實驗一 細菌的革蘭氏染色

實驗一細菌的革蘭氏染色日期10月27號星期三90節(jié)一實驗目的1學習顯微鏡油鏡的使用方法2學習微生物的無菌操作技術3學習細菌的革蘭氏染色法二實驗原理1顯微鏡及油鏡物鏡的使用原理1)油鏡頭的標志油鏡頭上?？逃蠴I（oilimmersion）或HI（homogeousimmersion）字樣，有的還刻有一圈紅線或黑線標記。在低倍物鏡、高被物鏡和油鏡3種物鏡中，油鏡的放大倍數(shù)和數(shù)值孔徑（numericalaperture）最大，而工作距離最短。2)顯微鏡的分辨率顯微鏡性能的優(yōu)劣不單是看它的總放大倍數(shù)，更重要的是看它的分辨率的大小。分瓣率是指顯微鏡能分辨出物體兩點間最小距離（D）的能力。D值愈小表明分辨率愈高。D值與光線的波長（λ）成正比，與物鏡的數(shù)值孔徑（NA）成反比：D=λ/2NA從上式可看出，縮短光波長和增大數(shù)值孔徑都可提高分辨率。數(shù)值孔徑指光線投射到物鏡上的最大角度（稱鏡口角，α）的一半正弦與介質(zhì)折射率（n）的乘積：NA=n×Sinα/2影響數(shù)值孔徑大小的因素－是鏡口角，二倍介質(zhì)的折射率。當物鏡與玻片之間的介質(zhì)為空氣時，由于空氣（n=1.0）與玻璃（n=1.52）的折射率不同，光線會發(fā)生折射，不僅使進入物鏡的光線減少，降低了視野的照明度，而且會減少鏡口角。當以香柏油（n=1.515）為介質(zhì)時，由于它的折射率與玻璃的相近，光線經(jīng)過玻片后可直接通過香柏油進入物鏡而不發(fā)生折射，不僅增加了視野的照明度，更重要的是通過增加數(shù)值孔徑達到提高分辨率的目的。2細菌的革蘭氏染色原理革蘭氏染色法是1884年由丹麥病理學家C.Gram創(chuàng)立的。作為細菌學上最常用最重要的鑒別染色法，革蘭氏染色法可將所有的細菌區(qū)分為革蘭氏陽性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（G－）兩大類.G－菌的細胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質(zhì)，而且肽聚糖層較薄、交聯(lián)度低，故用乙醇或丙酮脫色時溶解了類脂質(zhì)，增加了細胞壁的通透性，使初染的結(jié)晶紫和碘的復合物易于滲出，結(jié)果細菌就被脫色，再經(jīng)番紅復染后就成紅色。G+菌細胞壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高，類脂質(zhì)含量少，經(jīng)脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，因此細菌仍保留初染時的顏色。三實驗器材1菌種：培養(yǎng)24h的枯草桿菌（Bacillcussubtilis）、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌。2染色液和試劑：生理鹽水、草酸銨結(jié)晶紫染液、碘液、95%乙醇、番紅復染液,香柏油，顯微鏡擦拭液.３器材：酒精燈、接種環(huán)、鑷子、載玻片、擦鏡紙、吸水紙、記號筆、試管夾、顯微鏡等。四實驗方法1涂片:取一干凈載玻片,中央滴一小滴生理鹽水,無菌操作取菌無菌操作(快):在酒精燈上灼燒接種環(huán)(注意手勢)---松動試管帽---取下試管帽---灼燒管口---在火焰旁接種環(huán)通過火焰進入菌種管---接種環(huán)在管壁冷卻---挑取菌少許---退出---灼燒管口---蓋帽---涂片(調(diào)勻涂成薄膜)---灼燒接種環(huán).2干燥:室溫自然涼干3固定:手執(zhí)玻片一端，讓菌膜朝上，通過火焰2-3次固定（以不燙手為宜）.4染色:初染(加草酸銨結(jié)晶紫一滴,約一分鐘,自來水水洗)---媒染(加碘液沖去殘水,并覆蓋一分鐘,水洗)---脫色(將水甩凈,襯以白背景,用95%酒精滴洗至流出的酒精不出現(xiàn)紫色時為止,約20-30秒,立即用水沖凈酒精)---復染(用蕃紅液染2-3分鐘,水洗)5干燥:室溫涼干或吹風機吹干6鏡檢:先低倍觀察，再高倍觀察，并找出適當?shù)囊曇昂?，將高倍鏡轉(zhuǎn)出，在涂片上加香柏油，油觀察細菌的形態(tài)。五實驗現(xiàn)象1枯草桿菌革蘭氏陽性桿菌，桿形，不規(guī)則排列，紫色2金黃色葡萄球菌革蘭氏陽性球菌，圓球形，不規(guī)則排列，紫色3大腸桿菌革蘭氏陰性桿菌，桿形，不規(guī)則排列，紅色六實驗結(jié)果及思考題１用油鏡觀察時玻片為什么要完全涼干?答：當玻片未完全晾干時，殘留的水會使折射率增大，使景象模糊。２敘述無菌操作時應注意的問題。答：接種環(huán)在接種前后都需灼燒，試管蓋不可隨處放置，取菌株時需穿過火焰。３繪出所觀察細菌的菌體形態(tài)并注明革蘭氏染色反應陽性和陰性。4革蘭氏染色成敗的關鍵是什么?答：染色時間