3.3.1重組DNA技術(shù)基本工具課件-高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修三

我國(guó)是棉花的生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)。棉花在種植過(guò)程中，常常會(huì)受到一些害蟲(chóng)的侵襲，其中以棉鈴蟲(chóng)最為常見(jiàn)。棉鈴蟲(chóng)可以使棉花產(chǎn)量減少三分之一，嚴(yán)重時(shí)，甚至能使一片棉田絕收。大量使用農(nóng)藥殺蟲(chóng)不僅會(huì)提高生產(chǎn)成本，還可能造成農(nóng)產(chǎn)品和環(huán)境的污染。要是能培育出自身就能抵抗蟲(chóng)害的棉花新品種，這一問(wèn)題就會(huì)迎刃而解，我國(guó)擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉就是在這樣的背景下產(chǎn)生的。為什么傳統(tǒng)的雜交育種方法培育不出抗蟲(chóng)棉，基因工程卻可以呢？基因工程是如何進(jìn)行操作的？它給我們的生產(chǎn)和生活帶來(lái)了怎樣的影響呢？基因工程是指按照人們的愿望，通過(guò)轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的生物類型和生物產(chǎn)品。從技術(shù)操作層面看，由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，因此又叫做重組DNA技術(shù)。1944年，艾弗里（O.Avery，1877-1955)等人通過(guò)肺炎鏈球菌的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，不僅表明了遺傳物質(zhì)是DNA，還說(shuō)明了DNA可以在同種生物的不同個(gè)體之間轉(zhuǎn)移。1958年，梅塞爾森（M.Meselson，1930-）和斯塔爾（F.W.Stahl,1929-）用實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)了DNA的半保留復(fù)制。隨后不久，克里克提出中心法則。1961年，尼倫伯格（M.W.Nirenberg，1927-2010）和馬太（J.H.Matthaei，1929-）破譯了第一個(gè)編碼氨基酸的密碼子，截止1966年64個(gè)密碼子均被破譯。1970年，科學(xué)家在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)限1972年，伯格（P.Berg，1926-）首先在體外進(jìn)行了DNA改造的研究，成功構(gòu)建了第一個(gè)體外重組DNA分子。1973年，科學(xué)家證明質(zhì)粒可以作為基因工程的載體，構(gòu)建重組DNA，導(dǎo)入受體細(xì)胞，使外源基因在原核細(xì)胞中成功表達(dá)，實(shí)現(xiàn)物種間的基因交流，基因工程正式問(wèn)世。1950年，埃德曼（P.V.Edman，1916-1977）發(fā)明了一種測(cè)定氨基酸序列的方法。2年后，桑格（F.Sanger，1918-2013）首次完成了胰島素氨基酸序列的測(cè)定。1967年，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，在細(xì)菌擬核DNA之外的質(zhì)粒具有自我復(fù)制能力，并可在細(xì)菌細(xì)胞間轉(zhuǎn)移。20世紀(jì)70年代初，多種限制酶、DNA連接酶和逆轉(zhuǎn)錄酶被相繼發(fā)現(xiàn)。這些發(fā)現(xiàn)為DNA的切割、連接及功能基因的獲得創(chuàng)造了條件。1953年，沃森（J.D.Watson，1928-）和克里克（F.Crick，1916-2004）建立了雙螺旋結(jié)構(gòu)模型并提出了遺傳物質(zhì)自我復(fù)制的假說(shuō)。制性內(nèi)切核酸酶（簡(jiǎn)稱限制酶）。1982年，第一個(gè)基因工程藥物——重組人胰島素被批準(zhǔn)上市。基因工程藥物成為世界各國(guó)研究和投資開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)。1983年，科學(xué)家采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法培育出世界上第一例轉(zhuǎn)基因煙草。此后，基因工程進(jìn)入了迅速發(fā)展的階段。1984年，我國(guó)科學(xué)家朱作言（1941-）領(lǐng)導(dǎo)的團(tuán)隊(duì)培育出世界上第一條轉(zhuǎn)基因魚(yú)。