第3講 生物信息學序列分析生物信息學常用軟件及其使用

第三講生物信息學常用軟件及其使用一、DNA序列片斷拼接

（電子基因克?。┇@得感興趣的EST，在dbEST數(shù)據(jù)庫中找出EST的最有途徑是尋找同源序列，標準：長度≥100bp，同源性50%以上、85%以下。然后將檢出序列組裝為重疊群（contig），以此重疊群為被檢序列，重復進行BLAST檢索與序列組裝，延伸重疊樣系列，重復以上過程，直到?jīng)]有更多的重疊EST檢出或者說重疊群序列不能繼續(xù)延伸，有時可獲得全長的基因編碼序列。再與GeneBank核酸數(shù)據(jù)庫進行相似性檢測，假如有精確匹配基因，將EST序列數(shù)據(jù)據(jù)EST六種閱讀框翻譯成蛋白質(zhì)，接著與蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫進行比較分析。

VectorNTI5.2中的contigExpressContigExpress軟件：

Sequencer軟件：/pub/SequencherPC.zip舉例說明使用二、DNA序列測定圖譜分析Chromas軟件：.au/chromas230.exe三、限制性核酸內(nèi)切酶位點的分析限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease） 識別DNA的特異序列，并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。即一類能識別雙鏈DNA分子中特異核苷酸序列的DNA水解酶。 是細菌內(nèi)存在的保護性酶。分為I、II、III三類。（一）定義：其中的II類限制性核酸內(nèi)切酶是重組DNA技術(shù)中的重要工具酶。II類酶識別序列特點為回文結(jié)構(gòu)，大多為4~6bp

回文結(jié)構(gòu)（palindromesequence），如EcoRI

識別序列：5’GAATTC3’5’GGATCC3’

3’CTTAAG5’3’CCTAGG5’限制性核酸內(nèi)切酶命名Smith和Nathame命名原則（1973）

屬名+種名+株名+流水例如：流感噬血桿菌d株

（Haemophilus

influengae

d）

HindⅠ

HindⅡHindⅢHindⅣ常用的限制性核酸內(nèi)切酶酶切序列限制酶識別序列及切口限制酶識別序列及切口

AluⅠAG/CTHindⅢA/AGCTT

TC/GATTCGA/A

BamHⅠG/GATCCSalⅠG/TCGAC

CCGAG/GCAGCT/G

BglⅠA/GATCTSmaⅠCCC/GGG

TCTAG/AGGG/CCC

EcoRⅠG/AATTC

CTTAA/Gstickyend

5’3’5’3’5’3’

EcoRⅠGAATTCGAATTC

CTTAAGCTTAAG

3’5’3’5’35’

bluntend

5’3’5’3’5’3’

SmaⅠCCCGGGCCCGGG

GGGCCCGGGCCC

3’5’3’5’3’5’

利用NEBLab在線免費軟件分析：/NEBcutter2/index.phpDNAStar、DNAClub、DNATool

等其他商業(yè)軟件均能分析。

以DNAClub為例說明。四、PCR引物設(shè)計

（包括雜交探針設(shè)計）（一）引物設(shè)計的原則引物要跟模板緊密結(jié)合；引物與引物之間不能有穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)存在；引物不能在別的非目的位點引起高效DNA聚合反應(即錯配)。引物長度（primerlength），產(chǎn)物長度（productlength），序列Tm值(meltingtemperature)，ΔG值(internalstability)，引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)（duplexformationandhairpin），錯誤引發(fā)位點（falseprimingsite），引物及產(chǎn)物GC含量（composition），有時還要對引物進行修飾，如增加限制酶切點，引進突變等。（二）引物設(shè)計需要考慮的因素（三）引物設(shè)計要點一般引物的長度為15-30bp，常用的長度為18-24bp，過長或過短都不合適。引物3’端的堿基一般不用A，因為A在錯誤引發(fā)位點的引發(fā)效率相對比較高，而其它三種堿基的錯誤引發(fā)效率相對小一些。引物的GC含量一般為45-55%，過高或過低都不利于引發(fā)反應。上下游引物的GC含量不能相差太大。引物所對應模板序列的Tm值最好在72℃左右，當然由于模板序列本身的組成決定其Tm值可能偏低或偏高，可根據(jù)具體情況靈活運用。ΔG值反映了引物與模板結(jié)合的強弱程度，也是一個重要的引物評價指標。一般情況下，在Oligo5.0軟件的ΔG值窗口中，引物的ΔG值最好呈正弦曲線形狀，即5’端和中間部分ΔG值較高，而3’端ΔG值相對較低，且不要超過9（ΔG值為負值，這里取絕對值），如此則有利于正確引發(fā)反應而可防止錯誤引發(fā)。其原理，引物與模板應具有較高的結(jié)合能量，這樣有利于引物與模板序列的整合，因此5’端與中間段的ΔG值應較高，而3’端ΔG值影響DNA聚合酶對模板DNA的解鏈，過高則不利于這一步驟?？赡艿腻e誤引發(fā)位點決定于引物序列組成與模板序列組成的相似性，相似性高則錯誤引發(fā)率高，錯誤引發(fā)的引發(fā)率一般不要高過100，最好沒有錯誤引發(fā)位點，如此可以保證不出非目的產(chǎn)物的假帶。引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能量一般不要超過4.5，否則容易產(chǎn)生引物二聚體帶，且會降低引物濃度從而導致PCR正常反應不能進行。對引物的修飾一般是增加酶切位點，應參考載體的限制酶識別序列確定，常常對上下游引物修飾的序列選用不同限制酶的識別序列，以有利于以后的工作。推薦使用自動搜索軟件（商業(yè)軟件）：PrimerPremier5.0推薦使用引物評價軟件（商業(yè)軟件）：Oligo6

