微生物-顯微鏡和顯微技術(shù)-課件

§2顯微鏡和顯微技術(shù)14/3/2024§2顯微鏡和顯微技術(shù)14/2/202424/3/202424/2/2024精品資料3精品資料3你怎么稱呼老師？如果老師最后沒(méi)有總結(jié)一節(jié)課的重點(diǎn)的難點(diǎn)，你是否會(huì)認(rèn)為老師的教學(xué)方法需要改進(jìn)？你所經(jīng)歷的課堂，是講座式還是討論式？教師的教鞭“不怕太陽(yáng)曬，也不怕那風(fēng)雨狂，只怕先生罵我笨，沒(méi)有學(xué)問(wèn)無(wú)顏見(jiàn)爹娘……”“太陽(yáng)當(dāng)空照，花兒對(duì)我笑，小鳥(niǎo)說(shuō)早早早……”44借助于顯微鏡觀察微生物的方法即顯微技術(shù)，顯微技術(shù)是微生物檢驗(yàn)技術(shù)中最常用的技術(shù)之一。54/3/2024借助于顯微鏡觀察微生物的方法即顯微技術(shù)，顯微技術(shù)是微生物檢驗(yàn)顯微鏡的種類和原理顯微觀察樣品的制備64/3/2024顯微鏡的種類和原理顯微觀察樣品的制備64/2/2024一、顯微鏡的種類和原理(一)、光學(xué)顯微鏡普通光學(xué)顯微鏡暗視野顯微鏡相差顯微鏡熒光顯微鏡現(xiàn)在的光學(xué)顯微鏡分辨的最小極限達(dá)0.2μm。74/3/2024一、顯微鏡的種類和原理(一)、光學(xué)顯微鏡普通光學(xué)顯微鏡暗普通光學(xué)顯微鏡的幾個(gè)基本概念84/3/2024普通光學(xué)顯微鏡的幾個(gè)基本概念84/2/202494/3/202494/2/2024104/3/2024104/2/2024114/3/2024114/2/2024124/3/2024124/2/20241、普通光學(xué)顯微鏡由三部分構(gòu)成①照明系統(tǒng)：包括光源和聚光器；②光學(xué)放大系統(tǒng)：由物鏡和目鏡組成，是顯微鏡的主體，目鏡和物鏡都由復(fù)雜的透鏡組構(gòu)成；③機(jī)械裝置：用于固定材料和觀察方便134/3/20241、普通光學(xué)顯微鏡由三部分構(gòu)成134/2/2024油鏡使用光鏡使用方法144/3/2024油鏡使用光鏡使用方法144/2/20242、暗視野顯微鏡原理：聚光鏡中央有擋光片，使照明光線不直接進(jìn)人物鏡，只允許被標(biāo)本反射和衍射的光線進(jìn)入物鏡，因而視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的。適用范圍：生活細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性觀察。

154/3/20242、暗視野顯微鏡原理：聚光鏡中央有擋光片，使照明光線不直接進(jìn)特點(diǎn):只能看到物體的存在與運(yùn)動(dòng),不能辨清其微細(xì)結(jié)構(gòu)。暗視野顯微鏡的使用164/3/2024特點(diǎn):只能看到物體的存在與運(yùn)動(dòng),不能辨清其微細(xì)結(jié)構(gòu)。暗視野顯基本原理:把透過(guò)標(biāo)本的可見(jiàn)光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對(duì)比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見(jiàn)。3、相差顯微鏡相差顯微鏡使用174/3/2024基本原理:把透過(guò)標(biāo)本的可見(jiàn)光的光程差變成振幅差，從而提高了各微分干涉差顯微鏡DIC顯微鏡下的硅藻形態(tài)適用范圍：對(duì)透明的活體進(jìn)行直接觀察184/3/2024微分干涉差顯微鏡DIC顯微鏡下的硅藻形態(tài)適用范圍：對(duì)透明的活4、熒光顯微鏡原理：熒光素吸收紫外線并放出部分波長(zhǎng)較長(zhǎng)的可見(jiàn)光，發(fā)熒光的物體會(huì)在黑暗背景顯現(xiàn)為光亮有色物體194/3/20244、熒光顯微鏡原理：熒光素吸收紫外線并放出部分波長(zhǎng)較長(zhǎng)的可見(jiàn)綠色：銅綠假單胞菌黃色：蠟樣芽孢桿菌綠色：微管紅色：微絲藍(lán)色：核204/3/2024綠色：銅綠假單胞菌黃色：蠟樣芽孢桿菌綠色：微管204/21931年在德國(guó)柏林由克諾爾和哈羅斯卡首先裝配完成的。用高速電子束代替光束。放大倍數(shù)可達(dá)80萬(wàn)倍，分辨的最小極限達(dá)0.2納米。

