醫(yī)用基因工程課件

第一章核酸的結(jié)構(gòu)與功能一、核酸的種類與組成二、DNA的結(jié)構(gòu)與功能三、RNA的結(jié)構(gòu)與功能四、其它小分子RNA五、雙鏈RNA（dsRNA）一、核酸的種類與組成核酸的基本構(gòu)成單位是核苷酸，是由多個(gè)核苷酸連接而成，又稱多聚核苷酸。（一）化學(xué)組成：堿基+戊糖+磷酸（二）種類：DNA/RNA兩類1.堿基2.戊糖3.核苷4.核苷酸

5.核酸DNA/RNA比較核酸堿基核糖磷酸嘌呤嘧啶DNAA、GC、T脫氧核糖磷酸RNAA、GC、U核糖磷酸堿基DNA/RNA均有A、G、C，但DNA中由胸腺嘧啶T替換了RNA中的尿嘧啶U。戊糖RNA中為β-D-核糖，DNA中為β-D-2-脫氧核糖。核苷堿基和核糖通過糖苷鍵連成核苷：嘌呤類以N9與核糖C1相連，嘧啶類以N1與核糖C1相連。核苷酸任何核苷與磷酸縮合（磷酸化）生成的磷酸酯稱為核苷酸。由核糖核苷（或脫氧核苷）生成的磷酸酯稱核糖核苷酸（或脫氧核糖核苷酸）。根據(jù)縮合在C5上的磷酸數(shù)目又可組成：核苷一磷酸（NMP/dNMP）；核苷二磷酸（MDP/dNDP）；核苷三磷酸（NTP/dNTP）。（如圖）核酸由多個(gè)核苷酸通過C3-C5的磷酸二酯鍵連接而成的多核苷酸鏈。種類有DNA、RNA兩種二、DNA的結(jié)構(gòu)與功能（一）DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)（二）DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)（三）功能（四）三鏈DNA（一）DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)核苷酸中脫氧核糖和磷酸的一樣，但由于堿基不同而帶有不同的遺傳信息，通常稱為堿基序列（又稱堿基對(duì)，bp）。人類有3×109bp。（二）DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)1.Watson-Crick雙螺旋結(jié)構(gòu)模型兩條逆向（5’-3’/3’-5’）平行的脫氧核糖核苷酸鏈彼此間以A=T，G≡C的堿基氫鍵相連。（如圖1-7）。由于不同濕度、離子強(qiáng)度，分子構(gòu)象呈現(xiàn)多樣性（多態(tài)性）有A、B、B’、C、C’、C’’、D、E、S、Z等構(gòu)象。由于雙鏈的扭結(jié)或進(jìn)一步盤繞可形成三級(jí)結(jié)構(gòu)等超螺旋結(jié)構(gòu)，其意義：①使DNA體積壓縮變小，節(jié)約空間位置；②使DNA遺傳信息獲得穩(wěn)定儲(chǔ)存。（三）功能1.可提供64個(gè)遺傳密碼的遺傳信息（如表）2.可按半保留方式進(jìn)行復(fù)制，穩(wěn)定傳代3.可通過轉(zhuǎn)錄mRNA合成蛋白質(zhì)，可遵循遺傳的中心法則。逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)又使該中心法則得以修正可由RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。（四）三鏈DNA三鏈DNA由于雙螺旋的一股輕微旋轉(zhuǎn)、折疊后，該股中的堿基可與雙螺旋的堿基以Hoogsteen氫鍵相連如TAT、CGC、TAA、CGG。（如圖）三鏈DNA結(jié)構(gòu)類型、意義：①可作為精確切割DNA的靶序列的“分子剪刀”②抑制基因表達(dá)（轉(zhuǎn)錄）（反義DNA基因治療）③影響DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合及DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等，此外，還有四鏈DNA。三、RNA的結(jié)構(gòu)與功能通常為單鏈，T被U替代（T是U的甲基取代衍生物）；由核糖取代脫氧核糖，因RNA由DNA轉(zhuǎn)錄而成，故保留有DNA遺傳信息。RNA由rnRNA、rRNA、tRNA三種類型共同擔(dān)負(fù)著基因表達(dá)、表達(dá)調(diào)控和蛋白質(zhì)合成的任務(wù)。四、其它小分子RNA（一）細(xì)胞核內(nèi)RNA（hnRNA和SnRNA）（二）反義RNA（三）核酶（一）細(xì)胞核內(nèi)RNA（hnRNA和SnRNA）DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物很不均一，故將mRNA前體稱為不均一核RNA（核內(nèi)hnRNA）。此外，核內(nèi)還存有小核RNA（SnRNA），約為70~300個(gè)核苷酸，可參與真核生物的RNA剪接。（二）反義RNA反義RNA：指能與特定mRNA互補(bǔ)結(jié)合的RNA片斷，其功能：①阻斷mRNA的翻譯②抑制DNA復(fù)制③可選擇性地關(guān)閉基因。意義：①參與基因調(diào)控②可用于基因治療（病毒、腫瘤）（三）核酶

核酶是指具有催化活性的RNA，命名為核酶（ribozyme），又指“酶RNA”。酶RNA不用于RNA酶（Rnase），前者是RNA，后者是蛋白質(zhì)。核酶呈錘頭狀（如圖）。

由13個(gè)保守核苷酸殘基好個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的錘頭狀二級(jí)結(jié)構(gòu)，剪切反應(yīng)是在GUX序列的3’端自動(dòng)發(fā)生。催化結(jié)構(gòu)域（R）可據(jù)底物（S）和R在錘頭結(jié)構(gòu)中的相對(duì)位置行使對(duì)S（底物）的剪接。功能：參加RNA剪切和降解。意義：①腫瘤的基因治療（人工合成錘頭狀核酶）②HIV-1等病毒病的治療五、雙鏈RNA（dsRNA）小分子的雙鏈RNA能引發(fā)轉(zhuǎn)錄后的基因沉默（Post-transcriptionalgenesilencingPTGS）或RNA干擾（RNAinterference，RNAi）。該dsRNA在Dicer酶作用下可被降解，進(jìn)而發(fā)生基因干擾（或沉默），也就是說阻斷了基因的表達(dá)。（機(jī)理如圖）特點(diǎn)：①不同SiRNA序列可行使特異識(shí)別，切割作用②mRNA被切割后所產(chǎn)生的dsRNA在RNA依賴性RNA多聚物下可發(fā)生PCR擴(kuò)增起放大干擾效應(yīng)③dsRNA可進(jìn)行人工設(shè)計(jì)合成，也可用于載體構(gòu)建體外擴(kuò)增或基因敲除工具，可應(yīng)用于病毒病、腫瘤基因治療。第一節(jié)

基因的概念

一、基因與“遺傳因子”二、基因與染色體三、基因與蛋白質(zhì)四、基因與DNA五、基因密碼的破譯六、基因的概念七、基因的新概念一、基因與“遺傳因子”對(duì)遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)的認(rèn)識(shí)有個(gè)發(fā)展過程，孟德爾（G.Menodel）在1857～1864年以豌豆為材料進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)的研究中,提出“遺傳因子”決定和控制著生物體的各種性狀。1909年丹麥生物學(xué)家W.Johannsen為了強(qiáng)調(diào)“遺傳因子”與生命的關(guān)系,他根據(jù)希臘“給予生命”之義的詞“gene”（基因）創(chuàng)造性地用“gene”這個(gè)術(shù)語來代替“遺傳因子”?；蜻@個(gè)詞當(dāng)時(shí)被用來描述遺傳性狀，但對(duì)基因的物質(zhì)概念還未能認(rèn)識(shí)，只是遺傳的一個(gè)符號(hào)。孟德爾的豌豆雜交試驗(yàn)

遺傳因子是成對(duì)的，一個(gè)來自父本，一個(gè)來自母本，形成配體時(shí)彼此分開，在性細(xì)胞中是成單的，雜交子一代各自保持獨(dú)立和純一狀態(tài)，形成配子時(shí)又彼此分開，互不混雜，完整地傳給后代，雌雄配

子結(jié)合有等同隨機(jī)結(jié)合的機(jī)會(huì)。

圓形種子＋皺形種子

雜交第一代(均為圓形)

回交

圓形豆皺形豆

5474粒1850粒

3：1黃色圖形＋綠色皺形雜交第一代(均為黃色圓形)回交黃色圓形豆黃色皺形豆綠色圓形豆綠色皺形豆315粒121粒108粒32粒9

：

：

：331二、基因與染色體1910年～1926年,美國的摩爾根（T.H.Morgan）選用果蠅做研究材料，發(fā)現(xiàn)了基因連鎖和交換現(xiàn)象，創(chuàng)立了遺傳的染色體理論（Chromosomoltheoryofinheritance），繪制了基因連鎖圖,接受了孟德爾的遺傳原理,指出遺傳物質(zhì)必須由某種獨(dú)立的要素組成,即遺傳因子或叫做基因。從而證明了基因是位于染色體上呈直線按順序排列的遺傳單位，基因是攜帶遺傳信息的結(jié)構(gòu)單位，又是控制遺傳性狀的功能單位。摩爾根果蠅雜交試驗(yàn)有4對(duì)染色體，一對(duì)小粒狀，2對(duì)V形，一對(duì)呈棒狀XX或XY（性染色體）

