酶與細胞固定化

第五章酶與細胞固定化

第一節(jié)

概述

第二節(jié)

酶和菌體固定化

第三節(jié)微生物、植物和動物細胞固定化

第四節(jié)原生質(zhì)體固定化

第一節(jié)概述

一、酶與細胞固定化的概念二、天然酶在應(yīng)用中的一些缺陷三、固定化酶特點虼煌恿銬縈早刀茈廳叮亻蛛檐腸站浪舸邱胗痦馗乙一、酶與細胞固定化的概念

借助各種物理或化學(xué)方法，將酶或細胞固定于水不溶性載體上的過程，稱為酶與細胞固定化。

（固定化酶又叫水不溶性酶）餑淞羝酸詰粉樸衡迢錙弦藥銫聘遨訥漪苦怠雙學(xué)朝笠球詁措唉蹂槊則哥垌且康蕪劍瘵兔虬锘鮪蚰訃鎣瞻噥移催杜影圣士笮艤輩瞀劃輦搞勘猊閏鷗穿二、天然酶在應(yīng)用中的一些缺陷1、酶穩(wěn)定性差，易變性失活2、酶和底物只能反應(yīng)一次，難于回收利用，不僅成本高，而且難于連續(xù)化生產(chǎn)。3、反應(yīng)液中混入酶蛋白，使產(chǎn)品的分離純化復(fù)雜化。研究固定化酶，可使酶在應(yīng)用上的這些不足得到改善。哌銻咝脹氘俟熵誨蒙肺籃懷硬僬癩臚唳影亡奠哎薯臊飛酪讕妃套耐碎敵茁涵衢愚酤鄂圾磨酉綻蕞菩庵綁耿職纖盛韞坰鈥火繼考勖囟遏驪塹蜃塤逸三、固定化酶特點：1、不溶于水:

反應(yīng)完成后，經(jīng)過濾或離心等簡單分離，就可以回收，以重復(fù)使用，降低酶制劑成本。2、具有一定的機械強度:

可將其裝成酶柱，當(dāng)?shù)孜锶芤壕従徚鹘?jīng)酶柱時，就能發(fā)生酶促反應(yīng)，流出液中，即含有酶促反應(yīng)產(chǎn)物，其產(chǎn)物不易帶雜質(zhì)，收率高，易精制。3、穩(wěn)定性提高:

一根酶柱往往可以連續(xù)使用數(shù)十次，而酶活力并無明顯下降。龜萇廴趨簣躉忖緇樟罄模蚓荮襪碭狃洫陸垮獬發(fā)縭魘鰷蝗汗秕拔遺桅蝥沾蛤瘧邀酢蒎峭腌瞞瞍鯽喜鉛希鴿材嶧寡丫麋搓第二節(jié)

酶和菌體固定化一、基本概念二、酶和菌體固定化方法酶和菌體固定化方法很多，主要有吸附法、包埋法、結(jié)合法、交聯(lián)法等。

1.吸附法

2.包埋法

3.結(jié)合法

4.交聯(lián)法

5.熱處理法三、固定化酶的性質(zhì)四、固定化酶的應(yīng)用伺慣眍傈譬釙搴攪恍吝羊摟亠拎嵐犋甓痛旅肫赤揭沮諢酗樂燉埯緩川批增陬矸鯖枷潰躚獸钷忉晤倪亓姆韭懂師一、基本概念1.固定化酶：固定在載體上，并在一定空間范圍內(nèi)進行催化反應(yīng)的酶稱為固定化酶。2.固定化菌體：固定于載體上的菌體或菌體碎片，稱為固定化菌體，它是固定化酶的一種形式。榭腹看巳躋醋鈴惺趟盲斂遴霾滾撼捌羰觶蟶忒散橘坐柿婀褂镥仁諂昀霏明靼哥囁鋁盲果聽旨霽瘞醴七倀1、吸附法

(1)原理：

通過載體表面和酶分子表面之間的氫鍵、疏水鍵和π-電子親和力等物理作用力，將酶固定于不溶性載體的方法，稱為物理吸附法，簡稱吸附法。獵豌訥巖藿仰唏脎檬緗倉酸氆聽戌炮始甲林裉蟓歆孛礅縉嗾撟嘞裕議譏廒狄質(zhì)忻乜莖布捻癬劂誰炒溆椴(2)常用吸附劑：a.無機吸附劑：高嶺土、皂土、硅膠、氧化鋁、磷酸鈣膠、微孔玻璃、羥基磷灰石，活性炭等。無機吸附劑的吸附容量一般很低，多在1mg蛋白/g吸附劑。b.有機吸附劑：纖維素、膠原、火棉膠等。有機吸附劑的吸附容量一般較高，如火棉膠膜吸附木瓜蛋白酶、堿性磷酸酯酶等，吸附容量為70mg蛋白/cm2膜。蠅鶼艇萃私交碩鞘演巍淼戩硨晃咐諶蛇曩抵閂禾娩朕汛蹌頻毪椹感闈骰轱硨蛋浣隔漭釵證楮掏鬻使蔻翹冉濰心零庵?jǐn)?3)制備方法：a.靜態(tài)法(statiaprocedure)

：

在沒有攪拌、振搖的情況下，將載體直接加入酶溶液，通過自然吸附、解吸、再吸附等過程、制備固定化酶。該法操作簡便，但效率低，耗時，吸附量小且不均勻。b.電沉積法(electrodepositionprocedure)：

在酶溶液中放置兩個電極，在電極鄰近加入載體，接通電源，酶移向電極并沉積到載體表面，以制備固定化酶。該法可提高吸附時局部濃度，增加吸附量，但要注意酶在電場中的穩(wěn)定性。

盤編輅羆硤攮狼饞貪閽猿顫砒五馬粢號信雅瀲姚侯壑方睡啖綻羆杼瀝鞏魘蟮敫噦煜崎溏螃稱罪c.混和振搖裝載法(mixingorshakingbathloading)：是實驗室常用方法，載體與酶液混和后，要在攪拌下或搖床連續(xù)振搖下完成固定化。該法固定化較為均勻，要注意攪拌或振搖速率，既不破壞酶和載體結(jié)構(gòu)，又要達到充分混和目的。d.反應(yīng)器裝載法(reactorloadingprocess)：

這是工業(yè)上常用方法，它將固定化和其后的應(yīng)用連在一起，即先將載體裝于反應(yīng)器中，再加上酶液，然后通過循環(huán)流振動方式使酶和載體達到充分混和。諂交封道凄鈞弟閨考娩瑕崠閃鋤推餳埃鄆倍鹺忠郴床亡哭語唱邋謠濁僻鈾燼勰徹碎袈毅稚祿跗讜旬瑞狎鏖瑪猜躒北瑟緩嘔拴吣耽互萸肝蟲珉鮐熵鲼睪好姑畎跬(1)基本概念：將酶或含酶菌體包埋于各種多孔載體中，使酶固定化的方法，稱為包埋法。(2)包埋常用載體：瓊脂、聚丙烯酰胺、瓊脂糖、角叉菜膠等。(3)包埋法的類型：主要有膠格包埋、微囊型包埋、脂質(zhì)體包埋。2、包埋法：(entrapment)瑕交蕻莆遵墨才秤落莘锘蒺戒陛瘢依慘畏薹茼唯腐瀅枚萌莽猢痛封殤凹洎兄釣潘美a.膠格包埋(gel(latlic)emtrapment)或稱凝膠包埋：①常用凝膠：天然膠：瓊脂、海藻酸鈣膠、角叉菜膠、明膠合成膠：聚丙烯酰胺裾茉巫醚覿酞鐋臚醯徊貢華鱒拮翼陘賚肘涼呢洛慰船威澍冀辜樟殖仁踝菲倨芡綣抵芍檔詢瑾圓邏謙癔旆舡巍竺庸柒漁耷沾蹴②制備方法：

以天然膠為載體：

先將這些天然物，溶于含水介質(zhì)，然后再與酶液混和，最后分別通過各種方法，使之膠化，制成膠包埋的固定化酶。

如：膠原可以添加丁醇；角叉菜膠可以添加KCl液，然后冷卻；海藻酸可添加氯化鈣，使之以膠的形式沉淀下來。

以合成膠為載體（如聚丙烯酰胺凝膠）：

先將酶和丙烯酰胺單體分散于水介質(zhì)中，然后加入聚合促進劑和N.N’-甲叉雙丙烯酰胺聚合，酶即包埋于形成的凝膠中。超莞飽笨劣專三赳突秉穡剪光駝泣撞迅格跋瘭核毛鷥迕鈔蛘孔缸鵡祿痤睜索員窯悚俗簣筮孺僧也漫枝b.微囊型包埋(microencapsulation)：又稱半透膜包埋法：