（二）電子顯微鏡透射電子顯微鏡掃描電子顯微鏡214/3/20241931年在德國(guó)柏林由克諾爾和哈羅斯卡首先裝配完成的。（二）1、透射電子顯微鏡目前TEM的分辨力可達(dá)0.2nm。用電子束作光源，用電磁場(chǎng)作透鏡。用于電鏡的標(biāo)本須制成厚度約50nm左右的超薄切片。放大倍數(shù)最高可達(dá)近百萬(wàn)倍.由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)等5部分構(gòu)成。224/3/20241、透射電子顯微鏡目前TEM的分辨力可達(dá)0.2nm。224/高爾基體的TEM照片(偽彩色)234/3/2024高爾基體的TEM照片(偽彩色)234/2/2024244/3/2024244/2/20242、掃描電子顯微鏡掃描電子顯微鏡大腸桿菌掃描電鏡圖工作原理：電子束掃描，激發(fā)樣品表面放出二次電子，電子產(chǎn)生多少與標(biāo)本表面立體形貌有關(guān)。電子經(jīng)探測(cè)器收集，經(jīng)光電倍增管和放大器，產(chǎn)生樣品立體圖像于熒光屏上。主要用于：樣品表面結(jié)構(gòu)254/3/20242、掃描電子顯微鏡掃描電子顯微鏡大腸桿菌掃描電鏡圖工作原理：掃描電子顯微鏡原理264/3/2024掃描電子顯微鏡原理264/2/2024274/3/2024274/2/20243、掃描隧道顯微鏡（STM）掃描隧道顯微鏡拍攝的7個(gè)鈾原子團(tuán)284/3/20243、掃描隧道顯微鏡（STM）掃描隧道顯微鏡拍攝的7個(gè)鈾原子團(tuán)294/3/2024294/2/20244原子力顯微鏡304/3/20244原子力顯微鏡304/2/2024314/3/2024314/2/2024特點(diǎn)光學(xué)顯微鏡電子顯微鏡最高放大倍數(shù)約1000-150010萬(wàn)以上最佳分辨率0.2微米0.5納米輻射源可見(jiàn)光電子束輻射源通過(guò)的媒介空氣高真空透鏡類型玻璃電磁體反差來(lái)源光吸收的差異或特定波長(zhǎng)電子散射聚焦機(jī)械機(jī)械調(diào)節(jié)透鏡位置調(diào)節(jié)電磁透鏡的流向改變放大倍數(shù)的方法調(diào)換物鏡或目鏡調(diào)節(jié)電磁透鏡的流向樣品承載載玻片金屬網(wǎng)（通常為銅網(wǎng)）光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡的特點(diǎn)比較324/3/2024特點(diǎn)光學(xué)顯微鏡電子顯微鏡最高放大倍數(shù)約1000-150010（一）光學(xué)顯微鏡制樣活體觀察染色壓滴法懸滴法菌絲埋片法活菌死菌美藍(lán)染色簡(jiǎn)單染色鑒別染色革蘭氏染色、鞭毛染色、芽孢染色二、顯微觀察樣品的制備334/3/2024（一）光學(xué)顯微鏡制樣活體觀察染色壓滴法懸滴法菌絲埋片法活菌死（1）壓滴法：菌懸液滴于載玻片上，加蓋玻片，觀察。（2）懸滴法：蓋玻片中央加一小滴菌懸液，翻轉(zhuǎn)置于特制的凹載玻片上，觀察。（3）菌絲埋片法：無(wú)菌小塊玻璃紙鋪于平板表面，涂布放線菌或霉菌孢子懸液，培養(yǎng)，取下玻璃紙置于載玻片上，觀察菌絲形態(tài)。光學(xué)顯微鏡樣品制備－－活體觀察特點(diǎn)：避免染色對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，用于運(yùn)動(dòng)性、攝食特性、生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中形態(tài)變化等觀察