X1X2（紅眼）+XWY（白眼）（野生型）（突變型）雜交子一代（雌雄均為紅眼）

X1XW，X1Y，X2XW，X2YX1X1，X1Y，XWX1，XWY，X2X1，X2Y，XWX2，XWY?為紅眼雄性及白眼雄性三、基因與蛋白質(zhì)1941年G.W.Beadle和E.L.Tatum應(yīng)用X射線誘導(dǎo)鏈孢霉菌（Newosporecrassa）在DNA損傷修復(fù)后,產(chǎn)生了大量營養(yǎng)缺陷性突變體,提出了“一個(gè)基因一種酶”學(xué)說,后來又修正為“一個(gè)基因一種蛋白質(zhì)”的學(xué)說,或“一個(gè)基因一種多肽鏈”學(xué)說。

四、基因與DNA1928年美國O.T.Avery首次證明了控制遺傳特性的物質(zhì)是DNA,而不是蛋白質(zhì),染色體上的基因?yàn)镈NA分子。1953年J.watson和F.Crick根據(jù)堿基配對(duì)規(guī)律和DNA分子的X射線衍射圖譜等實(shí)驗(yàn),提出了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)。1958年證明了DNA半保留復(fù)制和DNARNA蛋白質(zhì)合成的中心法則（如圖）。遺傳中心法則五、基因密碼的破譯1961年F.Crick,S.Brenner,M.W.Nirenberg,H.G.Khorana等確立了每三個(gè)核苷酸可作為決定一個(gè)氨基酸的密碼子。1964年64種三聯(lián)密碼子全部被破譯公布。64種密碼子中有61個(gè)密碼子可用于編碼20種氨基酸,有3個(gè)密碼子為終止信號(hào),只表示鏈的終止,不表達(dá)任何氨基酸。其中AUG為啟始密碼子，并具有通用性、偏愛性和簡并性。遺傳密碼的兼并性六、基因的概念按照分子生物學(xué)理論，基因的概念應(yīng)當(dāng)是指編碼有功能蛋白質(zhì)多肽鏈或RNA分子所必需的全部核酸序列（即DNA序列）。根據(jù)這個(gè)概念，一個(gè)基因不僅含編碼蛋白質(zhì)肽鏈或RNA分子的核酸序列,還包括保證轉(zhuǎn)錄所必需的非編碼的調(diào)控序列即位于編碼區(qū)上游5’端的啟動(dòng)子非編碼序列、內(nèi)含子（intron）和位于編碼區(qū)下游3’端的終止子非編碼序列。編碼區(qū)是發(fā)揮基因功能的結(jié)構(gòu)基因（或功能基因），而起調(diào)控、啟動(dòng)和終止作用的非編碼區(qū)屬于調(diào)控基因。

七、基因的新概念1、移動(dòng)基因2、斷裂基因（splitgene）3、重疊基因4、假基因5、重復(fù)序列及重復(fù)基因1、移動(dòng)基因

移動(dòng)基因（movablegene）又叫轉(zhuǎn)位因子（transposableelements）,由于它可以在染色體基因組上移動(dòng)，甚至可在不同染色體間躍遷，故又稱跳躍基因（jumpinggene）,這種基因是J.A.Shapiro在研究大腸桿菌高效突變時(shí)發(fā)現(xiàn)的。有三種類型：1.插入序列（insertionsequences,簡稱IS），其長度為數(shù)百個(gè)到數(shù)千個(gè)堿基對(duì)之間（如圖1-1）。2.轉(zhuǎn)位子（Tn)，即兩側(cè)的IS和一個(gè)中心序列（帶有遺傳信息）3.噬菌體Mu和D108，其轉(zhuǎn)位作用如圖1-2。2、斷裂基因（splitgene）

在真核細(xì)胞中的核苷酸序列中間插入與氨基酸編碼無關(guān)的DNA間隔區(qū)段，使一個(gè)有功能的結(jié)構(gòu)基因分隔成不連續(xù)的若干區(qū)段，將這種編碼序列不連續(xù)，有間隔區(qū)段的DNA片斷稱為斷裂基因。這種非編碼間隔區(qū)段DNA稱間隔子（內(nèi)含子），有轉(zhuǎn)錄和編碼功能的編碼序列稱表達(dá)子。原核細(xì)胞無內(nèi)含子。其二者mRNA剪輯作用如圖1-3，1-4，1-53、重疊基因

不同基因的核苷酸序列有時(shí)為相鄰兩個(gè)基因共用，將核苷酸彼此重疊的兩個(gè)基因稱為重疊基因（overlappinggenes）,在

174噬菌體有兩種類型的重疊基因（圖1-6）。4、假基因

在珠蛋白基因簇（genecluster）各片斷核苷酸序列分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，除了有正常的功能基因之外，還有功能失活的特殊序列片斷，它不能行使表達(dá)功能。該類無表達(dá)功能的畸變核苷酸基因序列片斷，稱為假基因。其產(chǎn)生原因如圖1-7、1-85、重復(fù)序列及重復(fù)基因

幾乎所有的真核細(xì)胞（酵母除外）的基因組DNA中都具有重復(fù)序列（repeatedsequence）,它無轉(zhuǎn)位移動(dòng)能力，因此它區(qū)別于轉(zhuǎn)位作用的IR（invertedrepeat）。IR是指序列的重復(fù)性。但無基因序列的交叉重疊性，故不同于重疊基因序列。重復(fù)序列可分為四種類型：(1)不重復(fù)序列，是唯一的序列，只有一個(gè)拷貝。(2)低度重復(fù)序列，一般有1-10個(gè)拷貝。(3)中度重復(fù)序列，有數(shù)十至數(shù)萬（105）拷貝。如圖1-9、1-10(4)高度重復(fù)序列拷貝數(shù)可達(dá)106以上,包括衛(wèi)星DNA、高豐度SINE家族的Alu序列。第二節(jié)

基因組

“基因組”是表示某物種單倍體的總DNA，對(duì)于二倍體高等生物其配子的DNA總和即為一組基因組。不同生物基因組數(shù)目不同，如表研究得較多的為以下三類基因組：

一、病毒基因組二、細(xì)菌基因組三、真核生物基因組第三節(jié)

基因工程的定義和研究內(nèi)容

基因工程的定義通常是指在體外把核酸分子（基因）組合到特定的載體上（病毒，質(zhì)粒，噬菌體等）并使之進(jìn)入（或?qū)耄┑皆瓉頉]有這類分子的宿主體內(nèi)，能使基因在宿主內(nèi)繁殖或表達(dá)生物活性物質(zhì)。基因工程的核心內(nèi)容是重組DNA技術(shù)，還包括體外DNA突變，體內(nèi)基因操作以及基因的化學(xué)合成等。第四節(jié)

基因工程的發(fā)展史

一、四大里程碑二、三大技術(shù)發(fā)明三、基因工程的誕生病毒基因組特點(diǎn)：1.結(jié)構(gòu)簡單，無細(xì)胞結(jié)構(gòu)，基因組為DNA或RNA組成，有雙鏈/單鏈，環(huán)狀/線狀。2.有調(diào)控元件和轉(zhuǎn)錄元件組成，轉(zhuǎn)錄元件可轉(zhuǎn)錄成為多順反子mRNA。3.有重疊基因。4.逆轉(zhuǎn)錄病毒（RV）可使RNA變cDNA其結(jié)構(gòu)如圖，具U3RU5的長末端重復(fù)序列（LTR），具隨機(jī)整和能力，可用作病毒載體。細(xì)菌基因組約有三千個(gè)基因，無內(nèi)含子，為雙鏈DNA，但無核仁、核膜，多為單拷貝，無重疊基因，有多種功能調(diào)控區(qū)，有復(fù)制起始區(qū)、終止區(qū)、轉(zhuǎn)錄起始區(qū)，終止區(qū)常有反向重復(fù)序列。另外有質(zhì)粒存在，質(zhì)粒可作為載體。真核生物基因組特點(diǎn)：大而復(fù)雜，為雙倍體，有低中高重復(fù)序列，多為斷裂基因，基因組中非編碼區(qū)多于編碼區(qū)（占90%），大多于蛋白質(zhì)結(jié)合形成染色體，DNA占35%，RNA占5%，其余為蛋白質(zhì)（組蛋白或非組蛋白）與C值矛盾：一般高等生物的全部DNA量（稱C值）均大于低等生物，但某些植物或兩棲動(dòng)物的C值比人高出幾十倍，這種與進(jìn)化復(fù)雜性不一致的C值反?，F(xiàn)象稱為C值矛盾。類型多基因家族四大里程碑遺傳物質(zhì)的明確——DNADNA雙螺旋結(jié)構(gòu)理論（半保留復(fù)制及其中心法則）基因遺傳密碼子的破譯基因轉(zhuǎn)譯載體的發(fā)現(xiàn)三大技術(shù)發(fā)明工具酶的發(fā)明：內(nèi)切酶、合成酶、連接酶基因合成和測序（合成儀、測序儀）PCR技術(shù)（PCR擴(kuò)增儀）基因工程的誕生1972年是基因工程的誕生之年。美國斯坦福大學(xué)P.Berg將SV40的DNA導(dǎo)入噬菌體載體在大腸桿菌中獲表達(dá)。S.Cohen等人將抗四環(huán)素、新霉素基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得抗四環(huán)素，抗新霉素重組菌落，從而揭開基因工程的序幕。類型單拷貝序列：人類約占60%~65%中度重復(fù)序列：長短300~700bp，重復(fù)次數(shù)達(dá)105。通常為Alu、KpnⅠ、Hinf、rRNA、tRNA、組蛋白基因等。高度重復(fù)序列：衛(wèi)星DNA及微衛(wèi)星DNA反向重復(fù)序列：人類約占5%，長度300bp在復(fù)性時(shí)，若有間隔序列，可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，若無間隔序列，可形成回文結(jié)構(gòu)，可能與復(fù)制、轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)。多基因家族指來源相同，結(jié)構(gòu)相似，功能相關(guān)的基因在染色體上成串存在，形成多基因家族。如rRNA、tRNA、組蛋白基因等為成串的，干擾素、珠蛋白、生長激素等為分散的。衛(wèi)星DNA衛(wèi)星DNA又稱隨體DNA，由CsCl超速離心后，分散在主峰旁，形似衛(wèi)星分布而稱之。一般5-10bp短序列，人類為171bp，保護(hù)和穩(wěn)定染色體。近來又發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星DNA，又稱簡單重復(fù)序列，一般由1-6bp的串聯(lián)重復(fù)單位組成，有2bp、5bp、6-7bp不等，以2bp為常見。人類基因組中2bp（≥14）的重復(fù)序列呈高度多態(tài)性。采用限制性長度多態(tài)性（RFLP）分析，可用于基因連鎖的遺傳標(biāo)記，廣泛用于診斷。第一節(jié)