網(wǎng)址：

（四）、引物設(shè)計軟件的使用OLIGO6.0PCR引物設(shè)計設(shè)計引物的免費在線軟件Primer3，

網(wǎng)址:/primer3我的評價：是非常優(yōu)秀的設(shè)計引物的軟件！是真正的“免費的午餐”！天上會掉下“餡餅”的?——會的!!以一條序列為例，說明其使用方法五、質(zhì)粒繪圖軟件

Winplas

（商業(yè)軟件）

pDRAW32軟件（商業(yè)軟件），其網(wǎng)址：

http://hjem.get2net.dk/acaclone，可以看到演示版和有關(guān)信息

VectorNTI（商業(yè)軟件）Winplas2.6質(zhì)粒構(gòu)建

Plasmidprocessor其免費下載的網(wǎng)址http://www.hytti.uku.fi/%7Eoikari/plasmid.html

DMUPbeta其免費下載的網(wǎng)址/down/dmup.zipPlasmidprocessor質(zhì)粒作圖軟件是壓縮軟件，需要先將其解壓到一個目錄下（不需安裝即可直接應用），然后才能應用。（壓縮文件是網(wǎng)絡(luò)傳輸?shù)淖畛Ｓ梦募?，目的是為了傳輸方便）?）在資源管理器中雙擊Plasmid.exe

文件（553kb)，進入作圖的界面；2）點file-->new,在出來的對話框中填上Plasmidname和length,比如分別填pBR322和4322（bp)（注意不能填4.322kb，否則軟件不認識）。點擊OK，進入下一個界面，上面是一個圓，標著pBR322和4322bp。3）點-->date-->restrictionsite加酶切位點，填酶的名稱及定位；4）點Date-->multiple-->Genes,填基因名稱（如E6），位點在500至890處，還是在此對話框中，選擇右下角的style選所加基因的格式是箭頭還是長的圓弧等格式（根據(jù)喜好），選厚薄度（thichness),然后點擊此對話框右上部分的AddGene，，在點擊done，于是基因就加上了。基因和酶切位點可反復加多次。5）但本軟件缺陷之處上多克隆位點不能直接加，只能通過點-->date-->restrictionsite加酶切位點，在此對話框中加多克隆酶切位點（如加HinIII,EcoRI,BstI時，點-->date-->restrictionsite加酶切位點，出現(xiàn)對話框后，HinIII,location比如填1，-->Addsite;EcoRI填3,-->Addsite;Bst填5-->Addsite;然后點擊OK.在圓上將位點1~5處用鼠標往旁邊分別一拖，就可看見這三個位點了。

質(zhì)粒作圖的在線軟件PlasMapper2.0http://wishart.biology.ualberta.ca/PlasMapper六、進化樹分析軟件

MEGA4.0：免費分子進化遺傳分析軟件免費下載地址:VectorNTI：商業(yè)軟件VectorNTISuit同源比較—主窗口VectorNTISuit同源比較—進化樹Nosema

granulosisNosema

furnacalisVairimorpha

imperfectaNosema

tyriaeMG5Nosema

bombycisNosema

bombycisNosema

bombycisNosemasp.Vairimorpha

sp.Mh8535MG4Mh7521N.BNosema

cernanae

Vairimorpha

necatrixNosema

necatrixNosema

oulemaeC.SNosemasp.P.RMG2Vairimorphasp.Nosemasp.Nosema

portugalMicrosporidiumsp.Nosema

vespulaVairimorpha

lymantriaeVairimorpha

sp.Nosema

apisNosema

apis七、序列的同源性分析軟件BlastClustalWBlast簡介BLAST是由美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）開發(fā)的一個基于序列相似性的數(shù)據(jù)庫搜索程序。BLAST是“局部相似性基本查詢工具”(BasicLocalAlignmentSearchTool)的縮寫。/BLAST/(網(wǎng)絡(luò)版)主要的blast程序程序名查詢序列數(shù)據(jù)庫搜索方法blastn核酸核酸核酸序列搜索逐一核酸數(shù)據(jù)庫中的序列blastp蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)序列搜索逐一蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中的序列blastx核酸蛋白質(zhì)核酸序列6框翻譯成蛋白質(zhì)序列后和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中的序列逐一搜索。tblastn蛋白質(zhì)核酸蛋白質(zhì)序列和核酸數(shù)據(jù)庫中的核酸序列6框翻譯后的蛋白質(zhì)序列逐一比對。tblastx核酸核酸核酸序列6框翻譯成蛋白質(zhì)序列，再和核酸數(shù)據(jù)庫中的核酸序列6框翻譯成的蛋白質(zhì)序列逐一進行比對。舉例說明使用過程>p1MSDNGPQSNQRSAPRITFGGPTDSTDNNQNGGRNGARPKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEELRFPRGQGVPINT