2018級天然實驗

1、實驗一(1)葉綠體色素的提取一、實驗目的掌握有機溶劑提取葉綠體色素等天然化合物的原理和實驗方法。二、實驗原理植物光合作用是自然界最重要的現(xiàn)象，它是人類所利用能量的主要來源。在把光能轉 化為化學能的光合作用過程中，葉綠體色素起著重要的作用。高等植物體內(nèi)的葉綠體色素有 葉綠素和類胡蘿卜素兩類，主要包括葉綠素1、葉綠素b、。-胡蘿卜素和葉黃素四種。它們所 呈現(xiàn)的顏色和在葉綠體中含量大約比例見表1。表1高等植物體內(nèi)葉綠體色素的種類、顏色及含量色素名稱項目J、-、葉綠素類胡蘿卜素葉綠素a葉綠素bP-胡蘿卜素葉黃素顏色藍綠色黃綠色橙黃色黃色在葉綠體內(nèi)各色素含量比例312131葉綠素(chlorophyll

2、s)是葉綠酸的酯，它在植物進行光合作用中吸收可見光，并將光能轉 變?yōu)榛瘜W能。葉綠素是植物進行光合作用所必需的催化劑。在綠色植物中葉綠素主要以葉綠 素a(C H ON Mg)和葉綠素b(C H O N Mg)兩種結構相似的形式存在，其差別僅是 55 72 5 455 70 6 4葉綠素a中一個甲基被葉綠素b中的甲?；〈Ｈ~綠素的基本結構見圖1。在葉綠素分子 結構中含有四個毗咯環(huán)，它們由四個甲烯基聯(lián)結成卟琳環(huán)，在卟琳環(huán)中央有一個鎂原子，它 以兩個共價鍵和兩個配位鍵與四個毗咯環(huán)的氮原子結合成內(nèi)配鹽，形成鎂卟琳。在葉綠素分 子中還有兩個羧基，其中一個與甲醇酯化成COOCH3，另一個與葉綠醇酯化阪0

3、 OC20H39長 鏈。類胡蘿卜素(carotenoids)是一類不飽和的四萜類碳氫化合物(例如胡蘿卜素，carotenes)， 或它們的氧化衍生物(例如葉黃素類，xanthophylls)o所有的類胡蘿卜素均源于非環(huán)狀的 c40h56結構。類胡蘿卜素在強光下可防止葉綠素的光氧化；在弱光下，可作為輔助色素吸收 光能并傳遞給葉綠素分子。胡蘿卜素有三種異構體，即a-、P-和Y-胡蘿卜素，其中。-胡 蘿卜素含量最多，也最為重要。-胡蘿卜素還具有維生素A的生理活性，其結構是由兩分 子維生素A在端鏈失去兩分子水結合而成。在生物體內(nèi)，。-胡蘿卜素受酶催化氧化即形成維生素A。葉黃素（3, 3-二羥基-a-胡

4、蘿卜素，lutein, C40H56O2）是一種常見的氧化型的類胡 蘿卜素。P-胡蘿卜素和葉黃素均屬于脂溶性化合物。植物葉綠體色素的提取、分離、表征及含量測定在植物生理學和農(nóng)業(yè)科學研究中具有重 要意義。同時，葉綠素和胡蘿卜素等天然色素在食品工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)中也有廣泛的用途。ChlarR=CHnChib葉螺素質R-胡簍卜素、葉黃素 和維上素&的結購式葉綠素a和b都是毗咯衍生物與金屬鎂的配合物，盡管它們分子中含有一些極性基團， 但大的烷基結構使它們易溶于丙酮、乙醇、乙醚、石油醚等有機溶劑。-胡蘿卜素和葉黃 素是脂溶性的四萜化合物。與胡蘿卜素相比，葉黃素易溶于醇而在石油醚中的溶解度較小。 根據(jù)它們在有

