第3章第7節(jié)-人類基因組的染色體作圖

第七節(jié)人類基因組的染色體作圖

一、人類基因定位方法

二、人類染色體作圖

三、人類基因組的物理作圖法

2024/3/72一、人類基因定位方法(一)家系分析與基因定位(二)基因劑量效應法(三)體細胞遺傳學與細胞學圖的制作(四)DNA介導的基因定位（核酸探針方法）2024/3/73一、人類基因定位方法（一）系譜分析定位法甲臏綜合癥（顯性遺傳）

（指甲和臏骨畸形或缺如）

2024/3/74一、人類基因定位方法

(一)家系分析與基因定位一、人類基因定位方法

(二)基因劑量效應法基因的數(shù)量與基因產(chǎn)物的相關(guān)關(guān)系21三體，超氧化物歧化酶，×1.52p23缺失，紅細胞酸性磷酚酶Southern雜交，檢測基因的拷貝數(shù)XY,XXY,XXXXY例外劑量補償效應基因互作2024/3/76一、人類基因定位方法

(三)體細胞雜交定位法體細胞遺傳學（somatiecellgenetics）是以高等生物的體細胞為實驗材料，采用細胞離體培養(yǎng)，細胞融合以及遺傳物質(zhì)在細胞間轉(zhuǎn)移等方法，研究真核細胞內(nèi)基因的結(jié)構(gòu)、功能及其表達規(guī)律和條件等的遺傳學分支學科。意義：可以繞過減數(shù)分裂過程，應用細胞培養(yǎng)方法，研究體細胞融合、突變、分離以及連鎖和交換等等。把基因定位在染色體上，作成細胞學圖。2024/3/771、體細胞雜交

利用遺傳互補選擇雜種細胞（1）HAT選擇系統(tǒng)HGPRT-(次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶

)或TK-(胸腺嘧啶核苷激酶)淋巴細胞—更換培養(yǎng)基洗脫成纖維細胞—鳥本苷敏感（2）營養(yǎng)缺陷型標記系統(tǒng)在培養(yǎng)基上添加某種營養(yǎng)物一、人類基因定位方法

(三)體細胞雜交定位法2024/3/78一、人類基因定位方法

(三)體細胞雜交定位法2、人類染色體鑒別

應用熒光染色法和其他特殊的染色技術(shù)，可使染色體縱長上呈現(xiàn)各種不同的分帶(bands)，這些分帶的位置、寬狹和濃淡等隨染色體號碼的不同而不同，但就某一種分帶技術(shù)來說，每一染色體的分帶模式（bandingpattern）是高度專一和穩(wěn)定的。因而可用于人類染色體識別，追循染色體丟失過程。

2024/3/79人類染色體分帶2024/3/710一、人類基因定位方法

(三)體細胞雜交定位法3、染色體定(配)位(chrmosomalassignment)

同線分析利用人體染色體和標記基因，或兩個基因是否同時是否存在來定位基因需要檢測基因產(chǎn)物適合定位具有調(diào)節(jié)功能的基因誘導產(chǎn)生活性的基因根據(jù)選擇性標記基因互補的原理利用鼠營養(yǎng)缺陷型或某些抗性的標記基因舉例：人17號染色體，胸苷酸激酶基因TK2024/3/711表12－1雜種細胞中標記基因的存在與人體染色體間的關(guān)系人－鼠雜種細胞株編碼人類染色體號碼ABCDEFG1＋

－－－＋

－－2－－＋

－－－＋

3＋

－＋

－－＋

－4－＋

－－－＋

－5－－－＋

－－＋

人類基因編碼的酶葡萄糖磷酸變位酶－1＋

－－－＋

－－異檸檬酸脫氫酶－－＋

－－－＋

肽酶C＋

－－－＋

－－蘋果酸氧化還原酶－－＋

－－－＋

磷酸葡糖酸脫氫酶＋

－－－＋

－－核苷磷酸化酶－－－－－－－2024/3/712一、人類基因定位方法

(三)體細胞雜交定位法4、區(qū)域定(配)位（regionalassignment)

應用一系列有染色體畸變的特殊克?。ㄈ缬萌旧w易位，缺失作圖）最小重疊區(qū)SRO（smallestregionofoverlap)染色體介導的基因轉(zhuǎn)移chromosome-mediatedgenetransfer,CMGT將分離到的中期染色體導入雜種細胞染色體的某些片斷保留與丟失2024/3/713一、人類基因定位方法

（四）DNA介導的基因定位(核酸探針方法)1、克隆基因定位法采用已克隆基因的cDNA探針與保留在雜種細胞內(nèi)的人染色體DNA酶切序列進行分子雜交，來確定克隆基因所在的染色體。[舉例]以人體白蛋白基因cDNA為探針的克隆基因定位法

電泳條帶大小人細胞CHO中國倉鼠人CHO雜種細胞含4號染色體的雜種細胞不含4號染色體的雜種細胞陽性細胞陰性細胞3.5Kb√√√√√6.8Kb√√√[舉例]以人體白蛋白基因cDNA為探針的克隆基因定位法2024/3/715一、人類基因定位方法

（四）DNA介導的基因定位(核酸探針方法)2、原位雜交法以標記的探針（同位素、生物素或熒光染料）直接同中期染色體進行原位雜交。2024/3/716原位熒光雜交過程圖示2024/3/717原位熒光雜交染色體2024/3/718FISH2024/3/719二、人類染色體作圖二、人類染色體作圖ASSIGNMENTOFGENE(S)TOACHROMOSOMELinkageInsituhybridizationCellhybridsPFGE(脈沖場凝膠電泳分型技術(shù))RearrangementbreakpointsCHROMOSOMEMAPPINGRecombinationRadiationhybridsRESTRICTIONMAPPINGLongcutters(sites)PFGEPHYSICALMAPPINGYAC$CosmidsAlignmenttags(I)ClonedfragmentsMolecularmarker1Molecular

MolecularGenemarker2

marker3GeneMolecularmarker2Gene2024/3/720二、人類染色體作圖1、限制性長度多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphisms,RFLPs)利用限制性內(nèi)切酶將DNA分子切割成許多長度不等的限制性片段，這些具有長度不等的限制性片段類型在人群中呈現(xiàn)的多態(tài)分布現(xiàn)象就稱為限制性長度多態(tài)性。（1）作為遺傳界標(landmark)用一組隨機克隆的基因組片段作為探針，檢測（2）鑒定待測基因與界標的連鎖關(guān)系。2024/3/721二、人類染色體作圖（2）2、數(shù)目可變的串聯(lián)重復序列(variablenumbertandemrepeat,VNTR)不同數(shù)目的33bp的串聯(lián)重復DNA，分布在整個基因組的不同位點。DNA指紋：限制性酶消化產(chǎn)物在southern雜交中的一系列帶紋不同帶紋代表了在染色體不同位置上的不同長度的DNA序列。如果雙親在某一特定帶紋上表現(xiàn)不同時，這種差異即變成了雜合位置并可用來作圖。2024/3/722二、人類染色體作圖（3）12345顯性表型（P基因）父母標記ABCDEFGHI123452024/3/723三、人類基因組的物理作圖法以特定的DNA序列為界標直接排列在基因組DNA分子上，這些特定的DNA序列可以是多態(tài)的，如RFLPs，但主要是非多態(tài)的，如STS、STR、EST和特定的基因序列等。圖上界標之間的距離以物理長度來表示，即以核苷酸對的數(shù)目來表示。最精細的物理圖（physicalmap）就是基因組的全序列圖。

(一)DNA分子標記

(二)物理作圖基本方法

(三)DNA序列的測定

2024/3/724三、人類基因組的物理作圖法(一)DNA分子標記遺傳標記是可以追蹤染色體，染色體的某一節(jié)段、某一基因或某一特定DNA序列在家系中傳遞軌跡的任何一種遺傳特性。分子標記（molecularmarker）：特點:

是符合孟德爾分離定律，高度多態(tài)性和共顯性，大多數(shù)個體是雜合基因型，基因型可直接從表型確定。

1．RFLP標記限制性片斷長度多態(tài)性（restrictionfragmentlengthpolymorphism）

2024/3/725三、人類基因組的物理作圖法(一)DNA分子標記(2)2．VNTR標記數(shù)量可變串聯(lián)重復序列(variablenumberoftandemrepeat)，1985年。重復單位6-12個bp（33個bp）。在DNA的某些位置上這種串聯(lián)成簇的重復單位數(shù)目不同,因此，用在串聯(lián)重復序列兩側(cè)的限制內(nèi)切酶酶切后，就會產(chǎn)生重復數(shù)目不等到的片段。探針Ⅰ：位于此特殊VNTR獨有的DNA片段。探針Ⅱ：根據(jù)VNTR多態(tài)性本身設(shè)計，可檢測到所有相關(guān)的譜帶?？勺鰹镈NA指紋分析。2024/3/726三、人類基因組的物理作圖法(一)DNA分子標記(3)3．STR標記短串聯(lián)重復序列（shorttandemrepeat）

2-6bp重復單位特點：①

高度多態(tài)。②

高頻率性、分布廣、平均分布。③

STR兩側(cè)有特異性單拷貝順序。④

相對容易進行PCR微衛(wèi)星已成為取代RFLP的第二代分子標記2024/3/727三、人類基因組的物理作圖法(一)DNA分子標記(4)4．SNP（singlenucleotidepolymorphism）SNP就是指基因組內(nèi)特定核苷酸位置上存在兩種不同的核苷酸，且其出現(xiàn)頻率大于1%（也有人提出為2%）。這種界標在人基因組中可多達300萬個，平均1300bp就會有一個。這種界標數(shù)目極多，覆蓋密度大，可以大大提高基因組作圖和基因定位的精度。SNP可人為地劃分為兩種，一種是遍布在基因組非編碼序列中的單核苷酸變異；另一種則是分布在基因編碼序列中的SNP，稱之為cSNP(codingSNPs)1996年美國E.S.Lander提出，稱為第三代DNA遺傳標記。2024/3/728三、人類基因組的物理作圖法(一)DNA分子標記(5)5．非多態(tài)的短單一序列單拷貝的，長度為300bp左右（200-500）的單一序列。分為:①標定位置序列（sequencetaggedsite,STS）是基因組中的單一DNA序列，只出現(xiàn)一次，易于PCR擴增和檢測。②表達序列標簽（expressedsequencetags,EST）是某一cDNA分子的特有的一段DNA序列，可作為遺傳標記和檢測檢測基因組中的編碼序列。2024/3/729三、人類基因組的物理作圖法(二)物理作圖基本方法[例]一個線狀DNA分子，用兩種限制性內(nèi)切酶酶切，結(jié)果如下：BamHⅠ8.0,7.5,4.5,2.9KbBglⅡ13,6,3.9KbBamHⅠ+BglⅡ7.5,6,3.5,2.9,2,1Kb請畫出這個線狀DNA的限制酶譜2024/3/730三、人類基因組的物理作圖法(二)物理作圖基本方法

BamHⅠ8.0,7.5,4.5,2.9KbBglⅡ13,6,3.9KbBamHⅠ+BglⅡ

7.5,6,3.5,2.9,2,1KbBamHⅠBglⅡ

26BglⅡBamHⅠBamHⅠ17.53.52.9答：分析：8624.513.5137.53.522.92024/3/731三、人類基因組的物理作圖法（二）（二）物理作圖基本方法

1．由長到短作圖（top-downmaping）(1)完全酶切(2)先長切，用識別順序少的限制酶，100Kb-1000Kb

再短切，用識別順序多的限制酶，酶切長片段。(3)連接優(yōu)點：匯成的圖譜比較完整缺點：不夠精細，分辨率較低2024/3/732三、人類基因組的物理作圖法(二)物理作圖基本方法

2.由短到長作圖（bottom-upmaping）用有很多識別序列的限制性內(nèi)切酶通過減少酶量，縮短反應時間，作部分酶切（partialdigestion）。特點是一些片段相互之間有重疊部分，因此部分酶切的片段兩兩連接，逐漸延長片段。優(yōu)點：分辨率較高，比較精細；缺點：斷片段易丟失，連接時可能出現(xiàn)空擋（gap）

