T-SPPHN 001-2023 2.0 億CFU mL 嗜硫小紅卵菌HNI-1懸浮劑

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001-2023學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載ICS

CCS

B15/19湖南省植物保護(hù)學(xué)會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T/SPPHN

001-20232.0

sulfidophilum

SC-

發(fā)布 11-20

實(shí)施湖南省植物保護(hù)學(xué)會(huì)

發(fā)布學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載T/SPPHN

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1.1-2020

有效活菌數(shù)∕CFU/mL

2.0×10

10

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嗜硫小紅卵菌

懸浮劑

2.0

1601

1604

3796

4789.28

8170

4.1

4.2

表1

表1

2.0

CFU/mL

嗜硫小紅卵菌

HNI-1

懸浮劑控制項(xiàng)目指標(biāo)

80

98

a)

b)a)，b)

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001-20235.1

GB/T6682-2008GB/T81705.2

1605-2001

5.3

有效活菌數(shù)采用最大可能數(shù)計(jì)數(shù)法（）測定；雜菌數(shù)采用平板菌落計(jì)數(shù)法測定，5.3.1 雜菌數(shù)測定用培養(yǎng)基：細(xì)菌培養(yǎng)基按

GB/T4789.

4.8

規(guī)定，霉菌培養(yǎng)基遵照

5.3.2 10200

3000

ECC-150A恒溫培養(yǎng)箱控溫范圍：℃～80℃，溫度顯示精度：0.1℃，控溫精度：±0.1℃，控溫均勻度：±0.5EOF-150A恒溫烘箱控溫范圍：℃～220℃，溫度顯示精度：0.1℃，控溫精度：±1.5(150

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001-2023學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載5.3.3 根據(jù)代表菌株的形態(tài)學(xué)和生理生化特征進(jìn)行菌種鑒別，并可輔助結(jié)合16S

基因序16S

5.3.4

法）（

）儀器設(shè)備：

滅菌培養(yǎng)皿

30

個(gè)、移液槍

、滅菌槍頭、涂布棒、超

10

）操作步驟：將菌液用無菌水于

離心管中逐級(jí)稀釋為

10101010101010101010

按無菌操作要求，用移液槍吸取

100μL

菌液到冷卻凝固的下層培養(yǎng)基上，用涂布棒涂融化上層培養(yǎng)基，待融化的上層培養(yǎng)基冷卻至

50℃左右時(shí)，將其倒入已涂菌的下層培

30±1

7d10d

30

300

300

30若三個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)均不在

30300

之間，則以最接近

300

30

的平均菌落乘

20

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）操作步驟：選取

101010三個(gè)濃度梯度的稀釋液做測定用。取

20

支裝有

培養(yǎng)基的滅

101010

7d10d的分布形式對應(yīng)到

表（見附錄

數(shù)值，

即為樣品中5.3.5

選取

101010三個(gè)濃度梯度的稀釋液，用

無菌吸管吸取

，分別加

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿

表面，用無菌玻璃刮刀將稀釋液均勻涂布，待菌液全部滲入培養(yǎng)基后，放置于

℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)

48±2

。每一濃度10

30

300

30300

30300

300

30若三個(gè)稀稀度的平均菌落數(shù)均不在

30300

之間，則以最接近

300

30

的平均菌落數(shù)

選取

101010三個(gè)濃度梯度的稀釋液，用

無菌吸管吸取

，分別加

25℃～283d

5d

10

10150

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5.4

5.5

1601

5.6

5.6.1 1)

2)3)4)三角瓶：5)5.6.2

5.6.3

50

恒溫水浴鍋中放置

，將量筒蓋好，左手托住量筒底部，右手握住量筒頂部并用食指按

30

次充分混勻，打開量筒塞子后重新將其放入恒溫水浴鍋中，豎直靜置

5.3.4

5.6.4 1-C1/C0×1.1111×1005.6.3學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載T/SPPHN

001-2023學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載5.6.5 10%5.7

5.8

5.9

2.22005.10

4.91h5.11

20℃；

試樣置于燒杯中，在低溫恒溫箱中（6±2）℃保持1h，期間每隔15s6±2天。天后將燒杯取出恢復(fù)至室溫，測試有效活菌數(shù)應(yīng)大于等于2.0×10，則符合標(biāo)準(zhǔn)5.12

14d，取出測試其有效活菌數(shù)。

1099℃；45

℃仍能密封的具塞玻璃瓶：

用注射器將約試樣，注入潔凈的玻璃瓶中，置此玻璃瓶于冰鹽浴中致冷，用塞子少封。將器內(nèi)45±2）℃恒溫箱（或恒溫水浴鍋）中，放置14d，取出冷至室溫，將玻璃瓶拭凈，于24h4.31.6×10

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1604

8170

7.1

3796

3796本產(chǎn)品應(yīng)貯存于℃～40℃、干燥、陰涼的庫房內(nèi)，不得露天堆放，以防雨淋和日曬，40407.2

7.3

在規(guī)定的貯運(yùn)條件下，從生產(chǎn)日期算起，保證期為年。在保證期內(nèi)，各項(xiàng)指標(biāo)仍應(yīng)符80%學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載T/SPPHN

