微生物學(xué)8省公開課一等獎全國示范課微課金獎?wù)n件

第八章微生物遺傳學(xué)第一節(jié)遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)及其特征第二節(jié)遺傳信息表示

第三節(jié)細胞中遺傳信息變異第四節(jié)微生物誘變育種和遺傳工程第1頁何謂遺傳學(xué)？遺傳學(xué)是關(guān)于遺傳物質(zhì)生理生化性質(zhì)、世代傳遞方式，以及所攜帶信息在個體發(fā)育中表示一門科學(xué)。早期遺傳學(xué)研究親代與子代之間遺傳性狀傳遞，提出了遺傳染色體理論，對基因進行了作圖，并發(fā)覺了基因重組現(xiàn)象，故名傳遞遺傳學(xué)。近代遺傳學(xué)則深入從分子水平上研究基因組成、復(fù)制、表示、突變和修復(fù)等，被稱為分子遺傳學(xué)。第2頁微生物遺傳學(xué)包括部分真核生物，全部原核生物，以及病毒遺傳；介紹微生物遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)特點、遺傳信息表示與調(diào)控、遺傳變異基本規(guī)律；介紹經(jīng)過基因操作改變微生物遺傳信息從而有效地控制或利用微生物基本策略。

第3頁第一節(jié)遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)及其特征 一、遺傳物質(zhì)判定 二、脫氧核糖核酸 三、基因組DNA和染色體 四、染色體以外遺傳因子第4頁經(jīng)典試驗1.肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化試驗

圖8.1（a）S型和R型細胞侵染試驗一、遺傳物質(zhì)判定第5頁分離后S型細胞物質(zhì)對R型細胞轉(zhuǎn)化

圖8.1（b）第6頁第7頁第8頁結(jié)論細胞生物遺傳物質(zhì)是雙鏈DNA病毒遺傳物質(zhì)能夠是單鏈或雙鏈DNA或RNA，即：ssDNA，dsDNA，ssRNA或dsRNA。第9頁二、脫氧核糖核酸1．核酸化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)

2．DNA復(fù)制方式

3．DNA理化性質(zhì)第10頁1．核酸化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)

Watson和Crick在1953年描述了DNA結(jié)構(gòu)模型：DNA分子是由兩條相互平行、方向相反多核苷酸單鏈以右手螺旋方向相互纏繞而形成雙螺旋。脫氧核糖和磷酸組成主鏈位于外圍，經(jīng)過氫鍵相互交聯(lián)堿基處于雙螺旋內(nèi)部。腺嘌呤與胸腺嘧啶配對，鳥嘌呤與胞嘧啶配對；兩條單鏈互補；一條鏈堿基序列限定了另一條鏈序列。第11頁RosalindFranklin貢獻

WatsonandCrickproposedDNAstructurein1953bybuildingmodelsbasedonchemicalandphysicaldatathathadbeengatheredinotherlabs,primarilyx-raydiffractiondatacollectedbyRosalindFranklin

etal.第12頁2．DNA復(fù)制方式

細菌DNAq-形復(fù)制真核生物DNA復(fù)制10～100

mm復(fù)制叉復(fù)制叉復(fù)制原點 模板 新生鏈第13頁DNA滾環(huán)復(fù)制模式

圖8.2切口5’5’3’3’3’ 模板 新生鏈新鏈連續(xù)復(fù)制互補鏈合成第14頁3．DNA理化性質(zhì)DNA穩(wěn)定性在溶液中，DNA含有一定粘性，易受剪切力破壞；易被核酸酶降解；在強酸中，DNA能被水解成堿基、糖和磷酸；在特定稀酸中(如pH3~4)，不一樣堿基與核糖之間糖苷鍵會發(fā)生特異性斷裂，依據(jù)這種特異性可測定DNA堿基序列；在稀堿如0.2當(dāng)量NaOH中，雙鏈DNA很快變性產(chǎn)生單鏈DNA，繼而單鏈DNA被深入破壞。第15頁3．DNA理化性質(zhì)（2）DNA光學(xué)性質(zhì)DNA中堿基屬于芳香簇化合物，能夠吸收紫外光(UV)。DNA吸收峰光波波長為260納米；當(dāng)濃度為1mg/ml時， dsDNA：A260=20 ssDNA、RNA：A260≌25人們依據(jù)A260測定DNA濃度，依據(jù)A260/