疊連群是彼此間可通過重疊序列而連接成較長片段的一組短片組。2024/3/733三、人類基因組的物理作圖法(二)物理作圖基本方法

部分酶切2024/3/734三、人類基因組的物理作圖法(三)DNA序列的測定1.化學測序法(chemicalmethodofDNAsequencing)又稱Maxam-Gilbert法,先要獲得單鏈DNA片段，100～200核苷酸，待測的5'末端用32P標記，然后分成4份，分別以4種化學方法部分降解DNA，使DNA片段在含特定堿基處切斷，產(chǎn)生四組隨機片斷，然后各個處理所產(chǎn)生的DNA隨機片段混合物分別用同一聚丙烯酰胺凝膠電泳，把不同長度的片段分開，根據(jù)所得的電泳的放射自顯影，從底部最短的條帶向上,一條條依次地讀取，即可得堿基順序。2024/3/73532P—C—C—C—G—A—T—T—A—G—C—T—T—G—三、人類基因組的物理作圖法(三)DNA序列的測定樣品分成4份32P—C—C—C—G—A—T—T—A—G—C—T—T—G—分別作部分化學降解C+T專一反應C專一反應G+A專一反應G專一反應GTTCGATTAGCCC2024/3/736三、人類基因組的物理作圖法(三)DNA序列的測定2．雙脫氧法（dideoxytechnique）又稱鏈終止法(chainterminatortechnique)是英國Sanger發(fā)明的，又稱Sanger法O堿基5’－CH2HOH3’O堿基5’－CH2HH3’2024/3/737三、人類基因組的物理作圖法(三)DNA序列的測定2．雙脫氧法（dideoxytechnique）單鏈DNA模板→寡核苷酸DNA引物→分成4份，加入dATP，dGTP，dCTP，dTTP其中一種有放射性，分別加入雙脫氧核苷酸

（ddATP，ddGTP，ddTTP，ddCTP）,

雙脫氧核苷酸可以替代脫氧核苷酸摻入模板的DNA的互補鏈中，使DNA合成終止。2024/3/738三、人類基因組的物理作圖法(三)DNA序列的測定4種處理，對應4種終止方式+ddATP+ddCTP+ddATP+ddGTPGTTCGATTAGCCC—C—C—C—G—A—T—T—A—G—C—T—T—G—

C

C

C

G

A

T

T

A

G

C

T

T

GKlenow酶+4NTP+1ddNTP使引物延伸

—T—T—T—A—G—C—C—G—A—T—C—C—A—模板鏈互補鏈終止2024/3/739三、人類基因組的物理作圖法(三)DNA序列的測定3．DNA自動測序同Sanger法，不同的是用4種不同的熒光染料標記引物，分別對應4種雙脫氧核苷酸，把4種反應物混合后，走聚丙烯酰胺凝膠電泳，激光照射，熒光檢測器。

本節(jié)結(jié)束鏈接到第一～三節(jié)性別決定與分化第四節(jié)劑量補償效應第五節(jié)連鎖基因的交換與重組第六節(jié)真菌類的遺傳學分析HAT培養(yǎng)基（HATmedium）HAT系次黃嘌呤(hypoxantin)、氨基蝶呤(aminopterin)和胸腺嘧啶脫氧核苷(thymidin)，HAT培養(yǎng)基也就是指含有這三種物質(zhì)的細胞培養(yǎng)基。對具有合成DNA原料的核苷酸的形成上，在細胞內(nèi)具有起始合成途徑(denovopathway)和中間合成途徑（salvagepa-thway)。由于氨基蝶呤可阻礙起始合成途徑，所以培養(yǎng)基中含有它時，細胞便只有中間合成途徑，所以必須供給核苷酸。至于缺失中間合成途徑的細胞，可失去增殖能力臻于死亡。根據(jù)這一點，不僅把混存于細胞群中的正常細胞，通過試管內(nèi)培養(yǎng)進行選擇，例如嘌呤的中間合成途徑缺失株和嘧啶的中間合成途徑缺失株，由于可以互補，所以兩者的雜種細胞，即使在氨基蝶呤的存在條件下也可以增殖。在這種情況下，利用HAT培養(yǎng)基可對雜種細胞進行選擇。次黃嘌呤和胸腺嘧啶脫氧核苷可作為中間合成途徑的原