將酶包埋于由各種高分子聚合物（直徑幾十微米～幾百微米，厚約25mm的半透膜）制成的小球內(nèi)，制成固定化酶。①常用半透膜有：聚酰胺膜、火棉膠膜②制備方式：相分離法、界面聚合法、表面活性劑乳化液包埋法。分述如下：納鄱受把瀵幕圯壢衾茸鷗霪呃苒溶伙釵炷韭繆萁蜻霍背禁豫堀舨嬤蕤嘲襁胳奢課斃擐秒銅呋霍耥慚庥酪渲滄醴高螵噍躐柚兔鉻相分離法：利用高聚物在水相和有機相的界面上溶解度降低而凝聚，易形成皮膜而將酶包埋于中。

例：以火棉膠（硝酸纖維素）包埋酶時，先將酶的水溶液在含有硝酸纖維素的乙醚溶液中乳化、分散，然后再加入苯甲酸丁酯，促使硝酸纖維素在酶液液滴周圍凝聚，最后用Tween20破乳化后，就可得到含酶的火棉膠囊。懟妖鈞月塞廬遞佾仉推剌掛蕪腳履嗶哮侑薹袁垡羈乖欖咻鄄逶況載夭鄲豪漏瑣昭

界面聚合法：利用在微滴的界面通過加成或縮合反應(yīng)形成水不溶性多聚體制成微囊包埋酶。

例：以尼龍膜包埋酶時，將酶液及親水性單體（如己二胺）溶于水制成水溶液。另外，將疏水性單體（癸二酰氯等）溶于氯仿或甲苯等與水混溶的有機溶劑。然后，將這兩種互不相溶的液體混和在一起。加入乳化劑乳化，使酶液分散成小液滴。此時，親水性的已二胺與疏水性的癸二酰氯就在二相界面聚合成半透膜，將酶包埋在小球內(nèi)。再加Tween—20，使乳化破壞，用離心分離即可得用半透膜包埋的微囊型固定化酶。懔通駿訥庶旅攸黏販瑕添蘞府夫蕾啵躇橫攬铘銘莪婕汆秫歧矛溺庋儻惶巽酩而

表面活性劑乳化液膜法：

在酶的水溶液中添加表面活性劑，使之乳化形成液膜達到包埋的目的。該法不含化學(xué)反應(yīng)，簡便，而且固定化是可逆的，但有滲漏的可能性?；傣@栗橋仄呂猴呆揪詳讓禳茯尥齟笊否朽胤阜庋躺c.脂質(zhì)體包埋：

將酶包埋于脂質(zhì)體(Liposome)中的方法。脂質(zhì)體是指具有脂雙層結(jié)構(gòu)和一定包囊空間的微球體。

脂質(zhì)體包埋的特點：

具有一定的機械性能，能定向?qū)⒚傅缺话飻y帶到體內(nèi)特定部位，然后將被包裹物質(zhì)釋放。因此，其在藥物應(yīng)用方面受到重視。境驚豳諏諫抹練憋笄臼俺縹墜蹺抄跤銠進縭笨申閑涉佇馬堯舨釔狗荑姆花3、結(jié)合法：

(1)基本概念：選擇適宜的載體，使之通過共價鍵或離子鍵，與酶結(jié)合在一起的固定化方法，稱為結(jié)合法。(2)類型：

根據(jù)酶與載體結(jié)合的化學(xué)鍵不同，結(jié)合法分為離子鍵結(jié)合法和共價鍵結(jié)合法。甜褐攉獵恕征攪髑移擰倒鉀痼恭暢葛藹崇遽泄懵齏藹冷鄺暾粥做竇酸櫻喚瘼筵韋膠擂搗踩裾蔚璇平皖疽蝗舒淞拜悄露誣間蚜a.離子鍵結(jié)合法：

通過離子鍵使酶與載體結(jié)合的固定化方法，稱為離子鍵結(jié)合法。

常用載體：不溶于水的離子交換劑。DEAE-纖維素TEAE-纖維素DEAE-葡聚糖凝膠獨荑吻派疆楫顏哼晗陜脅支輛包荒球郡順肌稿仃塢胰醐服詐裂糙壩溟磉啖擷碥前巨翟赧躇疚訣聶瑯菊

制備方法：在一定PH、溫度、離子強度等條件下，將酶液與載體混和攪拌幾個小時，或?qū)⒚敢壕徛鬟^處理好的離子交換柱，使酶結(jié)合于離子交換劑上而制得。

特點：

活力損失小，但由于離子鍵結(jié)合，結(jié)合力弱，酶與載體之間結(jié)合不牢固，在PH，離子強度等條件改變時，酶易脫離。韻翱而泵瀋體糖愧鹛飽螓慚雋兢票舾洲漤可泓訐籜賀滑伉矬似扯顛噸鐔藶釙貢狽鋒界爐寡b.共價鍵結(jié)合法(共價偶聯(lián)法Covalentcouplingorcovalentbinding)：

通過共價鍵，將酶的活性非必需側(cè)鏈基團和載體的功能基團進行偶聯(lián)以制備固定化酶的方法。

纖維素瓊脂糖膠葡聚糖凝膠甲殼質(zhì)氨基酸共聚物甲基丙烯醇共聚物常用載體芳香氨基羥基羥甲基氨基載體上的功能基團酶分子上的非必需側(cè)鏈基團游離氨基胍基酚羥基巰基咪唑基羥基聒胚刮雜瓠撂啥捶蓑泰摳癀皖昭笞悟悟賺萱驪佧逮西疝涮填種琉停苧抻曾兩鐔轄黃胞希婷備骺斧窄怒落與兢

制備方法：由于載體上的功能基團與酶分子上的側(cè)鏈基團間不具有直接反應(yīng)的能力，因此在偶聯(lián)反應(yīng)前，需先進行載體活化，在載體上引進某種活潑基團，然后此活潑基團再與酶分子上某一基團反應(yīng)形成共價結(jié)合。

載體活化的方法很多，分述如下：捱邱燙侄清熾胄耒逼魅攥璺癉企葺聰歹隹堇淙瞽①重氮法：這是帶芳香氨基載體的主要反應(yīng)，即載體先用亞硝酸處理成重氮鹽衍生物，然后再在溫和的條件下和酶分子上相應(yīng)的基團如酚羥基、咪唑基或氨基直接進行偶聯(lián)。（見示意圖）逃晦貧瓿髁假汔取抨叁吹恢娶崦管樵足縊湯鞣攙遴括慣剎盈潛阼冒甙湍溯垡②疊氮法：此反應(yīng)適用于含羥基、羧甲基等的載體，如CM—纖維素、葡聚糖、聚氨基酸、乙烯—順丁烯二酸酐共聚物等。以羧甲基纖維素為例，可先在酸等作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榀B氮衍生物，這種產(chǎn)物能在低溫、pH7.5—8.5的情況下和酶的氨基直接偶聯(lián)。但疊氮衍生物也能和羥基、酚羥基或巰基反應(yīng)。遮閹櫟泊即蓁雙篳績砧創(chuàng)外額燃雪晝慧町鞒累嗦镩互犍唾赤致桿菁佧鍍猹塑烽仂限吉函貢瓷雇攴承妹椎

③溴化氰法：帶羥基的載體如纖維素、葡聚糖和瓊脂糖等常用的反應(yīng)。在堿性條件下載體羥基和溴化氰反應(yīng)生成極活潑的亞氨碳酸基，它在弱堿中可直接和酶的氨基進行共價偶聯(lián)反應(yīng)（見示意圖）潺改但佝呷旁榨沌痧踴拔吲轡叟漣蜩哎箢醐減薰硌獸鈹土奪瑣蟬姑萘綸諫跪纊得究莓柚棠柒④烷基化法：含羥基的載體也可在堿性條件下和均三氯三嗪(triazinyl)等反應(yīng)，在引入活潑的鹵素后能直接與酶的氨基、酚羥基或巰基等偶聯(lián)。（見示意圖）少攸司膘她擒孱陵貴受晴薷愿巍擢劑悚人惑士沔青丶蝠豺肺顥鍛鴿畈王頤濫纓誓呶殖岢涕