A280和估算DNA純度。第16頁3．DNA理化性質(zhì)（3）DNA熱變性雙鏈DNA在一定高溫下解鏈(變性)產(chǎn)生單鏈DNA。雙鏈DNA完全解鏈后，紫外吸收值A(chǔ)260能夠提升40％，當(dāng)吸收值提升到達中點時溫度稱為解鏈溫度（Tm）。1.41.21.0708090100°CTm第17頁3．DNA理化性質(zhì)（4）復(fù)性、退火或雜交

當(dāng)溫度遲緩降低時，序列互補單鏈DNA能夠漸漸地重新配對，即復(fù)性。不一樣起源DNA之間堿基序列互補區(qū)段進行堿基配對稱為退火或雜交，這被廣泛應(yīng)用于DNA擴增、定點誘變、基因判別。第18頁3．DNA理化性質(zhì)（5）分子特征與微生物分類判定DNA中G＋C含量通常經(jīng)過Tm值來測定。同一個屬細菌，G＋C含量改變普通小于10％。DNA－DNA雜交技術(shù)用于研究親緣關(guān)系近微生物。假如兩菌株在最適條件下雜交，DNA相關(guān)性>70%，且Tm值差異<5％，它們就被認為同種。第19頁三、基因組DNA和染色體

基因組是指一個生物體內(nèi)單套遺傳物質(zhì)全部遺傳基因。染色體指攜帶細胞功效所必備基因遺傳單元。

病毒是非細胞生物，它們?nèi)走z傳基因稱為基因組，但不足以形成染色體。

原核生物染色體常為一個環(huán)狀DNA分子。

真核生物細胞有幾條至幾十條染色體，各含一個線狀DNA分子。

第20頁

細菌染色體DNA大小和結(jié)構(gòu)(a)大腸桿菌細胞大小和染色體DNA長度比較；(b)細菌細胞中擬核；(c)大腸桿菌染色體結(jié)構(gòu)電鏡圖。寬1.1~1.5mm、長2~6mm細胞里包裝著一個DNA分子長度達1mm；這個環(huán)狀DNA分子在細胞中形成含有一個染色體擬核；在染色體中心有一個由DNA結(jié)合蛋白和膜組成骨架，DNA分子附著在骨架上形成50~100個超螺旋環(huán)，每個環(huán)中含堿基對約50~100kb，這種多層次折疊使DNA處于高度壓縮狀態(tài).Fromfiguresinreferencedbook5.第21頁真核生物細胞中DNA中只有不到5％DNA用于所需蛋白質(zhì)基因表示，其余DNA起“結(jié)構(gòu)”作用或“調(diào)整”作用。DNA被緊密地包裝在多條染色體中，每條染色體中含有一個線狀DNA分子，它以左手螺旋方向圍著一個個組蛋白八聚體繞圈1.8周，形成串珠狀染色質(zhì)，被串在一起小顆粒稱為核小體，染色質(zhì)深入卷曲形成每圈6個核小體、直徑30nm染色質(zhì)絲，它折疊成許多超螺旋環(huán)附著在中央骨架上。真核生物染色體結(jié)構(gòu)

FromBIOLOGYbyJackCCareyetal.,eds第22頁四、染色體以外遺傳因子線粒體和葉綠體中含有DNA能夠自體復(fù)制，并編碼執(zhí)行線粒體和葉綠體功效蛋白，屬于染色體以外遺傳因子。

質(zhì)粒普通指存在于細菌、真菌等微生物細胞中，獨立于染色體以外，能進行自我復(fù)制遺傳因子。質(zhì)粒大小為1～1000kb，常為環(huán)狀雙鏈DNA分子，也有線狀DNA或RNA質(zhì)粒。有些質(zhì)粒既能夠整合到染色體上，又能以游離狀態(tài)存在，并能攜帶部分染色體基因進行轉(zhuǎn)移，它們被稱為附加體。

第23頁第二節(jié)遺傳信息表示

一、真核生物基因轉(zhuǎn)錄及其調(diào)控 二、原核生物基因轉(zhuǎn)錄及其調(diào)控 三、翻譯過程中調(diào)控 四、調(diào)控信號與系統(tǒng)性調(diào)控第24頁主要調(diào)控機制調(diào)控模型

圖8.5第25頁一、真核生物基因轉(zhuǎn)錄及其調(diào)控

1.真核生物基因轉(zhuǎn)錄 常見開啟子是位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游25－30個堿基正確TATA盒；另一些基因則含有一個與轉(zhuǎn)錄起始位點重合起始元件。

RNA聚合酶Ⅱ催化合成是Pre-RNA，它必須經(jīng)過加工才形成成熟mRNA。

Pre-RNA加工在細胞核中進行，主要加工步驟：5′端加帽、3′端加尾、剪接去除插入子等。

第26頁

發(fā)生在pre-mRNA轉(zhuǎn)錄早期，當(dāng)新生RNA分子長度到達25～30核苷酸時，加帽酶使新生轉(zhuǎn)錄物5′端第一個核苷酸(A或G)g位磷酸水解，并加上7-甲基鳥苷三磷酸。2.5′端加帽反應(yīng)和帽子結(jié)構(gòu)

圖8.8帽子結(jié)構(gòu)：5′端第一個核苷酸是7-甲基鳥苷三磷酸，它以5′三磷酸酯鍵與第二個核苷酸5′端相連，而不是通常3′,5′磷酸二酯鍵。甲基第27頁3.

3′端加尾過程

3′端加poly(A)發(fā)生于插入子剪切之前。Pre-mRNA尾部含有非編碼區(qū)，其3′端約20個核苷酸之前有一個稱為多聚A位點序列AAUAAA。特異性核酸內(nèi)切酶識別多聚(A)位點后，切除其后面20個核苷酸并產(chǎn)生3′端游離羥基。在poly(A)聚合酶作用下，20～250個腺嘌呤核苷酸被加到3′端，產(chǎn)生poly(A)。第28頁 pre-mRNA中有編碼和不編碼蛋白質(zhì)序列相間排列，其中不編碼蛋白質(zhì)序列被稱為插入子；編碼蛋白質(zhì)序列被稱為表示子。4.剪接去除插入子第29頁插入子切除和表示子拼接自參考書2第30頁5.真核生物基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控

真核生物基因表示調(diào)控作用可能發(fā)生在轉(zhuǎn)錄、mRNA修飾和穩(wěn)定、翻譯、mRNA轉(zhuǎn)運和降解等各個步驟。 真核細胞中基因表示調(diào)控信號包含兩類：一類是激素和蛋白質(zhì)分子，另一類是外環(huán)境原因。第31頁二、原核生物基因轉(zhuǎn)錄及其調(diào)控

1.細菌基因轉(zhuǎn)錄過程

mRNA不需要加工，轉(zhuǎn)錄與翻譯同時。

開啟子：在－10和－35區(qū)含有特征性序列，被不一樣σ因子所識別。

多順反子：功效相關(guān)多個基因往往聚集成一個操縱子，處于同一個轉(zhuǎn)錄單元中。第32頁

細菌轉(zhuǎn)錄和翻譯同時進行 圖片來自參考書2第33頁2.σ因子參加轉(zhuǎn)錄調(diào)控 細菌RNA聚合酶關(guān)鍵酶功效對任何基因都一樣，而σ因子才是選擇轉(zhuǎn)錄對象關(guān)鍵亞基。 每一個σ因子識別開啟子在－10和－35區(qū)都含有特征性序列。

－10和－35區(qū)不但被不一樣σ因子所識別，而且是決定開啟子強度。第34頁例：大腸桿菌 在正常生長條件下，分子量為70kDaσ70指導(dǎo)RNA聚合酶活動； 當(dāng)細胞需要進行趨化移動時，就產(chǎn)生分子量為28kDaσ28開啟鞭毛和趨化蛋白合成； 假如環(huán)境溫度突然上升，細胞會產(chǎn)生分子量32kDaσ32開啟熱休克蛋白基因轉(zhuǎn)錄以保護細胞不受高溫傷害，并去除已變性蛋白。