基因表達(dá)的概述和基本條件

一、基因表達(dá)的基本概念二、基因表達(dá)的基本條件三、真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)及調(diào)控第二節(jié)

在大腸桿菌中影響外源基因表達(dá)的因素一、啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)對(duì)表達(dá)效率的影響二、表達(dá)載體的選擇三、外源基因（cDNA）中密碼子的作用四、mRNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)與基因表達(dá)五、mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)翻譯起始的影響六、mRNA穩(wěn)定性的影響七、轉(zhuǎn)錄終止區(qū)對(duì)外源基因表達(dá)效率的影響八、轉(zhuǎn)錄后的若干因素與基因表達(dá)的關(guān)系九、宿主選擇對(duì)表達(dá)的影響十、培養(yǎng)條件的控制對(duì)表達(dá)效率的影響一、基因表達(dá)的基本概念

生物體的遺傳信息都是以核苷酸序列編碼的形式儲(chǔ)存在遺傳物質(zhì)DNA上,基因表達(dá)是目的基因DNA在導(dǎo)入的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄成mRNA,再以mRNA指導(dǎo)翻譯成蛋白質(zhì)?；虻谋磉_(dá)依賴于有效的轉(zhuǎn)錄和mRNA的正確翻譯以及翻譯后的加工處理等各個(gè)環(huán)節(jié)的調(diào)節(jié)作用，其中轉(zhuǎn)錄最為關(guān)鍵，原核的基因表達(dá)過程和方式與真核細(xì)胞有顯著不同。二、基因表達(dá)的基本條件1.外源基因插入序列必須保持正確的方向和閱讀框架。其遺傳密碼不得缺失、遺漏、或錯(cuò)位及錯(cuò)碼。否則會(huì)導(dǎo)致編碼錯(cuò)誤的蛋白質(zhì)分子，特別是目的基因序列內(nèi)部應(yīng)不含兩端酶切位點(diǎn)的識(shí)別序列。2.插入的外源基因必須放在原核的啟動(dòng)子控制之下，也就是使原核的RNA聚合酶能夠識(shí)別插入的基因。3.外源基因必須能在大腸桿菌中進(jìn)行有效轉(zhuǎn)錄（如無內(nèi)含子），轉(zhuǎn)錄后的mRNA在菌體必須相當(dāng)穩(wěn)定，并且能有效地進(jìn)行翻譯，轉(zhuǎn)譯的蛋白分子在菌體內(nèi)不致于受菌體蛋白酶的降解。

三、真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)及調(diào)控真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)及調(diào)控的特點(diǎn)㈠有效轉(zhuǎn)錄及其調(diào)控元件

㈡正確轉(zhuǎn)譯

㈢原核表達(dá)載體的構(gòu)建㈠有效轉(zhuǎn)錄及其調(diào)控元件

1.RNA聚合酶2.啟動(dòng)子及其轉(zhuǎn)錄作用的啟動(dòng)（啟動(dòng)子的概念、分類）3.轉(zhuǎn)錄作用的終止4.轉(zhuǎn)錄的弱化作用㈡正確轉(zhuǎn)譯

1.起始密碼子（intiqtioncodon,initiator）2.核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS，又稱SD序列）㈢原核表達(dá)載體的構(gòu)建

原核表達(dá)載體的構(gòu)建的要求1.表達(dá)載體類型2.表達(dá)載體的舉例3.包涵體表達(dá)載體啟動(dòng)子⑴乳糖啟動(dòng)子（Lac）⑵Trp啟動(dòng)子⑶Tac啟動(dòng)子⑷噬菌體的PL和PR啟動(dòng)子⑸脂蛋白啟動(dòng)子（LPP）啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)對(duì)表達(dá)效率的影響啟動(dòng)子-35區(qū)和-10區(qū)序列與通用轉(zhuǎn)錄序列一致，間距為17bp，大于17bp效果差，不同產(chǎn)物選用不同啟動(dòng)子，如尿激酶用ptac，IL2/2FU-V用PRPL啟動(dòng)子效果好。表達(dá)載體的選擇載體分子量不宜過大，以2.5-5.6kb為佳，高拷貝，不同產(chǎn)物選用不同類型表達(dá)載體。外源基因（cDNA）中密碼子的作用細(xì)菌中基因表達(dá)對(duì)密碼子有偏愛性，不偏愛的稀有密碼子（AGA、AGG）表達(dá)效果差，特別當(dāng)有AGA-AGG連續(xù)序列存在時(shí)表達(dá)效率低mRNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)與基因表達(dá)啟始密碼子：表達(dá)效率AUG>GUG>UUGSD序列：較長的效率高，如UAAGGAGG比AAGAA高三倍；SD序列與AUG間距一般6-12bp，4-10bp較佳，9bp最佳；SD序列的5’非翻譯區(qū)，若有5’-UGAUCU，則有增強(qiáng)作用。mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)翻譯起始的影響mRNA形成二級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)，可產(chǎn)生莖環(huán)。若SD序列、AUG位于莖環(huán)內(nèi)或發(fā)夾內(nèi)，轉(zhuǎn)譯受抑制；在莖環(huán)外則有利于轉(zhuǎn)譯。見表6-1mRNA穩(wěn)定性的影響REP序列可阻止mRNA降解，偏愛密碼子也起保護(hù)作用。真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)及調(diào)控的特點(diǎn)只有一種RNA聚合酶以操縱子為單位來完成基因轉(zhuǎn)錄基因轉(zhuǎn)錄無RNA剪接功能因無核仁、核膜，核酸均為裸露的，轉(zhuǎn)錄與翻譯是連續(xù)進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在多聚核糖體上合成，同時(shí)合成多條肽鏈有特有SD序列，調(diào)控mRNA與核糖體有效結(jié)合和翻譯的起始無糖基化功能RNA聚合酶原核細(xì)胞只有一種RNA聚合酶，當(dāng)其核心酶與σ因子結(jié)合，形成全酶后，才能識(shí)別DNA上的啟動(dòng)子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子的概念啟動(dòng)子是位于結(jié)構(gòu)基因上游，轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控所必需的一段DNA序列，內(nèi)含-35區(qū)（與σ因子結(jié)合）和-10區(qū)（和核心酶結(jié)合）的保守序列。當(dāng)啟動(dòng)子與全酶結(jié)合后可在+1轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)開始轉(zhuǎn)錄，如圖6-1。轉(zhuǎn)錄作用的終止由轉(zhuǎn)錄終止子發(fā)揮作用，凡能使轉(zhuǎn)錄終止的有關(guān)的DNA的序列稱終止子。強(qiáng)終止子：不依賴ρ因子發(fā)揮終止作用，回文序列中G/C配對(duì)多，有四個(gè)以上U，致使RNA聚合酶構(gòu)象改變而終止轉(zhuǎn)錄。如圖6-9,如圖6-10弱終止子：依賴ρ因子發(fā)揮終止作用。如圖6-11轉(zhuǎn)錄的弱化作用轉(zhuǎn)錄的弱化作用使轉(zhuǎn)錄沒有到達(dá)終止信號(hào)處而中途停止轉(zhuǎn)錄，使mRNA轉(zhuǎn)錄發(fā)生部分停止，而不是發(fā)生全部停止。

起始密碼子起始密碼子是編碼多肽鏈第一位氨基酸的密碼子AUG（或ATG），編碼甲硫氨酸（蛋氨酸）。在細(xì)菌中也有罕見的起始密碼子GUG，編碼纈氨酸。其起始表達(dá)作用AUG＞GUG。核糖體結(jié)合位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄mRNA的AUG上游具有的，能與核糖體發(fā)生有效結(jié)合和轉(zhuǎn)譯所需要的序列（RBS），長度為3-9bp，距AUG3-11bp，它與16srRNA3’末端（AUUCCUCCAC-DAG-5’）互補(bǔ)其互補(bǔ)程度、SD與AUG間距等與轉(zhuǎn)譯效果有關(guān)。如圖表達(dá)載體類型表達(dá)載體的類型主要有四種：非融合型表達(dá)載體，如PKK223-3如圖6-14分泌型表達(dá)載體，如PINⅢ-ompA1如圖6-15融合蛋白型表達(dá)載體，如PGEX如圖6-16包涵體型表達(dá)載體，如pBV220如圖6-17原核表達(dá)載體的構(gòu)建的要求完整的表達(dá)載體（質(zhì)粒）應(yīng)有強(qiáng)啟動(dòng)子（P）、終止子（T）、多個(gè)酶切位點(diǎn)、有抗性標(biāo)記、復(fù)制子和RBS的SD序列。（如圖6-13）還應(yīng)結(jié)合考慮：質(zhì)粒的拷貝能力和穩(wěn)定性，轉(zhuǎn)譯蛋白的表達(dá)形式和存放地點(diǎn)（分泌型/包涵體/融合蛋白），蛋白質(zhì)的分子量、性質(zhì)和穩(wěn)定性以及選擇合適宿主細(xì)胞。乳糖啟動(dòng)子（Lac）無乳糖時(shí)，調(diào)節(jié)基因（I）產(chǎn)生阻遏蛋白與操縱基因結(jié)合，阻止RNA聚合酶結(jié)合進(jìn)而阻止轉(zhuǎn)錄；有乳糖時(shí)，乳糖能與阻遏蛋白結(jié)合，使其變構(gòu)解離而行使轉(zhuǎn)錄功能。如圖6-2而LacZ基因可由IPTG（異丙基硫代-β-D-半乳糖）誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄。Lac啟動(dòng)子改建如圖6-3、6-4(a)

