高溫，低鹽，短時間39/81ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics四、雜交結果檢測

檢測方法很多，如熒光顯影法、質譜法、化學發(fā)光和光導纖維等。熒光檢測器激光共聚焦快速傳輸高質量圖像，靈敏度高，分辨率好價格昂貴偶聯(lián)裝置攝影機掃描速度快，價格廉價靈敏度低40/81熒光顯影法完全匹配產(chǎn)生熒光強度比存在一兩個錯配高5-35倍熒光強度與待測分子含量呈線性關系問題只要結合就會有陽性信號，無法確認是否完全匹配處理方法使用多色熒光技術——不一樣靶基因使用不一樣激發(fā)波長熒光標識物。41/81芯片激光光源電子束分裂器聚焦小孔檢測器濾光鏡聚光鏡物鏡使用最廣泛是熒光顯影法42/81光纖DNA生物傳感器微陣列原理：將合成氰尿酰氯活化探針固定在光纖末端，集成含有不一樣探針光纖，形成傳感裝置，探針伸入樣品中，信號由另一端CCD檢測。優(yōu)勢方便，可在沒有confocal試驗室中開展試驗。43/81五、雜交結果分析標準化：消除不一樣芯片，不一樣標識物差異數(shù)據(jù)精簡：去掉無顯要意義數(shù)據(jù)統(tǒng)計學分析：對數(shù)據(jù)進行分析歸類，并進行統(tǒng)計學檢驗，確保器準確性生物學意義分析：基于統(tǒng)計結果，研究其代表生物學意義，得出對應結論數(shù)據(jù)庫：Genesist，AMADA，TIGR。44/81ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics三、基因芯片技術在醫(yī)學領域應用

基因芯片技術基本應用能夠分為兩個主要方面：定量分析（主要指測序和突變檢測）定性分析（主要指對基因表示研究）。45/81基因功效研究基因表示及調控研究基因突變和多態(tài)性檢測DNA序列測定基因組及基因研究46/81基因表示及調控研究基因芯片應用最廣泛領域從整體上分析細胞基因表示情況，為了解與一些生命現(xiàn)象相關基因表示提供有力證據(jù)，對于基因調控以及基因相互作用機理探討有主要意義47/81基因突變和多態(tài)性檢測利用基因芯片技術對一些突變點定位、確認及分類是診療基因疾病基礎。寡核苷酸芯片能夠檢出變異位點，被代替核苷酸以及變異特征。比如：HIV病毒RT與PRO突變檢測。48/81DNA序列測定原理：任何線性DNA或RNA單鏈都能夠被分解為一系列堿基數(shù)固定，錯落重合寡核苷酸片段，或稱為亞序列，只要測出莫伊核苷酸全部亞序列，就能夠還原原序列。優(yōu)點快速、成本低、易于自動化缺點雜交條件不統(tǒng)一、易出現(xiàn)假性結果、重復序列無法測定。優(yōu)勢測定已知序列、研究突變與SNP檢測。49/81基因組及基因研究研究酵母基因組復制活動：發(fā)覺其復制起點、復制叉在基因組移動與S期復制和轉錄活動關系優(yōu)勢：用量少、自動化、便于大量篩選新基因50/81基因芯片應用于疾病診療優(yōu)勢

靈敏、準確、快速、簡單、高通量（同時檢測各種疾?。茫焊腥拘约膊≡\療出生缺點檢測遺傳性疾病診療HLA配型檢測腫瘤診療及分型神經(jīng)系統(tǒng)疾病檢測耐藥性檢測疾病診療51/81感染性疾病診療流程

將待測病原體特征基因片段或寡核苷酸探針固定于玻片上制成芯片，從患者血清中提取病原DNA或RNA經(jīng)擴增標識熒光后與芯片進行雜交，掃描雜交信號，計算機分析，得出定性或定量結果。52/81因為病原微生物不一樣亞型，不一樣突變株會造成患者發(fā)病程度，患者對藥品敏感程度等差異，故對病原微生物分型，能夠幫助醫(yī)生了解患者病情，確定最正確治療方案。如HPV亞型123種，其中20種高危，提前診療HPV感染，有利于預防宮頸癌變，降低死亡率?；蛐酒贤瑫r對21種不一樣類型HPV診療，3.5小時完成。感染性疾病診療53/81遺傳性疾病診療現(xiàn)行診療遺傳學疾病方法（PCR，測序、RFLP）共同缺點通量低。遺傳性疾病中可能是由眾多位點中一個或多個位點突變引發(fā)，所以對多位點檢測尤為主要。如beta-地中海貧血，突變100種以上。應用于血友病，杜氏肌營養(yǎng)不良癥、苯丙酮尿癥，血紅蛋白異常病。54/81腫瘤診療及分型獲取腫瘤細胞生長各期與腫瘤生長相關基因表示模式篩選出哪些分子起關鍵性調控作用基因腫瘤分型（乳腺癌）應用如p53基因突變檢測55/81耐藥性檢測病原微生物表示譜檢測突變分析多態(tài)性分析目標——指導抑制靶分子新藥合成、臨床用藥56/81基因芯片在藥品研究中應用可直接在基因水平上尋找藥品靶標，解釋作用機理，檢測藥品毒副作用，為藥品開發(fā)與設計提供理論依據(jù)。作用表達：代替人體靶組織分析代謝路徑與信號通路確定藥品作用靶組織引導藥品開發(fā)縮短周期，便捷57/81基因芯片存在問題探針合成中會插入雜質，降低特異性制備標識過程比較復雜。數(shù)據(jù)缺乏可比性，不利于芯片數(shù)據(jù)共享58/81產(chǎn)生原因：蛋白質表示與其上游mRNA表示未顯示出直接關系。蛋白質結構或構象微小改變均能造成其活性與功效改變定義：是指固定于支持介質上多肽或蛋白質組成微陣列第二節(jié)蛋白質芯片59/81第二節(jié)蛋白質芯片60/81第二節(jié)蛋白質芯片61/81ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics第二節(jié)蛋白質芯片蛋白質芯片技術是一個快捷、高效、并行、高通量、微型化和自動化蛋白質分析技術。蛋白質芯片適合用于蛋白質-蛋白質、蛋白質-DNA、蛋白質-RNA、蛋白質-小分子物質間相互作用分析。是功效基因組、蛋白質組研究領域中一個新型主要工具。62/81蛋白質芯片原理：采取機械點樣或共價結合等方法將多肽、蛋白質、酶、抗原或抗體固定于固相載體上形成分子點陣，并將待測蛋白質與該芯片進行孵育反應，再將熒光標識蛋白質與芯片——蛋白質復合物反應。經(jīng)過掃描系統(tǒng)檢測個點熒光強度，分析蛋白質與蛋白質之間相互作用，由此到達測定蛋白功效目標。63/81蛋白質芯片分類蛋白質功效芯片

天然蛋白質點在基片上，用于蛋白活性及分子親和性高通量平行分析。蛋白質檢測芯片將高度親和特異性探針分子（mAb）點在基片上，用以檢測復雜樣品中目標蛋白。64/81蛋白質芯片分類1.支持物表面高度密集排列探針蛋白點陣

微陣列微孔板測定時，特異性地捕捉樣品中靶蛋白，然后經(jīng)過檢測系統(tǒng)對靶蛋白進行定性及定量分析。抗體為慣用探針蛋白。2.三維凝膠塊芯片實質是在基片上點布以10000個微小PAGE膠塊，主要用于篩選抗體抗原，酶動力學反應研究。優(yōu)點：靈敏、蛋白結構天然65/81蛋白質芯片制備與分析載體探針蛋白制備探針固定檢測66/81載體要求：穩(wěn)定性，兼容性種類：化學膜尼龍膜、硝酸纖維素膜、聚苯乙烯膜無需復雜表面處理背景高，靈敏度低PAGE膠儲水環(huán)境——保持探針活性，除反應液困難微孔板性能良好，探針分隔良好——交叉污染程度低，液相——保持探針活性玻片為最正確載體需表面修飾（醛基、BSA、poly-lysine）高通量自動化效率高67/81探針制備種類：抗體、抗原、蛋白質、配體、受體、酶、核酸、多肽要求：親和性強、特異性高。應用最廣泛探針：抗體，抗原，尤其是mAb68/81ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics探針蛋白制備蛋白質芯片上探針蛋白可選取抗體、抗原、受體、酶等含有生物活性蛋白質。單克隆抗體是比很好一個探針蛋白。69/81ZhejiangProvincialKeyLabofMedicalGenetics探針固定體外合成劣勢多肽長度不易控制、探針活性位置點加法：手工點樣接觸式點樣噴墨點樣法固定后，需用BSA溶液封閉——提升特異性70/81ZhejiangProvincialKeyLabofMedical