第35頁3.操縱子和轉(zhuǎn)錄正、負調(diào)整

在原核細胞中，幾個功效相近或相關(guān)結(jié)構(gòu)基因經(jīng)常有序地排列在一起，并被轉(zhuǎn)錄在同一個RNA分子上；這種由一個轉(zhuǎn)錄控制區(qū)和1至多個結(jié)構(gòu)基因組成一個完整轉(zhuǎn)錄單元稱為操縱子。 有些基因需要在活化蛋白結(jié)合到DNA特定位點后才能有效表示；由活化蛋白激活或促進基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控方法叫做轉(zhuǎn)錄正調(diào)整。 由阻遏蛋白結(jié)合到DNA特定位點上，對轉(zhuǎn)錄起始發(fā)生阻遏或解阻遏作用，這種調(diào)控方法被稱為轉(zhuǎn)錄負調(diào)整。

第36頁例：乳糖操縱子結(jié)構(gòu)

圖8.6 其中有兩個調(diào)控基因：（1）阻遏蛋白結(jié)合位點Oprator，乳糖參加負調(diào)整；（2）激活蛋白CAP結(jié)合位點，cAMP參加正調(diào)整。

參考書1第37頁衰減作用是經(jīng)過衰減子使已經(jīng)開始轉(zhuǎn)錄提早終止，從數(shù)量上降低完整mRNA產(chǎn)生。圖8.74.衰減作用第38頁三、翻譯過程中調(diào)控固定式調(diào)控：包含在DNA序列之內(nèi)，如稀有密 碼子和重合基因等，其調(diào)控不受環(huán)境影響。非固定式調(diào)控：作用受環(huán)境原因影響，與 DNA 序列無關(guān)。 稀有密碼子出現(xiàn)頻率 基因重合排列 SD序列、與起始密碼子間距 mRNA形成二級結(jié)構(gòu) 反義RNA存在

影響翻譯速度原因第39頁四、調(diào)控信號與系統(tǒng)性調(diào)控微生物必須對生存條件改變快速作出反應(yīng)；必須與其它個體或群體進行競爭，獲取并有效地利用營養(yǎng)物質(zhì)。必須能夠產(chǎn)生、感應(yīng)、傳遞信號，同時對多個相關(guān)操縱子進行系統(tǒng)性調(diào)控。第40頁1.葡萄糖效應(yīng)及其機理 當(dāng)培養(yǎng)基中同時有葡萄糖、乳糖、阿拉伯糖、麥芽糖存在時，大腸桿菌首先利用葡萄糖，直到葡萄糖快要消耗完成，其它糖代謝才能開始，這種由葡萄糖代謝抑制其它糖代謝現(xiàn)象稱為代謝抑制（cataboliterepression）或葡萄糖效應(yīng)。

第41頁代謝抑制機理

細胞大量攝入并代謝葡萄糖，cAMP含量隨之降低，使受cAMP正調(diào)控乳糖操縱子、阿拉伯糖操縱子、麥芽糖操縱子等都不能被激活。 缺乏葡萄糖，或者人為地向培養(yǎng)基中加入cAMP，細胞中cAMP濃度升高，產(chǎn)生cAMP-CAP復(fù)合體與DNA結(jié)合，激活代謝乳糖、阿拉伯糖、麥芽糖操縱子。第42頁2.嚴緊反應(yīng)

細菌在生長過程中假如得不到足夠氨基酸，細胞內(nèi)鳥苷四磷酸(ppGpp)和鳥苷五磷酸(pppGpp)含量快速上升；與此同時，RNA合成速率快速降低，蛋白質(zhì)合成也隨之下降，從而細胞處于低速代謝和遲緩生長狀態(tài)。當(dāng)環(huán)境中出現(xiàn)足夠氨基酸時，pppGpp和ppGpp被快速降解，RNA和蛋白質(zhì)合成很快恢復(fù)。這是在困難時期取得生存策略，被稱為嚴緊反應(yīng)（stringentcontrol）。

第43頁3.菌量感應(yīng)系統(tǒng) 有些細菌含有一個能夠感應(yīng)本身細胞群體密度并對其作出對應(yīng)應(yīng)答反應(yīng)調(diào)控系統(tǒng)。 這些細菌在生長過程中釋放某種信號分子，當(dāng)細胞群體密度到達了一個臨界水平時，信號分子積累到起誘導(dǎo)作用濃度，從而激活目標(biāo)操縱子，這種調(diào)控叫做菌量感應(yīng)作用(quorumsensing)。