(b)Trp啟動(dòng)子色氨酸啟動(dòng)子（Trp）的阻遏蛋白在有色氨酸時(shí)，二者結(jié)合，阻遏蛋白變構(gòu)激活而與啟動(dòng)子結(jié)合，阻止RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄。無色氨酸時(shí)，阻遏解除，因β-吲哚丙烯酸是色氨酸的競爭性抑制劑，常用作誘導(dǎo)劑，誘發(fā)色氨酸啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄。（如圖6-5）同時(shí)，衰減子對(duì)Trp轉(zhuǎn)錄也有調(diào)節(jié)作用（如圖6-6）Tac啟動(dòng)子Tac啟動(dòng)子是由Trp啟動(dòng)子和Lac啟動(dòng)子構(gòu)建而成的雜合啟動(dòng)子，-35區(qū)為Trp啟動(dòng)子順序，-10為LacUV5啟動(dòng)子順序，二者之間距離為16bp者為pTrc，17bp者為pTac。該啟動(dòng)子只需用IPTG誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄即可。如圖6-7噬菌體的PL和PR啟動(dòng)子PL為λφ左向啟動(dòng)區(qū)，PR為右向轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)，與CI阻遏蛋白結(jié)合，可抑制OL或OR

轉(zhuǎn)錄，但CI在42℃誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄（如圖6-8）。脂蛋白啟動(dòng)子（LPP）脂蛋白為細(xì)胞外膜蛋白，細(xì)菌中含量高，該啟動(dòng)子表達(dá)效率高，由信號(hào)肽可將基因表達(dá)產(chǎn)物分泌到胞外，常用來構(gòu)造分泌型表達(dá)載體。第一節(jié)

真核細(xì)胞基因表達(dá)的調(diào)控

一、真核生物基因表達(dá)的特點(diǎn)及優(yōu)勢二、真核細(xì)胞表達(dá)及調(diào)控元件第二節(jié)

哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的選擇標(biāo)記基因

一、胸苷激酶基因選擇標(biāo)記（定義）二、二氫葉酸還原酶基因選擇標(biāo)記三、新霉素抗性基因選擇標(biāo)記四、氯霉素已酰轉(zhuǎn)移酶基因選擇標(biāo)記五、黃嘌呤-鳥嘌呤轉(zhuǎn)移酶（XGPRT）基因第三節(jié)

真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的載體種類

一、載體的類型二、幾種常用的真核表達(dá)載體一、真核生物基因表達(dá)的特點(diǎn)及優(yōu)勢

1.細(xì)胞的全能性2.轉(zhuǎn)錄和翻譯分開進(jìn)行3.有相當(dāng)大的非編碼區(qū)（調(diào)控序列）4.有三種不同RNA聚合酶參與轉(zhuǎn)錄5.初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物能進(jìn)行剪接加工修飾6.不存在操縱子結(jié)構(gòu)7.基因多拷貝，功能基因分散在不同區(qū)域，分別轉(zhuǎn)錄二、真核細(xì)胞表達(dá)及調(diào)控元件

（一）真核生物基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控

（二）轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控

（三）翻譯水平的調(diào)控

胸苷激酶胸腺嘧啶核苷激酶簡稱胸苷激酶（thymidineKinase,TK）在所有真核細(xì)胞中都有表達(dá),是嘧啶生物合成補(bǔ)救代謝途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶,它可催化胸苷磷酸化轉(zhuǎn)變成為dTMP,繼續(xù)磷酸化生成dTTP,參與DNA的生物合成。一、載體的類型1.質(zhì)粒型載體2.病毒載體3.整合型表達(dá)載體4.游離型表達(dá)載體5.瞬時(shí)表達(dá)載體6.穩(wěn)定性表達(dá)載體7.非復(fù)制性HSV-Ⅰ病毒（單純皰疹病毒HSV-Ⅰ型）載體8.裂解性HSV-Ⅰ病毒載體二、幾種常用的真核表達(dá)載體㈠逆轉(zhuǎn)錄病毒載體1.卸甲載體2.穿梭載體㈡痘類病毒載體㈢HSV-Ⅰ單純皰疹病毒載體1.重組病毒型載體2.重組質(zhì)粒型載體3.裂解型病毒載體

（一）真核生物基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控

基因調(diào)控的順式作用元件啟動(dòng)子增強(qiáng)子RNA剪接信號(hào)負(fù)調(diào)控元件終止子和polyA信號(hào)基因調(diào)控的反式作用因子概念反式作用因子主要作用規(guī)律（二）轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控mRNA前體加工：轉(zhuǎn)錄的mRNA前體經(jīng)5’加帽，3’酶切加尾去除內(nèi)含子后，產(chǎn)生成熟mRNA，通過核孔進(jìn)入胞質(zhì)中。RNA編輯（RNAediting）（三）翻譯水平的調(diào)控翻譯起始序列eIF-2的磷酸化反應(yīng)由模板來源的遺傳信息，進(jìn)而可編碼產(chǎn)生不同氨基酸序列的多種蛋白質(zhì)，這是生物適應(yīng)性的保護(hù)措施。順式作用元件順式作用元件為一些能與DBP結(jié)合的特定序列DNA片段,位于真核基因上游,含有特有的相似或一致序列,決定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄按效應(yīng)和功能可分為啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、RNA間接信號(hào)、負(fù)調(diào)控元件、終止子等調(diào)控元件。反式作用因子主要作用規(guī)律同一DNA序列可被不同蛋白質(zhì)識(shí)別同一蛋白質(zhì)因子可與多種不同DNA序列發(fā)生聯(lián)系，多數(shù)是通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)先相互作用后，再與DNA結(jié)合，發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。反式作用因子的自身生物合成有相當(dāng)大的可變性、可塑性。反式作用因子與順式作用元件相互作用的特定結(jié)構(gòu)域，有兩種類型：通用轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)域?yàn)樽R(shí)別特異DNA的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，如：鋅指結(jié)構(gòu)。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的結(jié)構(gòu)域又稱轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域，如：酸性α-螺旋結(jié)構(gòu)域。不同結(jié)構(gòu)域各自的特征不同結(jié)構(gòu)域各自的特征通用轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域鋅指結(jié)構(gòu)亮氨酸拉鏈螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋（HTH）螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域RNA編輯（RNAediting）RNA編輯是在轉(zhuǎn)錄時(shí)或轉(zhuǎn)錄后，能夠改變RNA分子編碼特性，是與剪切形式不同的一種修飾形式，如可使mRNA某位點(diǎn)密碼子CAA轉(zhuǎn)變?yōu)閁AA，使C變U，編輯的結(jié)果形成了UAA終止密碼子，在編碼酶的作用下，除使C變U，還可在RNA上添加多個(gè)U或呈單個(gè)C的添加，使前體mRNA變成成熟mRNA時(shí)，通過插入或替換方式，可改變和擴(kuò)大原遺傳信息，編碼多種蛋白,是生物的適應(yīng)性保護(hù)。翻譯起始序列

在ATG起始密碼子周圍要有5’-CCACCA-TGG-3’保守序列，以利mRNA翻譯起始，若發(fā)生突變，其翻譯水平可下降10倍。在起始AUG上游若有比較多的二級(jí)結(jié)構(gòu)序列，也會(huì)影響翻譯，建議外源基因的5’端AUG上游序列不宜過長。eIF-2的磷酸化反應(yīng)eIF-2為轉(zhuǎn)譯起始因子-2是蛋白質(zhì)合成起始階段13種起始因子中最為關(guān)注的因子。若轉(zhuǎn)入動(dòng)物細(xì)胞中的質(zhì)粒DNA的兩條鏈一旦都發(fā)生轉(zhuǎn)錄，就會(huì)形成雙鏈互補(bǔ)mRNA，而激活胞內(nèi)的雙鏈RNA激活的蛋白激酶（DAIPK）該激酶可使eIF-2的α-亞基磷酸化，轉(zhuǎn)譯受抑，為防止該激酶活化，常在載體上加上腺病毒的VARNA基因，VARNA是由RNA聚合酶Ⅲ合成的小分子RNA，能阻止雙鏈RNA對(duì)DAI激酶的激活作用，使轉(zhuǎn)譯得以正常進(jìn)行。一、胸苷激酶基因選擇標(biāo)記外源基因+載體(TK+)的重組體導(dǎo)入TK-細(xì)胞中，在HAT（次黃嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷）選擇培養(yǎng)基中篩選，TK-細(xì)胞因氨基喋呤抑制了dTTP的合成而死亡，TK+細(xì)胞可存活，以此進(jìn)行篩選。（HSV-1的TK基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞加GCV后被殺死，如小鼠LMTK-細(xì)胞。）注：TK++BrUdR因摻入后對(duì)紫外線敏感而死亡，