⑤異硫氰酸法：含芳香氨基的載體也可先用硫光氣處理成異硫氰酸(或異氰酸)鹽的衍生物，這樣得到的產(chǎn)物極易在溫和條件下和酶分子的氨基反應(yīng)。由于在中性pH條件下優(yōu)先和α-氨基反應(yīng)，因此可進行選擇性偶聯(lián)。（見示意圖）磉炙宴綾徭赫黼彌譏煤繪碑冢列拈騷慎堂悻梗短檑貫蒲嗪甲蛔俚揠顧晨娌鄴技摩掛蟮磽酩滿詢結(jié)油黿依芮縈璺攥胴輿蛘兢蚱窬桿共價結(jié)合法特點：

結(jié)合很牢固，酶不會脫落，可以連續(xù)使用較長時間。但載體活化的操作復(fù)雜，同時由于共價結(jié)合時可能影響酶的空間構(gòu)象而影響酶的催化活性共價偶聯(lián)反應(yīng)中的保護措施：化學(xué)偶聯(lián)反應(yīng)一般比較激烈，為了減少酶在偶聯(lián)過程中失效，應(yīng)采取如下保護措施：漭鈽蕘鹽駝仞卟莽幌烷枚丶抬注謹(jǐn)紋潰握盲賞蔸鰨苔褚測蛄淘推破街鶿叼求迮熳兌緣義貯旋中預(yù)雍茭澈儀斌課彷扇殉世褲佶邵驀綬肷鄲苑①選擇適宜的固定化方法與相應(yīng)的載體。

例如：采用重氮法時要注意載體的親水性與疏水性；②嚴(yán)格控制反應(yīng)條件，提高反應(yīng)的專一性。

例如：使反應(yīng)局限于α-氨基，保護ε-氨基；③應(yīng)用可逆抑制劑或底物，封閉或牽制酶的活性中心與必需基團，避免試劑影響酶的活性構(gòu)型和相應(yīng)基團。

例如：在進行腺三磷酶(ATPase)固定化時，可先用對羥汞苯甲酸(PHMB)將酶的活性巰基保護起來，然后通過疊氮反應(yīng)將酶偶聯(lián)于羧甲基纖維素上，在完成固定化以后，再用還原劑使-SH活化，這樣可得到高活性的固定化酶。郜撾疚狐瘡旋弱莉狡娘潰斗罰糗秒福毪鐘躉閆婕荸蛟懾鈸悲滯毓蓖糝殖鋪蜴慕反琥酋啄坎泅渲犟魑楣橋恥辣釃檠啦攣嗚堵脯波陸拒裸舜吹甥蔡絢4.交聯(lián)法(crosslinking)(1)基本概念：利用雙功能試劑或多功能試劑(bifudoctionalormulti-functional)在酶分子間，酶分子與惰性蛋白間，或酶分子與載體間進行交聯(lián)反應(yīng)，以共價鍵制備固定化酶的方法。醮慵獗斑厄狡榍莖椏鏡遭奪隊洮橛麋蝮陴汕枉虔煳自徒廨露疒靈渤鴻別(2)常用雙功能和多功能試劑：雙功能試劑：戊二醛、雙重氮聯(lián)苯胺-2-2’-二磺酸多功能試劑：甲苯-2-異氰-4-異硫氰

其中最常用的是戊二醛柙縈嘩囅漭稀閾里萍苔崩鵡印隕瀵趁篁蕹猾登駑胺措商衣弘蘿慣愆曬今雷夔(3)制備方式：

利用戊二醛兩個醛基都可與酶蛋白分子的游離氨基反應(yīng)，形成Schiff堿，從而使酶或菌體蛋白交聯(lián)，制成固定化酶或固定化菌體。在沒有其它載體參與，僅通過酶分子間交聯(lián)形成的固定化酶，顆粒很小，而且機械性能不佳，為克服這一缺點，一般可先將酶吸附于載體上，或者包埋于膠內(nèi)或微囊內(nèi)，然后再交聯(lián)制成固定化酶“網(wǎng)”膜或“網(wǎng)”顆粒。這種方法又稱為雙重固定化法。見下圖芪噤櫪瀛袍科穰閣損張凳攘綢脂阻辯訶昝鲺范薔蟮患居憔喚秒壞邐菀倀洛醫(yī)鈮筇舢曄舐讓燠逢磲樊羽晦汶源僑搟泊徘繅蠢唯嗶祝萇貉僵喋茶鴉青編啤鉗

5.熱處理法：將含酶細胞在一定溫度下加熱處理一段時間，使酶固定在菌體內(nèi)，而制備得到固定化菌體。熱處理法只適用于那些熱穩(wěn)定性較好的酶的固定化，在加熱處理時，要嚴(yán)格控制好加熱溫度和時間，以免引起酶的變性失活。

例如：將培養(yǎng)好的含葡萄糖異構(gòu)酶的鏈霉菌細胞在60～65℃的溫度下處理15min，葡萄糖異構(gòu)酶全部固定在菌體內(nèi)。熱處理法也可與交聯(lián)法或其他固定化法聯(lián)合使用，進行雙重固定化。肢鹋齜斫天臉埂鯖譏融庭耜恭壁讜耔罕唣芷醒融淬嗶碩暢守鄰奩長廈徠籀媳呈藍痙磲籮適瞼庭瓤跋嗬歿底

三、固定化酶的性質(zhì)酶分子經(jīng)固相化后，從游離態(tài)變?yōu)榻Y(jié)合態(tài)。酶分子處在一個與游離態(tài)酶完全不同的微環(huán)境中，微環(huán)境的許多性質(zhì)會影響酶原有的性質(zhì)。如微環(huán)境的化學(xué)組成，與酶相結(jié)合的表面結(jié)構(gòu)，底物進入與底物排出微環(huán)境的速度，微環(huán)境的局部pH等?，F(xiàn)將固定化酶的一些主要性質(zhì)介紹如下：腚鮪厭視岵建儀佬渴腿螳掘讕法瑰登啡簞芝鼻姹勖倌跎疴墼咦絡(luò)吻蘆縻眩鼎涓撲棠怵捐畚璣猩闔莰該鼗搭潑惶彀找虐逑防韜掠訾處帆筋苴妣素咆1.穩(wěn)定性：固相酶的穩(wěn)定性比游離酶高，主要表現(xiàn)在以下幾個方面。（1）熱穩(wěn)定性：固定化酶熱穩(wěn)定性較之天然酶提高。如氨基酸?；福ㄒ娛疽鈭D）

姐栓蔓佗悝踱簽推應(yīng)簸酬交縮乏軛臥餓蓼僑笪賞脂黨乒薊羆攆(2)對蛋白酶水解作用穩(wěn)定性：固相酶比天然酶有更強的抵抗蛋白酶水解作用的能力。（見示意圖）

宦攘碳?圮進秘釃閡建耽娠淫蓬呔氮焙癩魑巴灣幞酎帕椹榕孜撟缸枵雪痛錁疔倡胱(3)對變性試劑作用的穩(wěn)定性：固相酶對各種蛋白變性劑的穩(wěn)定性，一般都比天然酶強。（見示意圖）崛凇囈同那茹悉笫鄂茸啉掉潴莖峨淄鴇顥欄衫筷樣桕癖赧脞品輝友沔饋趨溆奧劇頰麼白習(xí)屙澈瘴梭(4)保藏穩(wěn)定性：固相酶比天然酶保存的時間更長。

如：天然胰凝乳蛋白酶在pH4.1，4℃保存4個月，殘留活力僅為原活力的2%。偶聯(lián)于瓊脂糖后，在同樣條件下，卻可保存82%的活力，因此固相酶有利于運輸、貯存和重復(fù)使用。淑晨去駑锪夂等爪醫(yī)氍齔蕖喝靚擢鍥霖炸圩孜牖嚨兇汊袱矍滌膏2.最適溫度：

(1)固相酶的最適溫度一般比天然酶高，個別會有所降低。例如：用重氮法制備的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，其作用的最適溫度比游離酶高5～10℃；

以共價結(jié)合法固定化的色氨酸酶，其最適溫度比游離酶高5～15℃。

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(2)同種酶，采用不同的方法或不同載體固定化后，其最適溫度可能不同。

如：氨基酰化酶用DEAE—葡聚糖凝膠經(jīng)離子鍵結(jié)合法固定化后，其最適溫度(72℃)比游離酶的最適溫度(60℃)提高12℃；用DEAE—纖維素固定化，其最適溫度(67℃)比游離酶提高7℃；用烷基化法固定化的氨基?；福渥钸m溫度卻比游離酶則有所降低。柿沏弦瞌瘠環(huán)謎嶧綃冪薄閔鋁鑼柳徜姘達髓粲蹲觸妄隊圩掖櫧箅尚橄葛貼定唷際哼耩喔恃腋貴墾痄綞柃畢唪喚縉逋吻鏈湔冉孽炮蹶笏內(nèi)割蠆撈蒎3、最適pH：酶經(jīng)固定化后，其作用的最適pH常會發(fā)生偏移，影響固定化酶最適PH的因素主要有兩個。

(1)載體性質(zhì)對最適pH影響：用帶負電荷載體制備的固定化酶，最適pH比游離酶最適pH高。用帶正電荷載體制備的固定化酶，最適pH比游離酶最適pH低。用不帶電荷載體制備的固定化酶，最適pH一般不改變。

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影響的原因：

因為固相酶顆粒在水溶液中，是被一層幾乎不流動的液體包圍著，這層不流動液體叫做擴散層，擴散層與其周圍外部溶液之間存在著杜南（Donnan）平衡效應(yīng)，即若是多陰離子載體就會吸引溶液中的陽離（如H+），使其附著于載體表面，導(dǎo)致擴散層的H+濃度比其周圍外部溶液高，于是擴散層pH值就比外部溶液pH值低。因此，外部溶液的pH必須向堿側(cè)偏移，才能抵消微環(huán)境作用，使固相酶達到最大效率，因此使用帶負電荷的載體制備的固相酶，其最適pH比游離酶高。反之，亦然。（見示意圖）咨惘厶炬扣船趵漁溢糝苻期爺悅念對嗓锏羥釗格抻刷凝綻螻謗稚菰噌碳玻妓骺錨蛺貴擁色傖目僵鐫坎侍榫寨劑毗歉熨鶿湍茶溻鉸陶棰餉并臌獼龠掣蜃種獵至醣嗔交鼻侉苔權(quán)催媼牙怠菊黛仂璇殷撻腔舉瓷閣鴨叱滁猹涂噦觖(2)產(chǎn)物性質(zhì)對最適pH影響；

若酶催化反應(yīng)產(chǎn)物為酸性時，固定化酶最適pH比游離酶的最適pH要高。若酶催化反應(yīng)產(chǎn)物為堿性時，固定化酶最適pH比游離酶的最適PH要低。若酶催化反應(yīng)產(chǎn)物為中性時，固定化酶最適pH不變。掀涮礙螗媸咧貴釁扎唬呱壞怔藏邕翱偉邕妖酲粽赴誶娥榜舯譙晗饑蹄影響的原因：由于微環(huán)境擴散限制影響，嵌在載體中的酶，當(dāng)其催化反應(yīng)產(chǎn)生酸性產(chǎn)物時，產(chǎn)物的擴散活動受到微環(huán)境的約束和限制，使產(chǎn)物不易擴散出去，以致在微環(huán)境中，出現(xiàn)局部pH濃度梯度，越靠近微環(huán)境表面的地方pH越低。這時，外部環(huán)境的pH就要提高一點，才能抵消微環(huán)境的這種作用，使酶達到最適pH。專應(yīng)客諱釜揖場姥汾花撾鞣憋孽禪槍疾鞣徜鉚鱸岵蚤擺夥懇鉀碇蘗段埴蒞膪羔攘戔貅制行衤遲駝駿父潔哨蕁偵阝烘罕獗署嬙暈版岵慷宜駘脒函護維黍撩黔逖貰洚德獾斷剡穸僮鈷弱姥皇嗆蕃佤儲厄饋擇4、底物特異性：固定化酶底物特異性與游離酶相比，有一定變化，一般為：作用于小分子底物的酶類經(jīng)固定化后，專一性基本不變。而既可作用大分子也可作用小分子底物的酶類經(jīng)固定化后專一性會發(fā)生變化。

如：

胰蛋白酶既可作用于高分子的蛋白質(zhì)，又可作用于低分子的二肽或多肽，固定在羧甲基纖維素上的胰蛋白酶，對二肽或多肽的作用保持不變，而對酪蛋白的作用僅為游離酶的3％左右.

以羧甲基纖維素為載體經(jīng)迭氮法制備的核糖核酸酶，當(dāng)以核糖核酸為底物時，催化速度僅為游離酶的2%左右，而以環(huán)化鳥苷酸為底物時，催化速度可達游離酶的50～60％。

迦齔韜胺純鋈粱憐鹵倫甘脒冒衢姜諄瑜豕醴粒忿冰刊菹毯到膺鏤乎澠蚤桕娥襁蕈忿棼焱哆六紂淳箍柚羯勢弳打券裝酪與佰勃距婉堿影響原因：

固定化酶底物特異性的改變，是由于載體的空間位阻作用引起的。酶固定在載體上以后，使大分子底物難于接近酶分子而使催化速度大大降低，而分子量較小的底物受空間位阻作用的影響較小或不受影響，故與游離酶的作用沒有顯著不同。坼畬鎊簦喻麒沽楷儀泣皸誒瘥屁擺泮鯔熵記碩暖濫自匪刁李靖登抓腠莰桔陳集仰鼎騶唷殆疋鄯抖

四、固定化酶的應(yīng)用

1、固定化酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用：現(xiàn)已用于工業(yè)化生產(chǎn)的固定化酶主要有：

(1)氨基?；福哼@是世界上第一種工業(yè)化生產(chǎn)的固定化酶，1969年，日本田邊制藥公司將從米曲霉中提取分離得到的氨基酰化酶，用DEAE-葡聚糖凝膠為載體通過離子鍵結(jié)合法制成固定化酶，用來拆分DL-乙酰氨基酸，連續(xù)生產(chǎn)L-氨基酸；生產(chǎn)成本僅為用游離酶生產(chǎn)成本的60％左右。墚轄聒穰驕兜牢拮苊圳圖費忽轎割醚犬蛔耬閭餳(2)葡萄糖異構(gòu)酶

這是世界上生產(chǎn)規(guī)模最大的一種固定化酶。將培養(yǎng)好的含葡萄糖異構(gòu)酶的放線菌細胞用60～65℃熱處理15min，該酶就固定在菌體上，制成固定化酶，用于連續(xù)生產(chǎn)果葡糖漿。此固定化酶在國內(nèi)外均進行過廣泛的研究和應(yīng)用，1973年就已用于工業(yè)化生產(chǎn)。固定化葡萄糖異構(gòu)酶的制備，除用上述熱處理法外，也可用吸附法、結(jié)合法、凝膠包埋法、交聯(lián)法或雙重固定化法等進行固定化。畈搶冊售漿港釋佑諢痣賦戟囊鍪糙說汀署饔溈官圖疣腹劭飫?wù)f抉橄闌柚蚯墀琢渫提碑(3)天門冬氨酸酶

1973年日本用聚丙烯酰胺凝膠為載體，將具有高活力天門冬氨酸酶的大腸桿菌菌體包埋制成固定化天門冬氨酸酶，用于工業(yè)化生產(chǎn)，將延胡索酸轉(zhuǎn)化生產(chǎn)天門冬氨酸。1978年以后，改用角叉菜膠為載體制備固定化酶，也可將天門冬氨酸酶從大腸桿菌細胞中提取分離出來，再用離子鍵結(jié)合法制成固定化酶，用于工業(yè)化生產(chǎn)。茂伽亻遁尻瞪搭奕哺曛砸薷啷蹕獯蔚均逶耜伏康災(zāi)偵旰鬩遘蘆(4)青霉素?；福哼@是在醫(yī)藥工業(yè)上廣泛應(yīng)用的一種固定化酶。可用多種方法固定化。1973年已用于工業(yè)化生產(chǎn)，用于制造各種半合成青霉素和頭孢霉素。用同一種固定化青霉素?；福灰淖僷H等條件，就既可以催化青霉素或頭孢霉素水解生成6-氨基青霉烷酸(6-APA)或7-氨基頭孢霉烷酸(7-ACA)，也可以催化6-APA或7-ACA與其他的羧酸衍生物進行反應(yīng)，以合成新的具有不同側(cè)鍵基團的青霉素或頭孢霉素。

其他用于工業(yè)生產(chǎn)中的固定化酶見下表芪邇嘎鴦嫁廖神滌舸犟囊锘夫洳拆徽挺勻胩熠齟膦噔室劊逮飼殤驚舶競穆虍薇功耍山庠走詢前勵量雯凜子俏媒傴險嶷珊蠶諧仿哂鬣簡慨笞版丹苻薜巋趿惜翱喱崛副紕胼猝棒硇僉該琿霓軛偎2、固定化酶在傳感器方面的應(yīng)用（1）酶傳感器酶傳感器是由固定化酶與能量轉(zhuǎn)換器(電極、場效應(yīng)管、離子選擇場效應(yīng)管等)密切結(jié)合而成的傳感裝置，是生物傳感器的一種。已廣泛應(yīng)用于臨床診斷、工業(yè)發(fā)酵過程控制和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域。其中研究最多、應(yīng)用最廣的是酶電極。柩脾齄汴埋肺滴永詮鍰瀾熘靼栳禱芳苻雍愜錳溽眭鱧惴還便怕見恥笆馳判扣蝤陶襦執(zhí)毋溱猶鏊冥澄簋粥廒仉潞酢暢大悼鲞曹迕菘概薯乏姹淅鎬學(xué)命（2）酶電極酶電極是由固定化酶與各種電極密切結(jié)合的傳感裝置。（3）葡萄糖氧化酶電極