第44頁4.雙組分磷酸接力系統(tǒng) 雙組分磷酸接力系統(tǒng)又名雙組分信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，是一個經(jīng)過磷?；鶊F轉(zhuǎn)移來傳導(dǎo)信號，并控制基因轉(zhuǎn)錄調(diào)整系統(tǒng)。 雙組分是：傳感蛋白激酶、應(yīng)答調(diào)整蛋白。 雙組分系統(tǒng)廣泛存在于細菌中，也存在于真核微生物中；高等真核生物也利用磷酸化這一信號傳導(dǎo)機制傳遞信號。

第45頁

例：枯草桿菌調(diào)控芽孢形成雙組分磷酸接力系統(tǒng)

在營養(yǎng)生長階段，枯草桿菌RNA聚合酶利用σA對與其營養(yǎng)生長相關(guān)基因進行轉(zhuǎn)錄；KinA、B、C、D等對環(huán)境信號進行傳感反應(yīng)蛋白激酶，在營養(yǎng)細胞中以非磷酸化形式存在。當(dāng)這些激酶感應(yīng)到不適于生長信號時發(fā)生磷酸化；磷酸化KinA等將磷酸基團轉(zhuǎn)移到SpoOF；SpoOF將磷酸基團傳遞給SpoOB；SpoOB再將磷酸基團傳遞給SpoOA。磷酸化SpoOA能與abrB基因開啟子結(jié)合并阻遏abrB基因表示，AbrB是許多基因表示抑制蛋白；圖8.8 磷酸化SpoOA能夠激活σF、σE等Sigma因子合成。 當(dāng)細胞內(nèi)部分σA被σF、σE取代時，芽孢開始形成，負責(zé)芽孢形成后期基因轉(zhuǎn)錄σG和σK逐步產(chǎn)生。第46頁第三節(jié)細胞中遺傳信息變異 一、微生物遺傳變異現(xiàn)象 二、基因突變分子基礎(chǔ) 三、基因重組 四、原核生物細胞間基因轉(zhuǎn)移 五、真核微生物細胞間基因交換第47頁一、微生物遺傳變異現(xiàn)象自發(fā)突變發(fā)生頻率很低，觀察自發(fā)性突變經(jīng)典試驗是波動試驗。自發(fā)突變和誘發(fā)突變本質(zhì)相同：因為理化因子作用于DNA，造成遺傳性狀改變。少數(shù)幾個細胞遺傳變異能夠使微生物群體完全地改變成新菌落。

遺傳學(xué)中慣用突變株包含營養(yǎng)缺點型、抗藥突變型、溫度敏感型等。第48頁

抗T1噬菌體大腸桿菌波動試驗

表8.1第49頁艾姆氏試驗基本方法缺點型菌株營養(yǎng)缺乏型平板37℃2～3天.. ......:.¨.:..:..;.;...¨.:.:.¨.:..:..;.;...¨.:.. .....待測試劑(圖8.10)

正常回復(fù)突變誘變劑誘變艾姆氏試驗已成為測試化學(xué)物質(zhì)誘變作用標(biāo)準(zhǔn)方法，其原理是檢驗待測試劑能否使?fàn)I養(yǎng)缺點型菌株回復(fù)突變增加。

第50頁二、基因突變分子基礎(chǔ) DNA分子與其它物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)形成非正常結(jié)構(gòu)現(xiàn)象稱為DNA損傷。 DNA損傷結(jié)果是造成基因突變或者細胞死亡。 DNA分子本身活動能夠造成堿基錯配；另外，DNA損傷分子機制都是由已知或未知理化原因?qū)NA結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了破壞作用。第51頁

已知化學(xué)致變劑和物理致變劑

物理致變劑

致變劑

電離輻射、紫外輻射等

化學(xué)致變劑脫氨劑、烷化劑、

大型加合物供體、堿基類似物、 插入劑、交聯(lián)劑。第52頁常見致變劑及其致變作用

圖7.11

亞硝基脫氨作用；(b)烷化劑和被甲基化堿基；(c)5-溴脫氧嘧啶與鳥嘌呤配對。第53頁

嘧啶堿基受紫外輻射后產(chǎn)生衍生物

圖7.12第54頁分子變異與信息改變第55頁三、基因重組 同源重組是生物中普遍存在一個基因重組方式，其特點是能夠在任何位置、任何兩個含有同源序列DNA分子之間發(fā)生，需要類似RecA蛋白參加。 位點特異性重組依賴于小范圍同源序列聯(lián)會，特點是需要在供體和靶分子中包含特定DNA序列，而且需要特異性蛋白質(zhì)因子識別和催化。 轉(zhuǎn)座子是可在一個DNA分子內(nèi)或不一樣DNA分子間移動DNA片段。轉(zhuǎn)座作用即由轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)DNA重排現(xiàn)象，它不需DNA同源性，無RecA參加；轉(zhuǎn)座子末端帶有倒置重復(fù)序列，由轉(zhuǎn)座酶識別和切割。第56頁 大腸桿菌l噬菌體在特異性位點插入染色體(a)和脫離染色體方式(b)