TK-+BrUdR因不摻入，對(duì)紫外線不敏感而存活。二、二氫葉酸還原酶基因（DHFR）選擇標(biāo)記DHFR是合成dATP和dGTP的關(guān)鍵酶。常用DHFR—的CHO細(xì)胞因不能合成四氫葉酸，只能在含胸腺嘧啶核苷、甘氨酸和嘌呤的培養(yǎng)基中生長。在不含該培養(yǎng)基中導(dǎo)入該標(biāo)記基因重組子，則可篩選出陽性克隆，也可將DHFR基因置在強(qiáng)啟動(dòng)子下高表達(dá)或通過DHFR基因突變以提高抵抗高濃度氨甲喋呤（抗MTX的抗性）的能力，從而篩選陽性克隆。三、新霉素抗性基因選擇標(biāo)記新霉素類似物G418抗生素，可影響80s核糖體RNA功能，對(duì)細(xì)胞有毒性。新霉素抗性基因neo的載體可在真核細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)生新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶能使G418失活，可在含G418培養(yǎng)基中篩選重組體轉(zhuǎn)化的陽性克隆細(xì)胞。陽性克隆存活，陰性者死亡。五、黃嘌呤-鳥嘌呤轉(zhuǎn)移酶（XGPRT）基因哺乳動(dòng)物細(xì)胞無XGPRT酶，不能利用黃嘌呤形成黃嘌呤磷酸（XMP），但有鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT），可催化黃嘌呤形成次黃嘌呤磷酸（IMP）。哺乳動(dòng)物細(xì)胞可通過IMP生成GMP。當(dāng)用IMP脫氫酶抑制劑霉酚酸，抑制了GMP的合成，使細(xì)胞失去合成DNA能力而死亡。將含XGPRT基因的重組體導(dǎo)入真核細(xì)胞后，在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中就能表達(dá)XGPRT酶，可在含有黃嘌呤的培養(yǎng)基中通過XMP中間體補(bǔ)救合成GMP，使DNA合成正常進(jìn)行，加入霉酚酸后，陽性克隆因不受霉酚酸的抑制而存活，而未轉(zhuǎn)化的陰性細(xì)胞則受霉酚酸的抑制而死亡，以此可用來篩選陽性細(xì)胞。1.質(zhì)粒型載體

質(zhì)粒型載體（穿梭載體）：實(shí)際上是病毒質(zhì)粒型載體，共有兩套復(fù)制元件和選擇標(biāo)記，在原核中復(fù)制，真核中表達(dá)。2.病毒載體

病毒載體種類多，SV40、Adv、RV、HSV-1、痘苗V?？稍诿舾屑?xì)胞中復(fù)制，表達(dá)外源基因，有的還可通過整合后表達(dá)。3.整合型表達(dá)載體

RV、SV40可攜帶外源基因整合到宿主細(xì)胞的基因組中進(jìn)行表達(dá)。4.游離型表達(dá)載體

該病毒載體是以完整的或缺陷病毒形式攜帶外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞后不發(fā)生整合，可在胞漿中游離復(fù)制，表達(dá)外源基因，如痘苗V、Adv。5.瞬時(shí)表達(dá)載體瞬時(shí)表達(dá)載體（轉(zhuǎn)染后70-90h左右）：含病毒復(fù)制子的病毒載體，可攜帶外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞，不整合到染色體上，只在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行暫時(shí)性表達(dá)，不能隨細(xì)胞傳代，隨后逐漸降低或消失。常用SV40復(fù)制子載體，在COS細(xì)胞中表達(dá)，由于載體復(fù)制，若超過104個(gè)/細(xì)胞，細(xì)胞不能承受而死亡。6.穩(wěn)定性表達(dá)載體將外源基因與具標(biāo)記基因（DHFR）病毒載體轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞（CHO），可將基因整合到細(xì)胞染色體上，可隨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄表達(dá)和傳代。（CHO、DUKX-B11因加入氨甲喋呤而死亡，依此篩選陽性克隆。）7.非復(fù)制性HSV-Ⅰ病毒（單純皰疹病毒HSV-Ⅰ型）載體

HSV-1病毒去除α極早期基因，失去復(fù)制能力，但攜帶外源基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞后高效表達(dá)，毒性小，轉(zhuǎn)染和表達(dá)能力強(qiáng)。8.裂解性HSV-Ⅰ病毒載體

HSV-1病毒去除了β早期基因，而不能產(chǎn)生DNA合成所需的酶，該病毒在靜止細(xì)胞中不能復(fù)制和裂解細(xì)胞，但在高度分裂活躍的細(xì)胞中（如腫瘤）可復(fù)制并裂解感染的細(xì)胞，因分裂活躍細(xì)胞可提供病毒復(fù)制所需的DNA合成酶，復(fù)制時(shí)只殺死腫瘤細(xì)胞，對(duì)正常細(xì)胞無損害。㈠逆轉(zhuǎn)錄病毒載體

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是RNA單鏈，pol基因產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄酶，使單鏈生成雙鏈。有5’、3’的U3RU5的長末端重復(fù)序列，有TATA強(qiáng)啟動(dòng)子和加尾功能，經(jīng)體外包裝，可整合表達(dá)。穿梭質(zhì)粒載體組裝基因后，可由輔助病毒協(xié)助或經(jīng)體外細(xì)胞包裝，形成具感染性假病毒顆粒，再感染宿主細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。㈡痘類病毒載體

已用于構(gòu)建多價(jià)活疫苗載體（HBsAg、HA、狂犬、HAV、麻疹V、HSV-Ⅱ、EBV等。該載體的雙鏈DNA的大病毒載體，組裝量大，安全，可在細(xì)胞獨(dú)立復(fù)制，表達(dá)。1.重組病毒型載體

在HSV-1非必需區(qū)插入外源基因的重組體DNA與野毒株共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，可發(fā)生同源重組，通過LacZ篩選，轉(zhuǎn)染效率高，無需輔助病毒，但有毒性作用。啟動(dòng)子大多位于基因5’端上游區(qū)，是一種與基因轉(zhuǎn)錄起始有關(guān)的5’端DNA序列，在-30bp區(qū)有TATAbox，可引導(dǎo)RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄起始，在-70~-80bp區(qū)還有GCbox，可協(xié)同調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始頻率和提高轉(zhuǎn)錄效率。常用的啟動(dòng)子有RSV啟動(dòng)子、CMV啟動(dòng)子、SV40早期啟動(dòng)子。增強(qiáng)子增強(qiáng)子是一類可使啟動(dòng)子的基因轉(zhuǎn)錄效率顯著提高的順式作用元件，本身無啟動(dòng)子活性，可獨(dú)立存在與上游區(qū)、下游區(qū)或基因內(nèi)部，可進(jìn)行遠(yuǎn)距離增強(qiáng)啟動(dòng)作用，而且無方向性。它有特征性序列，常由812bp組成，以單拷貝或多拷貝的形式存在。增強(qiáng)子可使轉(zhuǎn)錄效率增強(qiáng)10-100倍，通常來源于SV40、RSV或CMV病毒。一旦增強(qiáng)子的作用使表達(dá)產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞有毒性時(shí)，最好改用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子來表達(dá)外源基因，如熱休克啟動(dòng)子、金屬硫蛋白啟動(dòng)子。RNA剪接信號(hào)雖然cDNA來源的基因轉(zhuǎn)入哺乳類細(xì)胞后，其表達(dá)不受有或無內(nèi)含子的影響，但在該細(xì)胞中表達(dá)最好有一段內(nèi)含子序列的剪接信號(hào)，以提供對(duì)cDNA基因表達(dá)的需要，常用SV40的小t抗原的內(nèi)含子序列來作為cDNA中的內(nèi)含子剪接序列。負(fù)調(diào)控元件沉默子和衰減子為轉(zhuǎn)錄的負(fù)調(diào)控元件，它們與反式作用因子相互作用而起作用，不受距離、方向、基因來源的限制。終止子和polyA信號(hào)真核基因轉(zhuǎn)錄的確切終止信號(hào)和終止機(jī)制目前尚不清楚，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)在模板DNA分子3’端有一終止序列，稱終止子，產(chǎn)生具有polyA尾的轉(zhuǎn)錄序列，在DNA區(qū)域內(nèi)G/T簇。如SV40中的終止子序列為AGGTTTTTT的DNA序列，并有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的反向重復(fù)序列。polyA可使mRNA穩(wěn)定其多聚腺苷酸化需要兩種序列：①位于polyA位點(diǎn)下游的GU或U豐富區(qū)，②位于polyA上游11-30bp處的6bp高度保守序列（5’-AAUAAA）與轉(zhuǎn)錄后的RNA切割和加尾有關(guān)。反式作用因子的概念反式作用因子是一組能直接或間接地與DNA的順式作用元件特定序列結(jié)合，發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的核內(nèi)非組蛋白，即DNA結(jié)合蛋白（DBP），DBP又稱轉(zhuǎn)錄因子（transcriptionfactor,TF）分通用轉(zhuǎn)錄因子及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子兩大類?；虮磉_(dá)的組織特異性及細(xì)胞周期特異性受上述元件和因子的相互作用所決定，通用轉(zhuǎn)錄因子中識(shí)別TATAbox的為TFⅡD，可與RNA聚合酶Ⅱ結(jié)合使轉(zhuǎn)錄起始，識(shí)別GCbox的DBP為SP1，可調(diào)控轉(zhuǎn)錄效率。鋅指結(jié)構(gòu)鋅指（zinefinger）結(jié)構(gòu)：由兩個(gè)半胱氨酸（Cys）和兩個(gè)組氨酸（His）殘基通過位于中心的鋅離子結(jié)合成一個(gè)穩(wěn)定的指狀結(jié)構(gòu)，表面暴露的堿基及其極性氨基酸與DNA結(jié)合有關(guān)。一個(gè)蛋白分子有2-9個(gè)鋅指重復(fù)單位，由指部堿基或極性氨基酸（賴氨酸Lys、精氨酸Arg）結(jié)合于DNA雙螺旋的深溝內(nèi)。結(jié)構(gòu)域?yàn)橐凿\輔基螯和形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)作為活性結(jié)構(gòu)域。亮氨酸拉鏈