5、機溶劑中的溶解特性，可將它們從植物葉片中提取出來。植物葉綠體色素通常 可用丙酮、乙醇、乙醚、丙酮-乙醚、甲醇-石油醚等有機溶劑提取。由于粗提取液中還可 能包括殘余植物組織和其它可溶性雜質，實驗中應對粗提液進一步純化。三、實驗儀器與試劑1.儀器研缽、量筒、分液漏斗等常用玻璃儀器一套。2.試劑丙酮、乙醇、乙醚、石油醚等有機溶劑。飽和氯化鈉水溶液。碳酸鎂和無水硫酸鈉。四、實驗步驟1 .葉綠體色素的提取方法一：采集新鮮樹葉，洗凈后棄除葉柄和中脈，然后用紗布或吸水紙將樹葉表面的 水分吸干。稱取處理過的樹葉3 g,剪碎后放在干凈的研缽內(nèi)，加入0.1 g碳酸鎂，先將樹葉 粗搗爛，然后加入10 mL乙醇-石油

6、醚（2:3），迅速研磨5 min。過濾去樹葉殘渣，再研磨 提取一次。最后再用10 mL乙醇-石油醚（2:3）洗滌研缽等容器，一并過濾。方法二：類似于方法一，采用丙酮提取，但在純化時應事先在分液漏斗中加入15 mL 石油醚。粗提取液的純化純化色素時，將合并的濾液轉入分液漏斗，加XmL飽和的NaC l溶液和45 mL蒸餾水， 輕輕振蕩，放置分層。小心地把下層的含乙醇水溶液放掉，用洗瓶沿分液漏斗內(nèi)壁加入50 mL 蒸餾水洗滌石油醚層23次，以徹底洗去乙醇或丙酮。每次都要輕輕轉動分液漏斗，使葉綠 體色素保留在上層的石油醚層中，靜置，待分層清楚后，去掉下面的水溶液。再往石油醚色 素提取液加入少量無水Na

7、2SO4除去殘余水分，然后轉入具塞的棕色瓶中置于暗處保存。五、注意事項葉綠體色素對光、溫度、氧氣環(huán)境、酸堿及其它氧化劑都非常敏感。色素的提取和分析一 般都要在避光、低溫及無酸堿等干擾的情況下進行。乙醚使用前應重蒸除去過氧化物。使用低沸點易揮發(fā)有機溶劑要注意實驗室安全。實驗室要保持良好的通風條件，不得靠近 明火操作。提取液不宜長期存放，必要時應抽干充氮避光低溫保存。六、思考題綠色植物葉片的主要成分是什么？提取液可能含有哪些化合物？一般天然產(chǎn)物的提取方式有哪些？殘余的植物組織應如何除去？用乙醇-石油醚提取和用丙酮提取可能對結果產(chǎn)生什么影響？實驗一（2）葉綠體色素的色譜分離一、實驗目的1 .掌握薄層

8、色譜分離原理和實驗技術。2.掌握快速柱色譜分離原理和實驗技術。二、實驗原理色譜法是與植物天然色素的分離提取同時發(fā)展起來的。色譜法（紙色譜、薄層色譜和柱 色譜）至今仍然是分離葉綠素等天然色素最有效的方法。色譜法分離葉綠體色素的基本原理是利用不同色素在各種有機溶劑中的分配系數(shù)，或在 吸附劑上的吸附能力的不同，當它們通過色譜柱/床時，這種分配或吸附過程反復多次地進 行，最后將它們一一分離開來。通常認為，紙色譜屬于分配色譜。它是以濾紙為惰性支持物，濾紙纖維一般能吸收約20 %的水分，其中有67 %以氫鍵形式與纖維素上的羥基結合，構成紙色譜的固定相。在 展開過程中，被分離組分在展開劑和固定相之間不斷進行

9、分配，達到相互分離。薄層色譜和 柱色譜的吸附劑（固定相）有硅膠、氧化鋁、硅藻土等無機物，也有糖類、纖維素、聚酰胺、 ci8和離子交換樹脂等有機物。它們的分離機理也各不相同，如吸附、分配，氫鍵、正相和 反相色譜等。對于紙色譜或薄層色譜，毛細管作用是推動溶劑展開的動力。被分離物質在圖譜上的 位置，可用比移值R表示。f比移值的大小與被分離物質的分配系數(shù)大小有關，它是紙色譜法和薄層色譜法實驗中 唯一可用數(shù)值表示的重要參數(shù)。在一定的色譜系統(tǒng)中，在確定的溫度下，R是被分離物質的 f特征常數(shù)。R值差別越大，則分離越完全。f對于相同的色譜體系，薄層色譜的R值與液相色譜的容量因子1值之間有一定的關系 f即在薄層