1985年，穆里斯（K.Mullis，1944-）等人發(fā)明了PCR，為獲取目的基因提供了有效手段。1977年，桑格等科學(xué)家發(fā)明了DNA序列分析的方法，為基因序列圖的繪制提供了可能。1990年，人類基因組計(jì)劃啟動(dòng)。2003年該計(jì)劃的測(cè)序任務(wù)順利完成。21世紀(jì)以來(lái)，科學(xué)家發(fā)明了多種高通量測(cè)序技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)低成本測(cè)定大量核酸序列，加速了人們對(duì)基因組序列的了解。2013年，華人科學(xué)家張鋒（1982-）及其團(tuán)隊(duì)首次報(bào)道了利用最新的基因編輯技術(shù)——CRISPR（成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)）技術(shù)編輯了哺乳動(dòng)物基因組。該技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因的定點(diǎn)插入、敲除或替換。3.3.1重組DNA技術(shù)的基本工具番木瓜容易受環(huán)斑病毒的侵襲。當(dāng)番木瓜被這種病毒侵染后，產(chǎn)量會(huì)大大下降?？茖W(xué)家通過(guò)精心設(shè)計(jì)，用“分子工具”培育出了轉(zhuǎn)基因番木瓜，它可以抵御番木瓜環(huán)斑病毒。DNA雙螺旋的直徑只有2nm，對(duì)如此微小的分子進(jìn)行操作，是一項(xiàng)非常精細(xì)的工作，更需要專門(mén)的“分子工具”。那么，科學(xué)家究竟用到了哪些“分子工具”？這些“分子工具”各具有什么特征呢？從社會(huì)中來(lái)外源DNA片段難以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，即使進(jìn)入也很難穩(wěn)定存在、復(fù)制并表達(dá)?；蚬こ绦枰\(yùn)輸工具（分子運(yùn)輸車）將外源目的基因安全運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞中。將外源目的基因切割并做成運(yùn)輸車的一部分，可以保證運(yùn)輸成功。切割DNA需要用到分子手術(shù)刀，切割后再使用分子縫合針將目的基因縫合在運(yùn)輸車上。含目的基因分子運(yùn)輸車切割DNA分子的工具是限制性內(nèi)切酸酶，又稱限制酶，主要來(lái)自原核生物限制酶能夠識(shí)別DNA分子中特定的核苷酸序列，并使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開(kāi)（核苷酸之間的磷酸酯鍵）3.1.1.1限制性內(nèi)切核酸酶——分子手術(shù)刀TGCGTACGCA5′5′磷酸二酯鍵5′黏性末端平末端5′3′5′3′TACGTACTGAAT5′5′3′3′5′3′5′3′CGCGCGCGCGCGSamⅠ中心軸線EcoRⅠCT5′3′5′3′TAGCAGATTA5′3′5′3′CGCGCGCGCGCG5′3′5′3′5′3′5′3′CGCGCGCGCGCGApaⅠ5′3′CCCGGG3′5′5′3′GGCGCC3′5′3′黏性末端酶切后的末端堿基能自發(fā)形成氫鍵結(jié)合，即有“黏性”大多數(shù)限制酶的識(shí)別序列由6個(gè)核苷酸組成DNA分子經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的DNA片段通常有兩種形式：黏性末端和平末端3.1.1.1限制性內(nèi)切核酸酶資料卡——限制酶的命名EcoRⅠ屬名Escherichia首字母種名coli前兩個(gè)字母R型菌株從中分離的第一個(gè)限制酶T4DNA連接酶T4DNA連接酶E.coliDNA連接酶5′3′TACGTACTGAAT5′3′CT5′3′5′3′TAGCAGATTA5′3′CGCGCGCGCGCG5′3′5′3′5′3′CGCGCGCGCGCG切口切口切口酶切后黏性末端的堿基能夠自發(fā)形成氫鍵結(jié)合結(jié)合在一起問(wèn)題：上述兩組DNA片段中的黏性末端可以自發(fā)配對(duì)（形成氫鍵）嗎？5′3′TACGTA5′3′CTGAAT5′3′5′3′3′5′TACGTA5′5′CTGAAT5′3′5′3′DNA連接酶能夠?qū)NA片段連接起來(lái)基因工程常用的DNA連接酶有兩種：E.coli

DNA連接酶：連接互補(bǔ)的黏性末端，不能連接平末端T4DNA連接酶：連接互補(bǔ)的黏性末端和平末端說(shuō)明：相同的黏性末端（都是5′黏性末端或都是3′黏性末端）通過(guò)自發(fā)形成氫鍵互補(bǔ)配對(duì)，再用DNA連接酶將切口連接起來(lái)。3.1.1.2DNA連接酶——分子縫合針通常利用質(zhì)粒作為載體將基因送入細(xì)胞。質(zhì)粒是獨(dú)立于細(xì)胞核或擬核DNA之外，具有自我復(fù)制能力的環(huán)狀DNA分子質(zhì)粒DNA分子上有一個(gè)或多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)，可供外源基因插入質(zhì)粒DNA能在細(xì)胞中自我復(fù)制，或整合到受體DNA上，隨受體DNA復(fù)制而復(fù)制質(zhì)粒上常有特殊的標(biāo)記基因，如抗性基因，便于重組DNA分子的篩選3.1.1.3基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——分子運(yùn)輸車氨芐青霉素抗性基因目的基因插入位點(diǎn)復(fù)制起點(diǎn)擬核質(zhì)粒大腸桿菌細(xì)胞氨芐青霉素抗性基因目的基因LacZ基因表達(dá)產(chǎn)生的酶能夠分解X-gal產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)，從而使菌落呈藍(lán)色；否則菌落呈白色。問(wèn)題：哪種大腸桿菌可以在含X-gal和青霉素的固體培養(yǎng)基上存活形成藍(lán)色菌落?lacZ基因標(biāo)記基因進(jìn)行篩選重組DNA分子舉例基因工程常用的載體除質(zhì)粒外，還有噬菌體、動(dòng)植物病毒等3.1.1.3基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——分子運(yùn)輸車思考?討論——重組DNA分子請(qǐng)你在上述序列中找到EcoRⅠ的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)。然后，用剪刀進(jìn)行“切割”。待切割位點(diǎn)全部切開(kāi)后，將從下面那條DNA鏈上切下的片段重組到上面那條DNA鏈的切口處，并用透明膠帶將切口粘起來(lái)。5′-ATTGCAGCTATCCATGAATTCGGCATA-3′3′-TAACGTCGATAGGTACTTAAGCCGTAT-5′CG5′-TCCTAGAATTCTCGGTATGAATTCATA-3′3′-AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAGTAT-5′CG思考?討論——重組DNA分子5′-AATTCGGCATA-3′3′-GCCGTAT-5′CG5′-TCCTAGAATTCTCGGTATGAATTCATA-3′3′-AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAGTAT-5′CG5′-ATTGCAGCTATCCATG3′-TAACGTCGATAGGTACTTAA-5′-3′-3′-5′5′-3′--3′-5′5′-3′-5′-ATTGCAGCTATCCATG3′-TAACGTCGATAGGTACTTAAAATTCGGCATA-3′GCCGTAT-5′CGAATTCTCGGTATGGAGCCATACTTAA膠帶膠帶思考?討論——重組DNA分子討論：1．剪刀和透明膠帶分別代表哪種“分子工具”？2．你制作的黏性末端的堿基能不能互補(bǔ)配對(duì)？如果不能，可能是什么原因造成的？3．你插入的DNA片段能稱得上一個(gè)基因嗎？5′-ATTGCAGCTATCCATG3′-TAACGTCGATAGGTACTTAAAATTCGGCATA-3′GCCGTAT-5′CGAATTCTCGGTATGGAGCCATACTTAA膠帶膠帶隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展，生產(chǎn)和消費(fèi)“分子工具”的公司大量涌現(xiàn)。感興趣的話，你可以登錄這些公司的網(wǎng)站，查詢和了解相關(guān)產(chǎn)品的特點(diǎn)、價(jià)格和使用說(shuō)明等。有些這樣的公司已經(jīng)上市，你還可以通過(guò)分析公司的股票價(jià)格走勢(shì)，大致了解公司的運(yùn)營(yíng)狀況以及投資者目前對(duì)該行業(yè)的認(rèn)可程度。到社會(huì)中去實(shí)驗(yàn)原理可以利用DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)在理化性質(zhì)方面的差異，對(duì)它們進(jìn)行提取DNA不溶于（冷）酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精DNA在不同NaCl溶液中的溶解度不同，可溶于2M的NaCl溶液中在一定的溫度下（沸水?。?，DNA遇二苯胺試劑會(huì)呈現(xiàn)藍(lán)色探究?實(shí)踐——DNA的粗提取與鑒定探究?實(shí)踐——DNA的粗提取與鑒定1．30g洋蔥切碎＋10mL研磨液，充分研磨。2．雙層紗布過(guò)濾，4℃放置