亮氨酸拉鏈（Leucinezipper，LZ）：為兩組走向平行帶亮氨酸的α-螺旋形成的對(duì)稱二聚體，每個(gè)亞基含4個(gè)亮氨酸，每2個(gè)Leu之間相隔6個(gè)氨基酸。于α-螺旋的某一側(cè)面，每2圈（3.6堿基/圈）就出現(xiàn)一個(gè)Leu，排成一排，使2個(gè)α-螺旋蛋白分子間形成一條拉鏈，只有在形成二聚體拉鏈后，鏈上富含的堿性氨基酸區(qū)可與DNA結(jié)合。結(jié)構(gòu)域?yàn)殒溕蠅A性區(qū)和亮氨酸拉鏈形成的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)。螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋（HTH）

螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋（helix-turn-helix，HTH）：此α-螺旋中含堿性氨基酸較多，其所帶的正電荷基團(tuán)可與帶負(fù)電荷的DNA鏈結(jié)合。螺旋-環(huán)-螺旋螺旋-環(huán)-螺旋（helix-loop-helix，HLH）：HLH與HTH結(jié)構(gòu)相似，不同之處為兩個(gè)α-螺旋之間的肽鏈為非螺旋的環(huán)，在α-螺旋附近的氨基酸也有堿性區(qū)，為與DNA結(jié)合所必需，DNA結(jié)合性質(zhì)與亮氨酸拉鏈相似。第五章

分子克隆常用的工具酶

第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶與DNA分子的體外切割第二節(jié)

DNA連接酶和DNA分子的體外連接第三節(jié)

其他工具酶第一節(jié)

限制性核酸內(nèi)切酶與DNA分子的體切割

限制性核酸內(nèi)切酶，是一類能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。一、寄主控制的限制與修飾作用如圖2-1，圖2-2二、限制性核酸內(nèi)切酶的制備方法三、限制性核酸內(nèi)切酶分類和命名四、Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性五、影響限制性內(nèi)切酶活性的因素分類：ⅠⅡⅢ

Ⅰ：識(shí)別和切割位點(diǎn)不固定，隨機(jī)性。

Ⅲ：核酸內(nèi)切酶活性和甲基化活性是不分開的。Ⅱ：能在識(shí)別位點(diǎn)處切割DNA，切割位點(diǎn)固定。核酸內(nèi)切酶活性和甲基化活性是分開的。常用。四、Ⅱ型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性識(shí)別序列：1.4~7個(gè)核苷酸組成的特定核苷酸序列

2.回文結(jié)構(gòu)：兩個(gè)順序相同的拷貝在DNA鏈上呈反向排列。

EcoRⅠ5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’經(jīng)限制酶切割后的位點(diǎn),DNA斷裂類型1.粘性末端(1)3’-OH單鏈延伸的粘性末端.如：PstⅠ5’-CTGCAG-3’5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’3’-GACGTC-5’(2)5’-P單鏈延伸的粘性末端.如：EcoRⅠ

5’-GAATTC-3’

5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’

3’-CTTAAG-5’2.平末端如:SmaⅠ5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’兩種特殊的限制酶(1)同尾酶

識(shí)別位點(diǎn)不同，酶切后產(chǎn)生同樣的粘性末段的兩種酶。如：BamHⅠ和BglⅡ(2)同裂酶識(shí)別序列相同，對(duì)甲基化切點(diǎn)敏感性不同的兩種酶。如:MboⅠ和Sau3AⅠ共同識(shí)別序列GATC，但對(duì)GmeATC切點(diǎn),前者不能切，后者能切。五、影響限制性內(nèi)切酶活性的因素1.DNA的純度2.DNA的甲基化（1）基因工程使用失去甲基化酶的大腸桿菌（2）研究基因工程DNA的甲基化程度（3）改變限制酶的識(shí)別特性3.溫度4.分子結(jié)構(gòu)5.限制酶的緩沖液星號(hào)活性EcoRⅠ切GAATTCEcoRⅠ*切pupuATpypy或AATT第二節(jié)

DNA連接酶和DNA分子的體外連接一、DNA連接酶

DNA連接酶（Ligase）是一種能夠催化在雙股DNA鏈的3′-OH和5′-P之間形成磷酸二酯鍵的酶，可連接互補(bǔ)粘性末端或平端以及缺口修復(fù)，不能連接單鏈DNA或裂口.

溫度二、DNA分子的體外連接二、DNA分子的體外連接1．粘性末端DNA片段的連接和單切點(diǎn)的磷酸化2．平末端DNA片段的連接（1）T4DNA連接酶法（2）同聚物加尾法（3）用化學(xué)合成的銜接物連接DNA分子第三節(jié)

其他工具酶一、大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ二、DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow酶）三、T4DNA聚合酶四、逆轉(zhuǎn)錄酶五、末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶六、核酸酶S1七、核酸酶BAL31八、外切核酸酶Ⅲ九、T4多聚核苷酸激酶十、堿性磷酸酶十一、

甲基化酶命名

HindⅢH:Haemophilus嗜血桿菌屬in:influenzae流感d:Rd株Ⅲ：該菌株中第三個(gè)被分離到的限制酶同尾酶BamHI和BglII

AGATCT

GGATCC

TCTAGA

CCTAGG

BglⅡBamHI

AGATCC

TCTAG G

T4連接酶

AGATCC

（連接后的切點(diǎn)均不能被上述兩種酶切）

TCTAGG

一、大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ1.三種活性（1）5’-3’聚合酶活性（在有dNTP時(shí)）（2）3’外切酶活性（無dNTP時(shí)大亞基活性）（3）5’外切核酸酶活性（無dNTP時(shí)小亞基活性）2.在基因工程中的應(yīng)用：缺口平移標(biāo)記技術(shù)。二、DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow酶）1.DNA聚合酶活性（切除小亞基，保留大亞基）2.3’外切酶活性（無dNTP時(shí)）3.在基因工程中的應(yīng)用（1）標(biāo)記粘性末端.

-32P—dNTP

標(biāo)記平末端

-32P—dNTP（2）將5’端伸出的末端填平（3）可用來反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA。（4）補(bǔ)平粘性末端。

三、T4DNA聚合酶具有5’-3’聚合酶活性和3’-5’外切酶活性。其外切酶活性比E.coliDNA聚合酶I的活性高200倍。

取代反應(yīng)四、逆轉(zhuǎn)錄酶

逆轉(zhuǎn)錄酶可以RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，又稱依賴RNA的DNA聚合酶。1.聚合酶活性

RNA或DNA為模板2.3’外切酶活性能使DNA-RNA雜合鏈中的RNA降解。應(yīng)用：1.RT-PCR使mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA2.制備探針。五、末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶可催化DNA片段上的3’-OH端加接脫氧核糖核苷酸。常用于同種堿基多聚體接尾反應(yīng)核素標(biāo)記DNA片段的3’端六、核酸酶S1

可以降解單鏈DNA和RNA(1)將DNA切成平末端。有些限制性內(nèi)切核酸酶可以將DNA切成粘性末端，經(jīng)過核酸酶S1降解可切除DNA末端的單鏈。生成平末端DNA。(2)切除cDNA中單鏈發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成的cDNA，可能形成單鏈發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，為了得到平末端cDNA可用核酸酶S1分解，生成無發(fā)夾結(jié)構(gòu)的cDNA。(3)可用核酸酶S1分析DNA·RNA雜交分子的結(jié)構(gòu)。十、堿性磷酸酶該酶的功能是以單鏈或雙鏈的DNA、RNA為基質(zhì)，將DNA或RNA片段5’端的磷酸切除，產(chǎn)生5’-OH。應(yīng)用：(1)用該酶催化切除DNA或RNA5’端的磷酸,然后加上γ-32P-NTP在DNA多聚核苷酸激酶的作用下標(biāo)記5’端。

(2)用于避免單酶切后質(zhì)粒自我環(huán)化。十一、

甲基化酶常見的有dam甲基化酶和dcm甲基化酶，可使相應(yīng)堿基甲基化。dam可在限制酶識(shí)別的5′GATC3′或5′GAAT3′序列的5′腺嘌呤N6位上引入甲基。dcm可在限制識(shí)別的5′CCAGG3′或5′CCTGG3′序列的5′胞嘧啶引入甲基。常用于使酶切位點(diǎn)中的堿基甲基化而避免降解，保護(hù)酶切位點(diǎn)。核酸酶BAL31

從線形DNA分子兩端（粘端/平端）以漸進(jìn)方式切去單核苷酸，以形成寡聚核苷酸或制造末端缺失。此外也有類似于SI酶單鏈特異降解活性，可除去粘性末端或單鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)。外切核酸酶Ⅲ

能從線性DNA的3′-OH末端沿3′→5′方向切去單核苷酸，制造3′端缺失，制備DNA模板或特異DNA探針。T4多聚核苷酸激酶能將ATP上的γ位磷酸轉(zhuǎn)移到單鏈或雙鏈DNA或RNA的5′-OH上，可將γ-32P-ATP中的32P連接到5′端的5′-OH上，以完成寡聚核苷酸的核素標(biāo)記。二、基因工程的基本程序載體質(zhì)粒外源DNA片段外源DNA插入剪切引入宿主細(xì)胞選出含有重組DNA的細(xì)胞擴(kuò)增表達(dá)abbAAb第六章

分子克隆常用的載體

第一節(jié)

質(zhì)粒載體第二節(jié)

噬菌體載體第三節(jié)

真核細(xì)胞的克隆載體第一節(jié)

質(zhì)粒載體

一、質(zhì)粒的基本特性二、質(zhì)粒的分離純化方法三、質(zhì)粒載體的選擇四、大腸桿菌質(zhì)粒載體五、多種功能的衍生質(zhì)粒的組建一、質(zhì)粒的基本特性1．質(zhì)粒及其命名2．質(zhì)粒的種類3．質(zhì)粒的復(fù)制類型4．質(zhì)粒的分子生物學(xué)特征二、質(zhì)粒的分離純化方法1．氯化銫溴乙錠浮密度超速離心密度梯度分離法

（圖3-3）2.Triton和PEG化學(xué)提取法3．煮沸裂解菌體，異丙醇沉淀質(zhì)粒DNA4．堿變性法抽提質(zhì)粒DNA

質(zhì)粒的存在形式：呈共價(jià)閉合環(huán)狀①超螺旋的SC構(gòu)型（cccDNA）②松弛開環(huán)的OC型（ocDNA）③松弛線性的L構(gòu)型（cDNA）基本步驟：細(xì)菌生長和質(zhì)粒的擴(kuò)增菌體收獲和溶菌質(zhì)粒純化氯化銫浮密度分離法

當(dāng)各種DNA分子在有飽和溴乙錠染料存在下進(jìn)行氯化銫密度梯度離心時(shí)，與共價(jià)閉環(huán)狀分子結(jié)合的染料要大大少于與開環(huán)狀或線狀DNA的結(jié)合，因此，在氯化銫梯度離心中質(zhì)粒DNA與染料相結(jié)合后生成的條帶是在較高的密度范圍內(nèi)，而斷裂為線狀的染色體DNA與溴乙錠結(jié)合較多，生成的條帶是低密度范圍。所以，離心后形成2條帶，上面的條帶主要是染色體DNA及少量開環(huán)狀質(zhì)粒DNA，下面的帶則是共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA。

堿變性法抽提質(zhì)粒DNA

該法也是一種快速抽提質(zhì)料DNA的方法。其分離原理，大腸桿菌的染色體約有4700KB長，在處理細(xì)胞過程中都斷裂成不同長度的雙鏈DNA片段。當(dāng)溶液的PH調(diào)到大于12時(shí)雙鏈DNA中的氫鍵被破壞，于是染色體DNA的雙鏈便分離成單鏈，而超螺旋狀態(tài)的質(zhì)粒DNA僅僅是氫鏈被破壞，并只發(fā)生部分雙鏈解離成單鏈的變化。再當(dāng)PH調(diào)回中性時(shí)單鏈DNA互相纏繞且與蛋白質(zhì)結(jié)合生成網(wǎng)絡(luò)狀大分子，而超螺旋的質(zhì)粒發(fā)生復(fù)性反應(yīng)后仍是小分子，通過離心的方法很容易將二者分開，達(dá)到分離的目的。三、質(zhì)粒載體的選擇

作為理想的質(zhì)粒載體，應(yīng)具備以下幾個(gè)條件（1）能自主復(fù)制，即本身是復(fù)制子（2）具有一種或多種限制酶的單一切割位點(diǎn)，并在此位點(diǎn)中插入外源基因片段，不影響本身的復(fù)制功能；（3）在基因組中有1-2個(gè)篩選標(biāo)記，為寄主細(xì)胞提供易于檢測的表型特征，（4）分子量要小，多拷貝，易于操作。四、大腸桿菌質(zhì)粒載體1．pSC101質(zhì)粒載體2．pBR322質(zhì)粒載體分別由pMB1(ori)、pSF2124(Ampr)和pSC101(Tetr)三種質(zhì)粒通過載體改造后形成，使之具有松弛型ori和Ampr及Tetr兩種抗性基因的理想的基因克隆載體。

Ampr

（Scal、PvuI、PstI切點(diǎn)）

Tetr

（EcoRI、Nhel、BamHI、SphI、HindIII切點(diǎn)）五、多種功能的衍生質(zhì)粒的組建

（一）、帶有不同種類抗性基因的質(zhì)粒載體（二）、高拷貝數(shù)質(zhì)粒pAT153（三）、正選擇質(zhì)粒（四）、多功能質(zhì)粒-PUC質(zhì)粒帶有不同種類抗性基因的質(zhì)粒載體pBR328是從pBR322改建成的質(zhì)粒，大小為4.907kb,它具有Ampr、Tetr和Cmlr基因。Cmlr基因有EcoRI、PvuⅡ和BalI的單一酶切位點(diǎn)。除了pBR328外，pBR325也有類似結(jié)構(gòu)。pAT153是由pBR322質(zhì)粒改造而成，這種質(zhì)粒的拷貝數(shù)比pBR322高1.5～3倍。它的大小是3.6kb,選擇標(biāo)記有氨芐青霉素抗性基因Ampr和四環(huán)素抗性基因Tetr、單一切點(diǎn)的限制性內(nèi)切核酸酶有PvuⅠ、PstⅠ、BamHⅠ、ScaⅠ、SalⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ。正選擇質(zhì)粒pTR262是正選擇質(zhì)粒。在這種質(zhì)粒中，在四環(huán)素的抗性基因（Tetr）前有λ噬菌體的PR啟動(dòng)子，同時(shí)在這種載體中還帶有λ噬菌體編碼CI蛋白質(zhì)（阻遏物）的基因。沒有外源基因插入時(shí)，由于CI蛋白質(zhì)阻遏從PR進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄作用，因此對(duì)四環(huán)素不表現(xiàn)抗性。在CI蛋白質(zhì)基因上有單一的HindⅢ和BclⅠ切點(diǎn)，若利用其中任何一個(gè)切點(diǎn)插入外源DNA片段，都可以使CI蛋白質(zhì)基因功能喪失，結(jié)果PR激活Tetr基因表達(dá)；表現(xiàn)出對(duì)四環(huán)素的抗性，達(dá)到正選擇的效果。第二節(jié)

噬菌體載體一、噬菌體的一般生物學(xué)特性二、λ噬菌體載體三、粘性質(zhì)粒四、單鏈DNA噬菌體載體烈性噬菌體溫和噬菌體溶源化細(xì)菌溶源化原噬菌體二、λ噬菌體載體（一）λDNA分子(1)λ噬菌體基因結(jié)構(gòu)：如圖3-11、3-12Cos位點(diǎn)（Cohesive-endsite）：λDNA為線狀雙鏈分子，兩端各有12個(gè)堿基的單鏈互補(bǔ)粘性末端，通過粘性末端的互補(bǔ)作用形成雙鏈環(huán)形DNA。這種由粘末端結(jié)合形成的雙鏈區(qū)段即Cos位點(diǎn)。(2)λ噬菌體DNA的復(fù)制（二）λ噬菌體的類型插入型載體替換型載體

(三)λ噬菌體載體的應(yīng)用1.轉(zhuǎn)染作用轉(zhuǎn)染：由宿主細(xì)胞捕獲噬菌體或病毒DNA的過程。轉(zhuǎn)導(dǎo)：以噬菌體為媒介轉(zhuǎn)移遺傳物質(zhì)的過程。轉(zhuǎn)化：質(zhì)粒等外源DNA引入細(xì)胞的過程。2.λDNA的體外包裝（四）常用λ噬菌體凱倫噬菌體載體這類載體有插入型的，如Charon2；也有替換型的，如Charon30。在基因操作中用途很廣。Charon載體上具有適當(dāng)數(shù)量的限制酶切位點(diǎn)，帶有來自大腸桿菌的β-半乳糖苷酶基因lacZ（中央?yún)^(qū)段）。插入基因經(jīng)包裝后，可通過藍(lán)/白斑篩選陽性克隆。Charon載體的特點(diǎn)是容量大，對(duì)研究大范圍內(nèi)的染色體結(jié)構(gòu)很有用處。三、粘性質(zhì)粒

粘性質(zhì)粒（Cosmid）帶有λ噬菌體的Cos位點(diǎn)和整個(gè)pBR322的DNA順序。經(jīng)感染進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞以后，它就好象質(zhì)粒那樣在細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制。易環(huán)化和擴(kuò)增。分子量小，可包裝30-45kb外源基因，可由Ampr抗性篩選，常用于構(gòu)建基因文庫。在酵母細(xì)胞中常用的載體的共同特點(diǎn)這些載體，它們共同的特點(diǎn)是：（1）能在大腸桿菌中克隆，并且具有較高的拷貝數(shù)。這樣可使外源基因轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞之前先在大腸桿菌中擴(kuò)增；（2）含有在酵母中便于選擇的遺傳標(biāo)記。這些標(biāo)記一般能和大腸桿菌相應(yīng)的突變體互補(bǔ)，如Leu2+、His+、Ura3+、Trpl+等。有些還攜帶用于大腸桿菌的抗菌素抗性標(biāo)記；（3）含有合適的限制酶切位點(diǎn)，以便外源基因的插入。共有三種類型的載體，如圖3-19。第三節(jié)

真核細(xì)胞的克隆載體一、在酵母細(xì)胞中克隆基因常用的載體（共同特點(diǎn)）

1.整合型載體（YIP）

2.復(fù)制型載體（YRP）

3.附加體型載體（YEP）二、植物基因克隆的載體——Ti質(zhì)粒三、動(dòng)物細(xì)胞基因克隆的載體整合型載體（YIP）YIP型載體是由大腸桿菌質(zhì)粒和酵母的DNA片段構(gòu)成的。如Pyeleu10是由ColEI質(zhì)粒和酵母DNA提供的亮氨酸基因（Leu2+）片段構(gòu)成，在細(xì)菌中復(fù)制、擴(kuò)增，進(jìn)入酵母后可整合表達(dá)。YIP型載體的特點(diǎn)是轉(zhuǎn)化率低(只有1-10轉(zhuǎn)化子/微克DNA)，但轉(zhuǎn)化子遺傳性穩(wěn)定穩(wěn)定，多用于遺傳分析工作。復(fù)制型載體（YRP）YRP型載體是帶有選擇標(biāo)記和復(fù)制子的酵母的DNA片段插入到大腸桿菌質(zhì)粒中構(gòu)成的。因?yàn)樗瑫r(shí)含有大腸桿菌和酵母的自主復(fù)制基因，所以能在兩種細(xì)胞中存在和復(fù)制。可以在兩種截然不同的生物細(xì)胞中復(fù)制的載體稱為穿梭載體（ShuttleVector），（如圖3-20）穿梭載體在基因工程中廣泛使用。YRP型載體轉(zhuǎn)化率高，拷貝也高，但不穩(wěn)定，易丟失。附加體型載體（YEP）YEP型載體一般由大腸桿菌質(zhì)粒、2μm質(zhì)粒以及酵母染色體的選擇標(biāo)記構(gòu)成。2μm質(zhì)粒含有自主復(fù)制起始區(qū)（Ori）和STB區(qū),STB序列能夠使質(zhì)粒在供體細(xì)胞中維持穩(wěn)定。利用2μm質(zhì)粒，人們已經(jīng)構(gòu)建出許多YEP型載體。YEP型載體PYF92（如圖3-21）就是由酵母的2μm質(zhì)粒、pBR322質(zhì)粒和酵母的His3+(組氨酸)基因構(gòu)成的。YEP型載體對(duì)酵母具有很高的轉(zhuǎn)化活性，一般為103-105轉(zhuǎn)化子/微克DNA。比YRP型載體更穩(wěn)定，拷貝數(shù)也高（25-100個(gè)/細(xì)胞），是基因克隆中的常用載體。載體載體（Vector）：能攜帶外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞，這種運(yùn)載工具稱載體。1.克隆載體:具組裝、復(fù)制、擴(kuò)增功能。如：pBR322、pUC18/19等。

2.表達(dá)載體:不僅具組裝、復(fù)制、擴(kuò)增功能，還有轉(zhuǎn)錄表達(dá)功能。如：pBV220、pKK223-33.載體的種類：質(zhì)粒、噬菌體衍生物（COS、M13）、動(dòng)物病毒。共同特征：①自主復(fù)制②易于擴(kuò)增分離純化③有非必需區(qū)④有單一酶切位點(diǎn)（多克隆位點(diǎn)）單一酶切位點(diǎn)：一種酶在一個(gè)載體上只有一個(gè)酶切位點(diǎn)多克隆位點(diǎn)：一個(gè)載體上的某一個(gè)區(qū)域含有多個(gè)單一酶切位點(diǎn)⑤有選擇標(biāo)記基因⑥表達(dá)載體還應(yīng)有表達(dá)調(diào)控元件（啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止子,SD序列）質(zhì)粒本質(zhì)是細(xì)菌染色體以外的遺傳物質(zhì)，是一種簡單的，環(huán)狀DNA分子，能自主復(fù)制。命名：前一個(gè)小寫p代表質(zhì)粒，后兩個(gè)大寫英文字母代表發(fā)現(xiàn)者或?qū)嶒?yàn)室，數(shù)字代表編號(hào)，如pBR322質(zhì)粒。種類：F質(zhì)粒：使宿主染色體上的基因通過性菌毛隨其一起轉(zhuǎn)移到原先不存在該質(zhì)粒的受體細(xì)胞中。R質(zhì)粒：抗性因子，攜有一種或多種抗生素抗性基因轉(zhuǎn)移到原先不存在該質(zhì)粒的受體細(xì)胞中。Col質(zhì)粒：有編碼大腸桿菌素基因質(zhì)粒的類型和特性傳遞類型：①接合型：含有自主轉(zhuǎn)移基因，使質(zhì)粒從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞。如：F質(zhì)粒、部分R、Col質(zhì)粒②非接合型：不含有自主轉(zhuǎn)移基因，質(zhì)粒不能自主從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞。如：部分R、Col質(zhì)粒（安全常用）復(fù)制類型：①嚴(yán)緊型：低拷貝1-3個(gè)拷貝/菌②松弛型：高拷貝10-60個(gè)拷貝/菌特性：自主復(fù)制、轉(zhuǎn)移、選擇標(biāo)記遺傳特性、不相容性（同者相斥、異著共存）、分配功能（親代子代）特性：CopA和CopB基因1.復(fù)制：負(fù)調(diào)控

RI質(zhì)粒：repA基因表達(dá)復(fù)制PSC101：正調(diào)控是由ori復(fù)制子向左單向復(fù)制2.不相容性；在同一細(xì)胞中，同類質(zhì)粒不能并存的現(xiàn)象。PUC18PUC19分配功能：質(zhì)粒復(fù)制后，隨細(xì)胞分裂的進(jìn)行，質(zhì)粒分配到子細(xì)胞中。Triton和PEG化學(xué)提取法Triton和PEG處理法，此法簡單，不用昂貴的氯化銫，不必長時(shí)間的超速離心，費(fèi)用較低，分離效果也很好，此法大體過程如下：培養(yǎng)菌體并加入氯霉素使質(zhì)粒擴(kuò)增→離心沉淀菌體。在TE緩沖液中懸浮→加入溶菌酶和去污劑Triton部分裂解菌體→35000r/min離心除去菌體，留上清液→上清液用酚處理除去蛋白質(zhì)→用乙醇初步沉淀DNA→將DNA懸浮于TE緩沖液中→加聚乙二醇（PEG6000），在4℃下過夜→10000r/min離心15分鐘→DNA沉淀懸浮后再用乙醇沉淀→將DNA沉淀懸浮即得到提純的質(zhì)粒DNA。煮沸裂解菌體，異丙醇沉淀質(zhì)粒DNA該法簡便迅速，是實(shí)驗(yàn)室中制備小量質(zhì)粒DNA時(shí)常用的一種方法。將菌液移入1.5ml塑料管，離心去上清，先用Triton和新鮮配制的溶菌酶處理細(xì)胞，100℃加熱60秒種裂解細(xì)菌細(xì)胞。將裂解液放置冰浴2分鐘，離心5分鐘，根據(jù)不同的復(fù)性特性，從而去除染色體DNA及細(xì)胞碎片。然后用酚氯仿抽提上清去除蛋白質(zhì)，再加入異丙醇，置于室溫20-30分鐘，離心取沉淀，70%乙醇洗兩次，最后懸浮于TE，即為提純的質(zhì)粒DNA。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，亦可省去酚：氯仿抽提步驟，使實(shí)驗(yàn)在2小時(shí)內(nèi)完成。多功能質(zhì)粒-PUC質(zhì)粒多功能質(zhì)粒-PUC質(zhì)粒是由pBR322改建成的帶有LacZ基因的PUC質(zhì)粒。LacZ上有多克隆位點(diǎn)，插入外源基因后在X-gal平板上使原先的藍(lán)斑變成白斑。插入型載體在λimm434區(qū)有EcoRI單一酶切位點(diǎn)便于外源DNA插入的稱為插入型載體。λgt10（CI)λgt11(LacZ)若CI插入外源基因溶菌透明噬斑若不插入外源基因溶源混濁斑若LacZ插入基因IPTG/X-gal平板有白斑若LacZ無插入基因IPTG/X-gal平板有藍(lán)斑

替換型載體在λNM781/791/762替換型載體的SupE基因中可致使宿主菌lacZ琥珀突變，在該基因中具有成對(duì)的EcoRI限制酶位點(diǎn)，在這兩個(gè)位點(diǎn)之間的DNA區(qū)段可以被插入的外源DNA片段所取代，亦稱取代型載體。由于上述λ噬菌體的感染，寄主細(xì)胞lacZ基因的琥珀突變被抑制,所以能在乳糖麥康基氏(McConkey)瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生紅色的噬菌斑,或是在X-gal瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生藍(lán)色的噬菌斑。但如果supE基因的EcoRI區(qū)段被外源DNA所取代，那么形成的重組體噬菌體只能產(chǎn)生出白色的噬菌斑?？煞奖愕睾Y選出陽性克隆。如圖3-15單鏈DNA噬菌體載體M13單鏈DNA噬菌體為細(xì)線狀DNA，呈單鏈環(huán)狀包裝在線狀蛋白外殼中。載體有多聚接頭，可進(jìn)行LacZ插入失活白斑篩選?？蓱?yīng)用于克隆基因，