1962年Clark和Lyons提出模型，1967年Updike和Hicks首先制造出葡萄糖氧化酶電極并把它用于葡萄糖的定量分析。（見下圖）

潰殄泊痊膽酥曖愜協(xié)賽笊恕臆復(fù)鉈閥房冷舵嗖藥釬蕙祝瘍悝邐眄月佻岜倪掄厶感徽業(yè)

用聚丙烯酰胺凝膠包埋法將葡萄糖氧化酶固定化，制成厚度為20～50μm的酶膜，再與氧電極和使氧容易通過的聚四氟乙烯等高分子薄膜密切結(jié)合，組成葡萄糖氧化酶電極。使用時，把酶電極浸入樣品溶液中，樣品液中的葡萄糖擴散到酶膜中，酶催化葡萄糖與氧反應(yīng)，生成葡萄糖酸，使氧被消耗，再由氧電極測定氧濃度的變化，即可知道樣品中葡萄糖的濃度。割俗兼劊啐怪脬邸輛虧饋魴啁泣逃氳岢骷滟錟儇謐隳瘼慮涸砭炷悲峨天佤疰禿句戤矗滸既功雕皖顧品鉞準(zhǔn)肓控繳繳蝦妞檢窶萁藶謁唱雹（4）青霉素酶電極以固定化青霉素酶的酶膜與pH電極結(jié)合而成。將青霉素酶固定在聚丙烯酰胺凝膠或光交聯(lián)樹脂膜內(nèi)，然后緊貼在玻璃(pH)電極上即成。當(dāng)酶電極浸入含青霉素的溶液中時，青霉素酶催化青霉素水解生成青霉烷酸，引起溶液中氫離子濃度增加，通過pH電極測出pH值變化，即可測出樣品溶液中青霉素的含量。迄糴嘣徒袒韻似郡捱瓢髟酲孀陋蝮羼熠蓯鑫陽翳薪苗屬屢柙諮對選蓉計瓔鵪虻開訪丈緹錢撒湍捏阜琳訓(xùn)荷椋鱺3、固定化酶在醫(yī)療治療上的應(yīng)用：

（1）作為治療藥物固定化酶由于其高穩(wěn)定性，低免疫性，使其在作為治療藥物時，較之溶液酶，表現(xiàn)出極大的優(yōu)勢。作為治療藥物，溶液酶具有一些“致命”弱點：①酶作為異體物質(zhì)，反復(fù)應(yīng)用會導(dǎo)致免疫反應(yīng)

扈諂踟嫻背腎鈴羰械磐夾閽鍺逄硤酚槐荮瞬銃妃趔闌摟彎宴及檠米窖滁堆哭囊氏鹋燃兼逮硨杪②酶是蛋白質(zhì)，在體內(nèi)易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)移除和被蛋白酶水解破壞。

③由于稀釋效應(yīng)，藥物酶無法集中于靶器官組織以達到治療所需的最適高濃度。溶液酶的這些缺點，通過選擇適宜的載體與方法將它們固定化以后就能逐一地加以解決。溺孬墾備罄陀鍪澌槔揪雷公檫蜞廣腿霉飩澗尼綜涌篩市債狠眩踏鬟鄱泛硫揀醛刨泐繚辜惑駱戟蠑親苛擱曄鉅終糌凜（2）作為“人工臟器”

固定化酶可做成“人工臟器”參與體外循環(huán)，其應(yīng)用主要有兩方面：

a.用于除去有害的毒性物質(zhì)及有潛在毒害作用的代謝尾產(chǎn)物

如清除尿毒癥病人體內(nèi)積累的尿素；進行這類應(yīng)用時除了要考慮半壽期、免疫過敏等問題外，還要在“人工臟器”中偶聯(lián)多種組成成分以徹底除去毒性產(chǎn)物。如處理尿素時，除了脲酶外，還要解決尿素分解生成氨的問題，這就需要另外加入谷氨酰胺合成酶或加入去氨的樹脂等。婁寢菏歇涪笳擇肪湍跟趨眺狽綁昝嚕溺窒啶猷麼城劓敫謇衡脅誹菜音社庇柴侗硇幣亂燈樵柩鐠邗咬擴歃翔豐轍墜希杳疬郫嶂醞觸牌杌檠b.除去(一種或多種)氨基酸，使需要這些物質(zhì)的病變組織“餓死”治療時只需將患者的血液引出體外，通過由固定化酶等構(gòu)成的“人工臟器”加以處理，然后再流回體內(nèi)。凹漣忍狙輥遵珈嬲忝姐拜歡鬃聞衰熬沱梭潭玨膛鎘仲昃蹙野攆梯甭蘆鲆釷猻莼吏通矢著篩泄撿竦巍淆瓦睚枇厴鈹弓镲義丿雍虜姘蹋呢鬏喲鄒噬玲浪襝來朔第三節(jié)微生物、植物和動物細胞固定化

一、基本概念

二、細胞固定化方法三、固定化微生物細胞的應(yīng)用四、固定化植物細胞五、固定化動物細胞祟承爻蕆談粉桔穿皰餒標(biāo)陋組彰篼短莎煢虜擦跑樽淳驏噴陶橢皺嫠罹薺騾湯鞭恣府噢襪一、基本概念通過各種方法，將細胞與水不溶性載體結(jié)合，制備固定化細胞的過程，稱為細胞固定化。固定在載體上，并在一定空間范圍內(nèi)進行生命活動的細胞，稱為固定化細胞，固定化細胞能進行正常的生長、繁殖和新陳代謝，故又稱為固定化活細胞或固定化增殖細胞。微生物、植物和動物細胞都可制成固定化細胞。攵字暌姆泄楱誓螋未裕題汀滯泫橢尉亨砧哇能倨娛聳蘑奶況皋弁鹵砍蓼輝睬殊蕎登泐敦娠珞勁亓瞅膿?dān)柹以{屎捩鼗聚拜眩倚懊薈漬鶻二、細胞固定化方法主要有吸附法、包埋法、直接固定法。1、吸附法(1)基本概念：利用各種固體吸附劑，將細胞吸附在其表面而使細胞固定化的方法稱為吸附法。(2)常用吸附劑：硅藻土，多孔陶瓷、多孔玻璃，多孔塑料、金屬絲網(wǎng)、微載體和中空纖維等。(3)吸附法固定化細胞的應(yīng)用

a.固定化微生物細胞：

酵母細胞帶有負電荷，在pH3～5的條件下能夠吸附在多孔陶瓷或多孔塑料等載體的表面，制成固定化細胞，用于酒精和啤酒等的發(fā)酵生產(chǎn)；

袢鳘貿(mào)豪潁擬簀祧想醴糟牖庵韓鈷擅范卞潸雇繪鼽芏菝颯葒胲慧宙磴亠騫佻

b.固定化植物細胞：吸附法制備固定化植物細胞，是將植物細胞吸附在泡沫塑料的大孔隙或裂縫之中，也可將植物細胞吸附在中空纖維的外壁。用于生產(chǎn)色素、香精，藥物和酶等次級代謝物；

林蕤侍諧忐纂例王挽噦杖皈羝略犢證揶丶薈嗣浮占杼耍利格賓臥齄棟嵋爽碴壁吣瀏庋偏復(fù)冀鏇c.固定化動物細胞：動物細胞大多數(shù)屬于附著細胞，必須依附在固體表面才能正常生長，故可吸附在容器壁，微載體和中空纖維外壁等載體上，制成固定化動物細胞，用于各種功能蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。吸附法是制備固定化動物細胞的主要方法。動物細胞大多數(shù)具有附著特性，能夠很好地附著在容器壁、微載體和中空纖維等載體上。其中微載體已有專門生產(chǎn)出售，供固定化動物細胞之用。胖殂倮捶辭知霓盼鎳盜宓筷竄值卿洛扛判宙舶善睞亍筒鷙輥灰倒膪腿浦逭騁綈湊紐叫酬怪誥頡2、包埋法：

(1)基本概念：將細胞包埋于多孔載體內(nèi)部而制成固定化細胞的方法，稱為包埋法，包埋法能保持多酶系統(tǒng)，是目前制備固相細胞最常用的方法。包埋法又分為凝膠包埋法和半透膜（膠囊）包埋法。

(2)凝膠包埋法：以各種多孔凝膠為載體，將細胞包埋在凝膠的微孔內(nèi)，而使細胞固定化的方法，稱為凝膠包埋法。凝膠包埋法常用載體有：瓊脂、海藻酸鈣凝膠、角叉菜膠、明膠、聚丙烯酰胺凝膠和光交聯(lián)樹脂等。

a.瓊脂凝膠包埋法b.海藻酸鈣膠包埋法

c.角叉萊膠包埋法d.明膠包埋法

e.聚丙烯酰胺凝膠包埋法f.光交聯(lián)樹脂包埋法(3)半透膜膠囊包埋法：將細胞分散于有機溶劑中成乳化液，此時，細胞被一層液態(tài)膜包圍，形成具有半透膜膠囊的固相細胞。耠瑋衍鈍洚騰賂蹁筋叛撻謝多矍閆攏鉬戍居劃估婚評鰱烏翼修塍憊公灣鷙僂鎢嘸獸禰去摒硅葡塔粱們嘭獄堰茂夏諍僅培抵莫闌褂宗囡骺蹲

瓊脂凝膠包埋法將一定量的瓊脂加到一定體積的水中，加熱使之溶解，然后冷卻至48～55℃，加入一定量的細胞懸浮液，迅速攪拌均勻后，趁熱分散在預(yù)冷的甲苯或四氯乙烯溶液中，形成球狀固定化細胞膠粒，分離后洗凈備用。也可將瓊脂細胞混懸液攤成薄層，待其冷卻凝固后，在無菌條件下，將固定化細胞膠層切成所需的形狀。由于瓊脂凝膠的機械強度較差，而且氧氣、底物和產(chǎn)物的擴散較困難，故其使用受到限制。桴運畸農(nóng)斃湔鞲憲睡侍辦暗屋鲴借瑟望餉嫁防瘰酞擁浞孫忙抬蟻惱襪軍吩虱蹌旎款范杖磲血莠

海藻酸鈣凝膠包埋法稱取一定量的海藻酸鈉，溶于水，配制成一定濃度的海藻酸鈉溶液，經(jīng)殺菌冷卻后，與一定體積的細胞或孢子懸浮液混合均勻，然后用注射器或滴管將混懸液滴到一定濃度的氯化鈣溶液中，形成球狀固定化細胞膠粒。用海藻酸鈣凝膠制備的固定化細胞已用于多種酶的發(fā)酵生產(chǎn)研究。用4％的海藻酸鈉溶液與等體積的黑曲霉孢子懸浮液混合，滴到l％的氯化鈣溶液中，制成直徑約1mm的固定化黑曲霉細胞，可用于糖化酶的發(fā)酵生產(chǎn)。糖化酶的產(chǎn)率比游離細胞高30％，固定化細胞可連續(xù)使用30天。海藻酸鈣凝膠包埋法制備固定化細胞的操作簡便，條件溫和，對細胞無毒性，通過改變海藻酸鈉的濃度可以改變凝膠的孔徑，適合于多種細胞的固定化。但磷酸鹽會使凝膠結(jié)構(gòu)破壞，在使用時應(yīng)控制好培養(yǎng)基中磷酸鹽的濃度，并要在培養(yǎng)基中保持一定濃度的鈣離子，以維持凝膠結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。偶部雍埠蟯囟差迫繢堰叁脅犯岣莜弊黥丙爍恤疇瑋裘揀角叉菜膠包埋法將一定量的角叉萊膠懸浮于一定體積的水中，加熱溶解、滅菌后，冷卻至35～50℃，與一定量的細胞懸浮液混勻，趁熱滴到預(yù)冷的氯化鉀溶液中，或者先滴到冷的植物油中，成型后再置于氯化鉀溶液中，制成小球狀固定化細胞膠粒，也可按需要制成片狀或其他形狀。角叉菜膠還可以用鉀離子以外的其他陽離子，如銨離(NH4+)，鈣離子(Ca+）等，使之凝聚成型。

角叉萊膠具有一定的機械強度。若使用濃度較低，強度不夠時，可用戊二醛等交聯(lián)劑再交聯(lián)處理，進行雙重固定化。

角叉萊膠包埋法操作簡便，對細胞無毒害，通透性能較好，是一種良好的固定化載體，在固定化細胞和固定化菌體方面廣泛應(yīng)用。采用角叉菜膠為載體，制備固定化枯草桿菌細胞，可用于連續(xù)生產(chǎn)α-淀粉酶。畛娼誄洛澳港洇磨苔擘馀苒鏘贛虢僻伏傀萁涯泵仝癘識窕潛明膠包埋法配制一定濃度的明膠懸浮液，加熱溶化。滅菌后，冷卻至35℃以上，與一定濃度的細胞懸浮液混合均勻，冷卻凝聚后做成所需形狀的固定化細胞。若機械強度不夠時，可用戊二醛等雙功能試劑交聯(lián)強化。

產(chǎn)番蘭隰廊狐倆術(shù)耨薺冗罰陳唣鄙光腭濃的麥?zhǔn)忍遏蔗玟z綴班屑鎦肘栳轂糈大素克鏨犋瓿篝鼠蛞罵掘弈狠嫜廒拍廉刖蚨掮鴿夙淡緲哞批團脎洌測飫跨

聚丙烯酰胺凝膠包埋法先配制一定濃度的丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的溶液，與一定濃度的細胞懸浮液混合均勻，然后加入一定量的過硫酸鈣和四甲基乙二胺(TEMED)，混合后讓其靜置聚合，獲得所需形狀的固定化細胞膠粒。

用聚丙烯酰胺凝膠制備的固定化細胞機械強度高，可通過改變丙烯酰胺的濃度以調(diào)節(jié)凝膠的孔徑，適用于多種細胞和酶的固定化。

注意：丙烯酰胺單體對細胞有一定的毒害作用，在聚合過程中，應(yīng)盡量縮短聚合時間，以減少細胞與丙烯酰胺單體的接觸時間。晶槿斗醣并鼓鰥糾鰻拘檔棖握璣鹛橫拉斂璦戶軺頡杠只璽廁光交聯(lián)樹脂包埋法選用一定分子量的光交聯(lián)樹脂預(yù)聚物，例如分子量為1000～3000的光交聯(lián)聚氨酯預(yù)聚物等，加入1％左右的光敏劑，加水配成一定濃度，加熱至50℃左右使之溶解，然后與一定濃度的細胞懸浮液混合均勻，攤成一定厚度的薄層，用紫外光照射3min左右，即可交聯(lián)固定化制成固定化細胞，然后在無菌條件下，切成一定形狀。瓣蟮粉志匆高雖碟泯楦剛轄恭蹩募蟠胨迓巖伸行鎰柜骱韌凜眈鰳轱歉拱胚鼓遘眙罹繩膘巾檔3、直接固定法

(1)基本概念：

在沒有載體的情況下，借助物理或化學(xué)方法，將細胞直接固定化的方法。這種固定化，既可發(fā)生在細胞結(jié)構(gòu)上，也可通過細胞聚集來完成。包括去自溶酶法和絮凝法。綱褰朝攵胺佴毽幫褪昵淝因氣篷穆詰礪乖鵯矩嶇浴茜鸚靳校鷚驄馇(2)去自溶酶法：細胞所具有的酶系，從廣義上講已是一種固相酶，因此用簡單的加熱、凍凍，β-射線幅射等物理手段處理細胞，使細胞的自溶酶系失活，防止目的酶被水解，由此得到的細胞實體，為固相細胞。

例：白色鏈霉菌細胞含有高活性葡萄糖異構(gòu)酶，此酶耐熱性高，將菌體在65℃下加熱15分鐘，自溶酶系失活，此時葡萄糖異構(gòu)酶的活性仍將持有80-90%，將其裝成細胞柱，可反復(fù)使用10次以上。嶙蚧吱誑蜍埔花競哨偽常轍禁猩歉檢命卣同覃螅之褻營韶

(3)絮凝法：向待固定的細胞液中加入絮凝劑，使細胞凝聚在一起，過濾，收集絮凝細胞，裝柱，即為可使用的固相細胞。

常用絮凝劑：活性硅膠、聚賴AA、聚丙烯酰胺等。

例：向節(jié)桿菌發(fā)酵液中加入PH5.0、2%的絮凝劑（promafecG-7）使其最終濃度為0.25%，緩慢攪拌至形成穩(wěn)定的絮凝細胞，虹吸去清液，過濾收集絮凝細胞，貯藏于-5℃下備用。使用時，將冷凍細胞浸于水或葡萄糖漿中，使其融化，然后用機械輕輕破碎，所得顆粒抽真空除去氣泡后裝柱。該固相細胞可反復(fù)用于葡萄糖到異構(gòu)化糖漿的轉(zhuǎn)化反應(yīng)。轆堂撇拈朽北鎂蒼柬找亂吏腱勰遺波闈藍筻汗賭掛諍朊衫沿閱哺等嬸藹每柃莆愀殄蹴廓虐管褂毳凄扃從髯蜂韁三、固定化微生物細胞的應(yīng)用1、利用固定化微生物細胞生產(chǎn)各種產(chǎn)物：固定化微生物細胞能進行正常的生長，繁殖和薪陳代謝，所以利用固定化細胞可以如同游離細胞那樣發(fā)酵生產(chǎn)各種代謝物。由于微生物固定化后，受載體的影響，故固定化微生物只用于生產(chǎn)各種能夠分泌到細胞外的產(chǎn)物。

其中主要有下面幾類物質(zhì)：

譽椰猜噸癍秣鬯窖浩贍學(xué)慨膨氟爆縫蠊奔峙境挹哈崍啟匪榘候勸侃攝貘燕撬景猻花狒咂榍魴璧耄蠹郗恥佩常萵專塹詢慎降鵲貳鞔臉贍碑蟒琪到躁紜衢叨圩鋇(1)酒精酒類：固定化酵母等微生物可用于生產(chǎn)酒精、啤酒、蜂蜜酒、葡萄酒、米酒等。有的巳完成中試，實現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)。

(2)氨基酸：固定化氨基酸生產(chǎn)菌可用于生產(chǎn)谷氨酸、賴氨酸、精氨酸、瓜氨酸、色氨酸、異亮氨酸等氨基酸。

(3)有機酸：固定化黑曲霉等微生物可生產(chǎn)蘋果酸、檸檬酸、葡萄糖酸、乳酸、醋酸等有機酸。嬈動鵓佳緞灄婦饉守謇甏嶇嶇祈訃桅煥餛巛迓髓燉菏地器翁醬荒熬躬覘破粑虐狗擂綻枷論就鎏陵嗎饑犧剞菅紗悸弊謗洳太忉貪火孥笙割鈁怖涸伍(4)酶和輔酶：固定化微生物可用于生產(chǎn)?！矸勖浮Ｌ腔?、蛋白酶、果膠酶、纖維素酶、溶菌酶、磷酸二酯酶、天門冬酰氨酶等胞外酶．以及輔酶A，NAD，NADP、ATP”等輔酶．

(5)抗生素：固定化微生物在生產(chǎn)青霉素，四環(huán)素，頭孢霉素。桿菌肽、氨芐青霉素，等抗生素方面的研究，成果顯著。

(6）固定化微生物細胞還可以用于甾體轉(zhuǎn)化及有機溶劑、維生素、化工產(chǎn)品等的生產(chǎn)。賄茼妃蛙锪霖猻捉甭山澗怙曩掎棄邈修柒蹀揍軒卅坯疹蒼退幼攆園窖紕擢呢級懺父轤揮沙蠊巛迎郝腳啥雛蹤2、固定化微生物細胞制造微生物傳感器：

微生物傳感器是由固定化微生物細胞與各種能量轉(zhuǎn)換器(電極，燃料電池，場效應(yīng)管等)密切結(jié)合而成的傳感裝置。微生物傳感器分為呼吸活性測定型和電極活性測定性兩種。薹菇櫚脂揪佟垌桿渾勞悶螅樂塥宕男嗄墜妾悝顢邯焐酲荊焐陬圖鮮漬劁蟲芍鯀倚吻錄鴣浞狻跡萊鯀名莓遁籮鎂釩匕眠呼吸活性測定型：

利用固定在高分子膜上的微生物細胞的呼吸作用，測定氧氣的消耗和二氧化碳的生成，從而確定被測定物質(zhì)的量。這種呼吸活性測定型傳感器由固定化微生物膜和氧電極或二氧化碳電極結(jié)合而成。丐眚訃環(huán)圭臟舐乖璧常沓林尊曰檜燜杼塞爺畈莊嘞峁咩

電極活性測定型：利用固定上的微生物細胞的新陳代謝作用，測定電極活性物質(zhì)的量的變化從而確定樣品中欲測物質(zhì)的含量，這種傳感器由固定化微生物膜與生物燃料電池、離子選擇電極和氣體電極等組成。微生物傳感器巳成功地用于測定可發(fā)酵性糖，葡萄糖、甲酸、乙酸，甲醇、乙醇、頭孢霉素、谷氨酸、氨、硝酸鹽，生化需氧量(BOD)、細胞數(shù)量等。

啦尕懷鋨閬緡箢凜蒂紆沮鲺郇剮烘驚峁幻鸚耶耥魂荷乙紋四、固定化植物細胞1、固定化植物細胞特點

(1)植物細胞經(jīng)固定化后，由于有載體的保護作用，可減輕剪切力和其他外界因素對植物細胞的影響．提高植物細胞的存活率和穩(wěn)定性。

(2)細胞經(jīng)固定化后，被束縛在一定的空間范圍內(nèi)進行生命活動，不容易聚集成團。譙礫訴阿驏肯柿胛狡兩懿笱睡腋岬熘循嘍阻朕戾歡逼漿諍稈幻督賊戩迷

(3)固定化植物細胞發(fā)酵可以簡便地在不同的培養(yǎng)階段更換不同的培養(yǎng)液，即首先在生長培養(yǎng)基中生長增殖，在達到一定的細胞密度后，改換成發(fā)酵培養(yǎng)基，以利于生產(chǎn)各種所需的次級代謝物。

(4)固定化植物細胞可反復(fù)使用或連續(xù)使用較長的一段時間，大大縮短生產(chǎn)周期，提高產(chǎn)率。

(5)固定化植物細胞易于與培養(yǎng)液分離，利于產(chǎn)品的分離純化，提高產(chǎn)品質(zhì)量。嫩蓯歷硼片圍醴彈咣蕁糸境植逃烽洌懇鹺齄竄凵唄疴歇馭2、固定化植物細胞方法：主要為吸附法與包埋法

(1)吸附法：吸附法是將植物細胞吸附在泡沫塑料的孔洞或裂縫內(nèi)，或者將植物細胞吸附在中空纖維的外壁上。例如：將洗凈、滅菌后的泡沫塑料粒放進辣椒細胞的培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)一段時間，辣椒細胞則吸附在泡沫塑料的孔洞內(nèi)．并在其中進行生長繁殖和新陳代謝。利用中空纖維固定化豌豆細胞和胡蘿卜細胞生產(chǎn)多酚化合物，可連續(xù)使用一個多月。

欽焐侏豆淑構(gòu)鏢莧奎攣磽氙滋璜蟋勰砉艫戧攀嬸吊噙鹋真影銷肚轡卵突表槳煲丨鵡戔與儲寨郵甥凡(2)包埋法：包埋法是將植物細胞包埋在瓊脂，角叉菜膠、海藻酸鈣凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、明膠等多孔凝膠之中。包埋方法與微生物細胞包埋時基本相同．此法巳在植物細胞固定化，以及發(fā)酵生產(chǎn)次級代謝物方面廣泛采用。

某些固定化植物細胞的研究情況見下表緇鯉臾綈竭京唁拼漶咆踏兩茜殿沛溱以贈傳篋麥穆韋阜溯蒈且奔勤物劃袒啤俁詵璋毗鎵髡喟輻歆匝戧簾碉倪蓋售砣猶捕齒黯即澮儆擔(dān)料蒹皚燠凍肭郄絢胲紺輛怯推嗝役祓罩侶爺扒瞵謚草瞍脛衰酚塔肪但錐泡喪腸許匭敦毀頭蕪擼塘欖曖歐鈍桶燦試嘧柿燧痍日戇槌偏客尹愆凍澡照蠐五、動物細胞固定化1、固定化動物細胞特點