位點特異性重組

圖8.14第57頁

轉(zhuǎn)座子插入和靶序列正向重復(fù)產(chǎn)生過程。轉(zhuǎn)座作用

圖8.15第58頁四、原核生物細胞間基因轉(zhuǎn)移在供體細胞和受體細胞直接接觸后，質(zhì)粒從供體細胞向受體細胞轉(zhuǎn)移過程叫做接合作用(conjugation)。

轉(zhuǎn)化(transformation)是指細胞從周圍介質(zhì)中攝取來自不一樣基因型細胞DNA，使受體基因型或表型發(fā)生對應(yīng)改變過程。

轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)是由噬菌體介導(dǎo)將DNA片段從供體菌轉(zhuǎn)移到受體菌過程。

第59頁大腸桿菌中F質(zhì)粒及其接合作用

圖8.16

第60頁

大腸桿菌l噬菌體介導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)

圖8.17

(a)普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo) (b)特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)

第61頁五、真核微生物細胞間基因交換準(zhǔn)性生殖與有性生殖比較表8.2第62頁第四節(jié)微生物誘變育種 和遺傳工程

一、菌株誘變和篩選 二、DNA重組技術(shù)發(fā)展 三、基因工程 四、生物種系遺傳改良第63頁一、菌株誘變和篩選

物理致變劑

致變劑 e.g.X-rays,g-rays,UV

化學(xué)致變劑 e.g.baseanalogs,nitrousacid, alkylating,arylatingagents第64頁UVLVLPhotolyase例：紫外線誘變分子基礎(chǔ)第65頁紫外線誘變操作步驟第66頁青霉素生產(chǎn)菌誘變育種菌株NRRL-B25誘變過程Strain Mutagen Yield(U/ml)TimeNRRL-B25 250 1943NRRL-X1612 X-rays 500 1943NRRL-Q176 UVlight 850 1945NRRL-WIS-47-1564UVlight 850 1947--- --- 50000 1977第67頁對早期生物技術(shù)發(fā)展貢獻巨大；適合用于路徑或基因未得到研究菌株；產(chǎn)生變異程度相對較低；變異位點及性質(zhì)不明；沒有對應(yīng)基因就不可能發(fā)生新功效。誘變育種技術(shù)特點第68頁二、DNA重組技術(shù)發(fā)展

1.限制性核酸內(nèi)切酶 2.逆轉(zhuǎn)錄酶 3.DNA連接酶 4.DNA聚合酶和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)第69頁

1.限制性核酸內(nèi)切酶

20世紀60年代末Arber等發(fā)覺細菌能夠產(chǎn)生識別特定DNA序列并對其加以切割酶，即限制性核酸內(nèi)切酶，簡稱DNA內(nèi)切酶。這個發(fā)覺標(biāo)識著DNA重組技術(shù)誕生。 工具酶識別序列是4～8個核苷酸，這些位點顯著特點是它們含有雙重旋轉(zhuǎn)對稱結(jié)構(gòu)或稱回紋結(jié)構(gòu).圖7.18.(a)第70頁

限制性核酸內(nèi)切酶切割方式

粘性末端：兩條單鏈上斷裂位置交織且對稱，所產(chǎn)生兩個末端含有單鏈互補序列。

平端切割：兩條單鏈上斷裂位置處于一個對稱結(jié)構(gòu)中心，裂口處兩條單鏈長短平等。XhoISciI圖7.8.限制性內(nèi)切酶切割方式實例（b）、（c）第71頁

2.逆轉(zhuǎn)錄酶

逆轉(zhuǎn)錄酶是以RNA為模板合成序列與其互補DNA鏈。1970年，科學(xué)家發(fā)覺逆轉(zhuǎn)錄病毒以逆轉(zhuǎn)錄酶合成它們RNA基因組DNA拷貝。 以5′→3′方向合成DNA，前提條件：有一段引物、一條模板分子、四種脫氧核糖核苷酸、鎂離子。

第72頁

3.DNA連接酶

DNA連接酶是一個能夠催化DNA中相鄰3′-OH和5′-磷酸基團末端之間形成磷酸二酯鍵并把兩段DNA拼接起來一個酶。 1972年，DavidJackson等使DNA片斷粘性末端退火（即堿基彼此配對），然后用DNA連接酶共價連接這些片段；同年內(nèi)，他們就發(fā)展出基因克隆中所需要質(zhì)粒載體與外源DNA連接技術(shù)，成功地取得了重組DNA分子。第73頁4.DNA聚合酶和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

DNA聚合酶在有一條DNA單鏈為模板和一段寡核苷酸為引物條件下，催化與模板互補另一條DNA新鏈合成反應(yīng)。1985年KaryMullis等用DNA聚合酶創(chuàng)建了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)；用該技術(shù)進行特定DNA片段體外擴增，能夠在短時間內(nèi)取得數(shù)百萬個特異序列拷貝。 因為PCR技術(shù)對當(dāng)代生物技術(shù)發(fā)展巨大貢獻，創(chuàng)造人取得了諾貝爾獎。第74頁來自極端微生物熱穩(wěn)定性DNApolymerase如來自ThermusaquatcusTaqpolymerase 95?C，半衰期>2h

使PCR實現(xiàn)自動化。上圖為PCR儀，下列圖為示PCR循環(huán)。T(?C)

907050Time(min)循環(huán)1 循環(huán)2循環(huán)3循環(huán)第75頁三、基因工程

1.基因工程總體策略 2.目標(biāo)基因克隆與判定 3.宿主和載體 4.重組蛋白生產(chǎn)第76頁1.基因工程總體策略（1）

基因工程指用人為方法將所需要某一供體生物DNA提取出來，在適當(dāng)條件下用適當(dāng)酶切割后，把它與載體DNA分子連接起來形成含有自我復(fù)制能力DNA分子——復(fù)制子，并將它轉(zhuǎn)移到宿主細胞中進行擴增和表示。第77頁基因工程總體策略（2）重組蛋白生產(chǎn) 品種、菌株改良 遺傳基因分析第78頁2.目標(biāo)基因克隆與判定第79頁藍-白選擇第80頁活性篩選第81頁放射自顯影或生色反應(yīng)用32P標(biāo)識探針迪高莘標(biāo)識探針及Marker第82頁3.宿主和載體

克隆載體

是一個能復(fù)制DNA分子，被用來運載插入外源基因進入受體細胞。它能夠是質(zhì)粒、噬菌體、粘?；蛉斯と旧w。

-----LMPrescottetal.,in MICROBIOLOGY,5thed.第83頁外源基因由克隆載體攜帶進入宿主細胞OriAmpRForeign

geneMCSVectorscarrygenesintohostcells第84頁質(zhì)粒圖譜范例第85頁大腸桿菌K12及其衍生菌株第86頁重組蛋白生產(chǎn)優(yōu)勢: a.能夠?qū)蚣右愿脑? b.基因拷貝數(shù)大量提升; c.用強開啟子進行快速轉(zhuǎn)錄; d.基因翻譯得到優(yōu)化; e.可進行主動調(diào)整; f.宿主細胞易于培養(yǎng).4.重組蛋白生產(chǎn)第87頁a.基因定位突變技術(shù)GGGTTTCCCGGGTTTAAACCCAAAGGGCCCAAATTTCCCAAAGGGCCCAAATTTGGGTTTCCCGGGTTTAAAGGGTTTAAATTTYYYXXXGGGTTTCCCGGGTTTAAACCCAAAGGGCCCAAATTTYYYYYYXXXXXXYYYAAATTT

CCCAAAYYYXXXTTTAAA

GGGTTTXXXBluntingKination LigationPCR第88頁極耐熱性木聚糖酶基因突變效果第89頁DNAmRNAProtein基因組 重組基因轉(zhuǎn)錄翻譯多拷貝強轉(zhuǎn)錄優(yōu)化翻譯b.c.d.蛋白質(zhì)合成過程中優(yōu)勢第90頁E.coli中l(wèi)ac開啟子

lac&trp開啟子雜 合體Ptac

E.coli噬菌體T7開啟 子

E.coli

l噬菌體啟 動子PLphage

PHshfrom E.colie.主動調(diào)整E.coli表示體系中調(diào)控模式第91頁

PL開啟子表示調(diào)控PL+1RBS FG Terminator

30℃40℃mRNA熱激熱敏感性抑制子cI第92頁

T7開啟子表示調(diào)控T7Promoter待表示基因宿主細胞宿主染色體質(zhì)粒質(zhì)粒PlacT7RNA聚合酶基因第93頁f.極端酶高效表示極耐熱性木聚糖酶基因表示第94頁四、生物種系遺傳改良 及疾病基因治療和基因藥品

1.基因重組微生物 2.經(jīng)過植物轉(zhuǎn)基因改良品種 3.動物轉(zhuǎn)基因 4.基因治療與基因藥品第95頁定義：代謝(路徑)工程istheuseofmoleculartechniques(orrecombinantDNAtechniques)toimprovetheefficiencyofpathwaysthatsynthesizespecificproducts.

-----LMPrescottetal.,in MICROBIOLOGY,5thed1.基因重組微生物第96頁Zymomonasmobilis乙醇發(fā)酵路徑Entner-Doudoroffpathway丙酮酸乙醛+CO2乙醇乙醇脫氫酶丙酮酸脫羧酶第97頁E.coli部分代謝路徑

EMP路徑乳酸 丙酮酸 甲酸 CO2+H2 乙酰輔酶A

磷酸轉(zhuǎn)移酶 乙醛脫氫酶 乙酰磷酸 乙醛

乙酸激酶

乙醇脫氫酶 乙酸 乙醇 乳酸脫氫酶

第98頁E.coli代謝工程

EMP路徑乳酸 丙酮酸 乙醛 甲酸 CO2+H2 乙酰輔酶A 乙醇

磷酸轉(zhuǎn)移酶 乙醛脫氫酶 乙酰磷酸 乙醛

乙酸激酶

乙醇脫氫酶 乙酸 乙醇 乳酸脫氫酶

丙酮酸脫羧酶乙醇操縱子設(shè)計宿主菌株選擇基因整合表示水平篩選條件優(yōu)化等乙醇脫氫酶外原基因構(gòu)建路徑第99頁利用木質(zhì)纖維水解液乙醇發(fā)酵菌株菌株 產(chǎn)量得率 速率 （g/l）（%）（g/l/h）Sacharomyces140021.0981.60Z.mobilisCP4 22.6881.04E.coliKO1134.7801.16代謝工程菌發(fā)酵水平比較第100頁2.經(jīng)過植物轉(zhuǎn)基因改良品種

農(nóng)桿菌屬細菌生活在土壤中，從傷口侵入植物組織后，將T-DNA插入植物染色體，產(chǎn)生激素刺激細胞生長，并指導(dǎo)細胞合成細菌所需要營養(yǎng)物質(zhì)。

A.tumefaciens促使細胞過量生長產(chǎn)生大塊細胞團，引發(fā)冠癭??；A.rhizogenes侵染植物根部造成異常生長，形成“發(fā)根”。 這兩個種是植物遺傳工程主要工具。第101頁T-DNA整合分泌細胞分裂素植物生長素植物細胞核孔VirD2分泌冠癭堿傷害分泌乙酰丁香酮農(nóng)桿菌細胞核Pi-VirA誘導(dǎo)vir表示從Ti質(zhì)粒中切出T－DNAVirD4VirD2VirB農(nóng)桿菌和植物相互作用第102頁

用Ti質(zhì)粒構(gòu)建穿梭載體第103頁

3.動物轉(zhuǎn)基因最有效方法：用病毒轉(zhuǎn)染動物或動物胚胎。主要目標(biāo)：用動物表示產(chǎn)生人類特定組織或器官；建立人類疾病治療動物模型；昆蟲、豬、羊等都能被用來表示人類蛋白。

第104頁逆轉(zhuǎn)錄蛋白（retrovirus）單鏈RNA，侵染哺乳動物；侵染后，RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生雙鏈DNA；開啟子很強，是基因治療理想載體。第105頁桿狀病毒（baculovirus） 是雙鏈DNA