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（規(guī)范性）嗜硫小紅卵菌

菌株來源：從海南省海水水樣中分離、純化獲得。菌體形態(tài)見圖

嗜硫小紅卵主要生物學(xué)特性：細(xì)胞卵圓形至桿形，0.50.9μm×0.9。單極生鞭

葡萄木糖糖、）進(jìn)生長蛋白酵母長最不能；在

有特征吸收峰；最適生長溫度和

分別為3035℃、

7.0，培養(yǎng)物為紅色，菌株在黑暗好氧條件生長慢、耐鹽。紅卵性研評述海水離出小紅菌，命名

，選取黃瓜霜霉病菌作為供試病原菌。采用

年）推薦的葉盤漂

10

20

天、天、天、12天、15R.euryhaliR.iodosumum0.6-0.90.5-0.80.7-1.00.5-0.80.5-0.80.6-1.0

1-62.5-7.50.5-122.5-52.5-50.8-1.0

pH

6.5-8.06.5-7.07.0-8.06.5;7.0-7.36.5;7.3-7.78.0-8.51-2

ndndnd．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)ｗｗ準(zhǔn)ｗ下兔學(xué)兔載T/SPPHN

001-2023．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)ｗｗ準(zhǔn)ｗ下兔學(xué)兔載

（規(guī)范性）菌種鑒別生理生化特征法

微鏡（10×100

）及試管架；菌落計(jì)數(shù)器；勻質(zhì)器；

形玻璃棒；培養(yǎng)皿（

2.1

試劑：結(jié)晶紫、乙醇、草酸氨、碘、碘化鉀、丙酮、番紅、過氧化氫、性氧化鈉、2.2

3.1

7296h

3.2

3.3

菌落形態(tài)觀察：在光合細(xì)菌雙層培養(yǎng)基上生長

7296h，觀察菌落的形態(tài)和產(chǎn)色素3.4

1500

30

250

Rhodovulum

嗜硫小紅卵菌（

）及其近似種的生理生化特征檢表ndnd葡萄糖酸ndndndndndMol

68.9-73.2(T64.9-66.7(T62.1-68.6(T67.3-67.7(HP碳源利用學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載T/SPPHN

001-2023碳源利用學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載T/SPPHN

001-2023

4.1

光合細(xì)菌培養(yǎng)基中加入不同濃度的氯化鈉，起始濃度為

，按

0.25%為梯度，依次配置各個(gè)梯度濃度至

10%。將目標(biāo)菌株采用

250

血清瓶液體光照培養(yǎng)（7296，與未4.2

用鹽酸分別調(diào)節(jié)光合細(xì)菌培養(yǎng)基的

5.09.0。采用

250

血清瓶液體光照培養(yǎng)7296

4.3

25%

7296

后目測生長情況。4.4

）、亞硫酸鈉

7296

4.5

72

7296

4.6

0.1%7296

4.7

2.0g

0.2g

0.5g0.1g

0.5g

。培養(yǎng)基中不含碳源。將目標(biāo)菌株接入到含

7296h

4.8

別配置含有與不含有

兩種培養(yǎng)液，采用

血清瓶液體光照培養(yǎng)將目標(biāo)菌7296

后目測生長情況。4.9

10學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載T/SPPHN

001-2023學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃｏｍ標(biāo)準(zhǔn)下載

2.0g

0.2g

0.5g0.1g

0.5g

。將

1.0g

被測底物：檸檬酸鈉、酒石酸鈉、接種到待測培養(yǎng)基中，采用

血清瓶液體光照培養(yǎng)將目標(biāo)菌株培養(yǎng)（7296

后目4.10

NanoDrop2000

測定濃度，℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

測定：利用帶加溫裝置的紫外分光光度

0.30.6

25

50

℃～

值不變表示變性完畢。

）熱變形溫度測定完成后，將記錄的溫度和相應(yīng)；（

25

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（規(guī)范性）菌種鑒別方法

基因序列分析法

將目標(biāo)菌株涂布法在雙層培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)（10，挑取紅色單菌落，采用細(xì)菌

提取試劑盒，參照試劑盒使用說明書提取細(xì)菌

。樣品

使用

瓊脂糖凝膠

NanoDrop2000

℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

16S

27F

16S

將檢測合格的樣品

作為

擴(kuò)增的模板，采用

反應(yīng)體系進(jìn)行

擴(kuò)增。

擴(kuò)增體系：5μL

2μL

ddH2O

50μL

95

10

95

45

55

72

45，循環(huán)

35

最后

72

10

℃保持．

擴(kuò)增產(chǎn)物用

的瓊脂糖凝膠電泳檢

16S

將測序得到的

16S

序列提交到

核酸數(shù)據(jù)庫已有的核酸序列進(jìn)行

99%12ｏｍ標(biāo)準(zhǔn)學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃ下載T/SPPHN

001-2023ｏｍ標(biāo)準(zhǔn)學(xué)兔兔ｗｗｗ．ｂｚｆｘｗ．ｃ下載

（規(guī)范性）光合細(xì)菌培養(yǎng)基 0.5

extract 1.5 1g 0.6

0.5g 0.05g 0.05g 1L

1.3g

1.8g

有效活菌數(shù)測定的選擇性培養(yǎng)基 1.64g 0.2g 0.9g 0.6g 1.32g 7.0微量元素溶液 0.28g 0.21g

0.1L霉菌數(shù)測定的馬丁培養(yǎng)基 1.0g 0.5g 5.0g 18g 13

MPN

MPN0.100.010.100.010.001--9.5214.5423.00.159.6288.794