10、色譜中展開快的組分，在柱色譜中先出峰。通過薄層色譜實驗可以探索高效液相色 譜合適的流動相組成。值得一提的是快速柱色譜（Flash Chromatography），它是介于經(jīng)典柱色譜和高效制備 型液相色譜之間的一種實驗室分離技術，主要用于天然產(chǎn)物和化學反應產(chǎn)物的快速分離和純 化工作。本實驗通過紙色譜、薄層色譜和快速柱色譜方式，對植物色素的提取液進一步分離成 葉綠素a、葉綠素3、8胡蘿卜素和葉黃素幾個組分，并進行光譜表征和鑒定其純度。通過多 次紙制備色譜也可以得到少量葉綠素a和葉綠素b純品。三、實驗儀器與試劑儀器層析缸、大量筒、表面皿、帶有加壓裝置的玻璃層析柱等常規(guī)層析裝置。2 .試劑乙酸乙酯、石

11、油醚、乙醚、乙醇等有機溶劑。硅膠H。四、實驗步驟薄層色譜薄層色譜是一種較新的分離物質的方法，具有快速、微量、靈敏度高、分離效率好等優(yōu) 點。薄層色譜對天然產(chǎn)物的分離、鑒定更有獨到之處，在中草藥有效成分的純化鑒定中廣泛 應用。分離葉綠體色素的薄層色譜吸附劑有硅膠、纖維素、聚酰胺、C等。下面僅介紹常 用的硅膠薄層色譜法。薄層板的制備取若干塊洗凈的載玻片，采用用羧甲基纖維素鈉作粘合劑，取硅膠H(200250目)1份， 加入0.5 %羧甲基纖維素鈉溶液2份，充分調(diào)勻后，即可涂鋪，晾干后在105C活化0.5 h， 放在干燥器內(nèi)備用。點樣取制備好的薄層板一塊，在板兩側距底邊1cm處各做一記號，用玻璃毛細管吸

12、取濃縮的 色素石油醚提取液，點樣，斑點不應超過5 mm，晾干。展開分離葉綠體色素的展開劑有：石油醚(6090C)-丙酮-乙醚(3:1:1)；石油醚-丙酮(8：2)；石油醚-乙酸乙酯(6:4)；苯-丙酮(7:3)和石油醚(3060C)-丙酮-正丁醇(90:10:4.5) 等。本實驗將150 mL石油醚(6090C)-丙酮-乙醚(3:1:1)展開劑倒入層析缸中，并在層 析缸的內(nèi)壁四周貼一張5 cm高的濾紙，濾紙下部浸在展開劑中，蓋好蓋子平衡1015 min。將點好樣的硅膠板放入展開缸里，液面不能超過點樣線，蓋好蓋子進行上行層析。待展開劑 前沿上升到距硅膠板上端1.52 cm時，取出硅膠板置于通風櫥

13、里晾干，可看到層析板上出現(xiàn) 若干色素帶，其排列順序一般是3-胡蘿卜素、去鎂葉綠素、葉綠素!、葉綠素13和葉黃素等多 條色帶。用鉛筆標記出樣品斑點，計算各色素的比移值Rf。(4 )樣品收集將層析板上分開的P-胡蘿卜素、葉綠素a、葉綠素b的色帶分別用干凈的刮刀刮入試管 中，加A5mL丙酮提取，低溫避光保存。樣品純度的鑒定色譜法分離得到的樣品組分，可用吸收光譜(400700 nm)和熒光光譜進行表征和鑒 定。其純度也可通過薄層色譜點板實驗和后面介紹的三種測定技術進行測定。五、注意事項強光會破壞色素，提取過程應盡可能在弱光或暗室中進行。使用低沸點易揮發(fā)有機溶劑要注意實驗室安全。實驗室要保持良好的通風條件，使用有 機溶劑不得靠近明火操作。分離后的單一色素提取液不