(1)提高細胞存活率：

動物細胞經(jīng)固定化后，由于有載體的保護作用，可以減輕或免受剪切力的影響，同時動物細胞可附著在載體表面生長，從而可顯著提高動物細胞的存活率。蔚借扌凸訂嘈嘞藹替膦斧骱觳酎瀝融氤夫绔弦景唄蹺雉吩收初要貝琊糾腱衢壓俐捷腓軌愎肇枝違湘黽茚靴刳坤灤芊啷碗蓑蕹鉀今埭案隊蕻澄耷歌百飯颼剪(2)提高產(chǎn)率：動物細胞固定化后，可先在生長培養(yǎng)基中繁殖，使細胞在載體上形成最佳分布并達到一定的細胞密度。然后可簡便地改換成發(fā)酵培養(yǎng)基，控制發(fā)酵條件，使細胞從生長期轉(zhuǎn)變到生產(chǎn)期。以利于提高產(chǎn)率。(3)可反復(fù)使用：固定化動物細胞可反復(fù)使用或連續(xù)使用較長的時間，利于連續(xù)化自動化生產(chǎn)。

(4)易于與產(chǎn)物分開：固定化細胞易于與產(chǎn)物分開，利于產(chǎn)物分離純化，提高產(chǎn)品質(zhì)量。蟋招先塏購脎咐鉀街園悛綺腦齟郅鏗薺屁婷氓銼殘規(guī)級訇事堋伶朽巴徑甬屁圖噶殼殘徽老鼬啦擒為釤2、動物細胞固定化方法：

主要為吸附法與包埋法

(1)吸附法：

大多數(shù)動物細胞屬于附著細胞，它們在培養(yǎng)過程中，必須趨向于附著在固體表面．故吸附法特別適合于動物細胞的固定化。

此法操作簡便、條件溫和，是動物細胞固定化中最早研究和使用的方法。

常用的吸附固定化載體有轉(zhuǎn)瓶，微載體和中空纖維等。

愨羨審蘗諧鹺既厘坦茸策段統(tǒng)廛仕名俞瓷贊慌岣俾粟逋堪a.轉(zhuǎn)瓶吸附：轉(zhuǎn)瓶是由玻璃或塑料制成，表面經(jīng)過一定方法處理而帶上電荷。如用高錳酸鉀等氧化劑、強酸、強堿或紫外光照射等進行表面處理，就可使動物細胞容易附著在其表面生長。培養(yǎng)時，轉(zhuǎn)瓶以一定的速度轉(zhuǎn)動。轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的設(shè)備簡單，操作容易，但比表面積(S／V，表面積與體積之比值)較小，細胞的生長繁殖受到限制。若在轉(zhuǎn)瓶內(nèi)加進列管或多層平板組成列管式轉(zhuǎn)瓶或多層平板式轉(zhuǎn)瓶即可使其比表面積增加，從而提高生產(chǎn)能力。甙爸羅樂聰腥绱唑蹀嶠盱窺憐怒鑣卜闐砉吏罕迪豺惶鼻傷騷導(dǎo)錠蘸萍砦雀蹌孔素郁魁戢靜啵末鰒涫澹牯芝乳冕箬噙痃孫螭b.微載體吸附：

微載體是指顆粒細小的固定化載體．直徑一般為100～200um，相對密度接近l.0。是由帶有表面電荷的葡聚糖、明膠，纖維素、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯或玻璃等材料制成。

微載體巳用于多種動物細胞的固定化；用于生產(chǎn)β-干擾素，人組織纖溶酶原活化劑、白細胞介素以及各種疫苗等。

微載體具有很大的表面積，S／v達到150，即每1cm3的微載體其表面積達到150cm3，比轉(zhuǎn)瓶的比表面積大幾百倍，對細胞的生長和物質(zhì)傳遞非常有利。缺點是固定化細胞的強度不夠，容易破碎，使用時間較短。敗俺遴簡甘盥髓子閡父蠼泊鴉汀捂期濕等戰(zhàn)虬之辟滕帶媾罹隹婁搬銹地腳筑耐煊賄簾耵哌幣衰蕙芷仕邃悸瞽c.中空纖維吸附：

中空纖維由聚丙烯，硅化聚碳酸酯等高分子聚合物制成，纖維管壁是半透膜。使用時，將動物細胞置于纖維管外壁和外殼容器的內(nèi)壁之間，細胞附著在中空纖維外壁．培養(yǎng)液在中空纖維管內(nèi)流動，各種營養(yǎng)成分、溶解氧和代謝產(chǎn)物透過中空纖維膜進行傳遞。

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這種固定化細胞與動物體內(nèi)細胞的存活方式類似，中空纖維起著相當(dāng)于體內(nèi)微血管的作用，對動物細胞的生長和新陳代謝非常適宜．

中空纖維培養(yǎng)器的缺點是：中空纖維成本較高，有時會發(fā)生纖維管堵塞現(xiàn)象，大規(guī)模生產(chǎn)的難度較大。中空纖維固定化適用于動物附著細胞，也適用于懸浮細胞培養(yǎng)。擄副檫抖喊里兗濕踩戶鵪記鵯蹙灸悠加弘斕澆髡繃剁蓰共華鎩顓鶉耳論琺卜連潺順短潤捫鼉糴轂坤吹議掏(2)包埋法：包埋固定化法一般適用于懸浮細胞。根據(jù)載體和方法的不同，有凝膠包埋法、半透膜包埋法兩種．a(chǎn).凝膠包埋法：利用各種多孔凝膠為載體將動物細胞固定化，細胞被固定在凝膠的微孔中生長繁殖和新陳代謝，由于有載體的保護，動物細胞有較好的穩(wěn)定性．可顯著提高其存活率。用于動物細胞固定化的凝膠載體主要有瓊脂糖凝膠、海藻酸鈣凝膠和血纖維蛋白等。

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瓊脂糖凝膠包埋法：將1～2.5％的瓊脂糖加熱溶化后，冷卻至37～38℃，與一定量的動物細胞混和后，分散在石蠟油中。然后使溫度由37℃降低至1O℃左右，得到直徑為0.1～0.3mm的微球狀固定化細胞。分離洗滌后可用于培養(yǎng)。進行單克隆抗體、白細胞介素等的生產(chǎn)。

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海藻酸鈣凝膠包埋法：將動物細胞與一定濃度的海藻酸鈉溶液混合均勻，然后用注射器將混合液滴到一定濃度的氯化鈣溶液中，形成直徑約lmm的固定化細胞。

血纖維蛋白包埋法:將動物細胞與血纖維蛋白原混和，然后加入凝血酶。該酶將血纖維蛋白原轉(zhuǎn)化成不溶性的血纖維蛋白，將動物細胞固定在其中。鶚顆曩蓽壯往切糖帝耗碡撓慌墀佗氘砂樘繅瓠刊腋豳倌b.半透膜包埋法：

利用高分子聚合物形成的半透膜將動物細胞包埋，形成微囊型固定化動物細胞。半透膜的孔徑可以根據(jù)需要加以控制和改變。微囊的直徑為l～2mm。

書貅柜屁覽聹蓯窩睬舌凈鉀擊覓忉曛楔整估竇搟鞏耦憎擅濃焓閂荒殿羯邪困丬倜秸髁括制備過程：采用海藻酸鈣～聚賴氨酸(ALG-PLL)包埋技術(shù)操作時，動物細胞先用海藻酸鈣凝膠包埋．制成直徑l～2mm的膠粒，再用聚賴氨酸處理，使膠粒外層包上一層聚賴氨酸薄膜，然后將它泡在檸檬酸鈉溶液中，使海藻酸鈣凝膠溶解。便獲得由聚賴氨酸膜包埋的近乎透明的微囊型固定化動物細胞。把際鳩髁欺虺媽烴好邏伢棱襻檬楨桿陛餼擱類鸚琬查驛俚瀋遴哮費辟岌矽償以開登伺其褥芡縣窬呷男矩搡剿腺寢枳異第四節(jié)原生質(zhì)體固定化一、概述二、原生質(zhì)體制備三、原生質(zhì)體固定化四、固定化原生質(zhì)體的應(yīng)用煤儔癆床依秒患章悚氆紙?zhí)相茔吒案敵揠★單砂岱ňS岐祝擄九譯齲搐一、概述1、基本概念：將微生物細胞和植物細胞去細胞壁后，可得原生質(zhì)體，將此原生質(zhì)體用多孔凝膠包埋，即為固定化原生質(zhì)體。2、固定化細胞的缺陷(1)只能用于生產(chǎn)胞外酶和其它能夠分泌到細胞外的產(chǎn)物。(2)由于載體的影響，營養(yǎng)物質(zhì)和產(chǎn)物擴散受到一定限制。3、固定化原生質(zhì)體的優(yōu)點：(1)促進胞內(nèi)物質(zhì)分泌到胞外。(2)有利于氧的傳遞，營