344/3/2024（1）壓滴法：菌懸液滴于載玻片上，加蓋玻片，觀察。光學(xué)顯微鏡用途：微生物的細(xì)致形態(tài)和結(jié)構(gòu)染色前需要對(duì)樣品固定.常用固定方法：酒精火焰加熱、化學(xué)固定光學(xué)顯微樣品制備－－染色觀察354/3/2024用途：微生物的細(xì)致形態(tài)和結(jié)構(gòu)光學(xué)顯微樣品制備－－染色觀1)、簡(jiǎn)單染色法：涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→鏡檢2）、革蘭氏染色法：涂片→固定→結(jié)晶紫色染色→水洗→碘液媒染→水洗→酒精脫色→番紅復(fù)染→水洗→干燥→觀察364/3/20241)、簡(jiǎn)單染色法：涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→鏡檢3（二）、電子顯微鏡的制樣樣品在進(jìn)行電鏡觀察前必須進(jìn)行固定和干燥，制樣時(shí)一般采用重金屬鹽染色或噴鍍，提高在電鏡下的反差。374/3/2024（二）、電子顯微鏡的制樣374/2/2024※1、透射電鏡的樣品制備負(fù)染技術(shù)投影技術(shù)超薄切片技術(shù)冰凍蝕刻技術(shù)384/3/2024※1、透射電鏡的樣品制備負(fù)染技術(shù)投影技術(shù)超薄切片技術(shù)冰凍蝕刻負(fù)染法將樣品的背景染色以凸現(xiàn)樣品，所以稱為負(fù)染法。一般是采用電子密度高，本身不會(huì)顯示任何結(jié)構(gòu)，又和樣品不起反應(yīng)的物質(zhì)，如磷鎢酸的鈉鹽將樣品包圍，同時(shí)染色劑還會(huì)進(jìn)入觀察對(duì)象的內(nèi)部，這樣，既能顯示外形，又可在一定程度上反映樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。負(fù)染法原理394/3/2024負(fù)染法將樣品的背景染色以凸現(xiàn)樣品，所以稱為負(fù)染負(fù)染色法觀察的鞭毛用途：可以觀察細(xì)菌細(xì)胞、病毒等。404/3/2024負(fù)染色法觀察的鞭毛用途：可以觀察細(xì)菌細(xì)胞、病毒等。404/2在真空條件下，用電子散射能力強(qiáng)的重金屬原子來(lái)噴鍍樣品表面，這樣在樣品和沒(méi)有噴鍍的區(qū)域形成了較強(qiáng)的反差，而沒(méi)有噴鍍的部分成了樣品的投影，根據(jù)投影了解樣品的立體形狀、高度。投影法414/3/2024在真空條件下，用電子散射能力強(qiáng)的重金屬原子來(lái)噴鍍樣品表面，這投影法觀察的噬菌體用途：觀察細(xì)菌的鞭毛或病毒的顆粒424/3/2024投影法觀察的噬菌體用途：觀察細(xì)菌的鞭毛或病毒的顆粒424/2這是最常用的方法，可以觀察細(xì)胞或其它樣品內(nèi)部的細(xì)微結(jié)構(gòu)。樣品固定→脫水→包埋→切片。只有在20—100納米厚度的切片用透射電子顯微鏡才能觀察，所以一般細(xì)菌樣品，一個(gè)細(xì)胞要分割成10片到50片。超薄切片法超薄切片法觀察的一種厭氧弧菌434/3/2024這是最常用的方法，可以觀察細(xì)胞或其它樣品內(nèi)部的細(xì)微結(jié)構(gòu)。超樣品-196℃迅速冷凍→加溫到-100℃→切割樣品→升華(真空)掉斷口處的冰→重金屬噴鍍斷口表面→電子顯微鏡觀察冰凍蝕刻法444/3/2024樣品-196℃迅速冷凍→加溫到-100℃→切割樣品→升華(真冰凍蝕刻法制備的酵母菌內(nèi)部結(jié)構(gòu)圖優(yōu)點(diǎn):可以避免在固定、脫水和包埋過(guò)程中造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)的人為改變而形成的假象。454/3/2024冰凍蝕