毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)課件

毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)1實(shí)驗(yàn)一

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一般操作技術(shù)2一、目的二、內(nèi)容（一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇1、物種的選擇：嚙齒類、非嚙齒類基本原則：代謝、生化、毒理學(xué)特征與人最接近的自然壽命不太長(zhǎng)的易于飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作的經(jīng)濟(jì)且易于獲得的32、品系的選擇：遺傳學(xué)控制分類近交系：純品系雜交群：F1代封閉群：5年內(nèi)，隨機(jī)交配遺傳均一性：一種毒物固定使用同種品系43、微生物學(xué)和寄生蟲(chóng)控制的選擇Ⅰ級(jí)：普通動(dòng)物，開(kāi)放系統(tǒng)飼養(yǎng)Ⅱ級(jí)：清潔動(dòng)物，屏障系統(tǒng)飼養(yǎng)Ⅲ級(jí)：SPF動(dòng)動(dòng)，屏障/隔離系統(tǒng)飼養(yǎng)Ⅳ級(jí)：無(wú)菌動(dòng)物，隔離系統(tǒng)飼養(yǎng)54、個(gè)體選擇性別：年齡：急性、慢性以體重估計(jì)：組內(nèi)、組間差異生理狀態(tài)：雌--未產(chǎn)未孕，避免妊娠、激素影響健康狀況：健康動(dòng)物健康動(dòng)物辨認(rèn)：6健康動(dòng)物辨認(rèn)：外觀體形豐滿，被毛濃密有光澤、緊貼體表，眼睛明亮，行動(dòng)迅速、反應(yīng)靈活，食欲及營(yíng)養(yǎng)狀況良好。(1)眼：明亮，瞳孔雙側(cè)等圓，無(wú)分泌物。(2)耳，耳道無(wú)分泌物溢出，耳殼無(wú)膿瘡。(3)鼻：無(wú)噴嚏，無(wú)漿性粘液分泌物。(4)皮膚：無(wú)創(chuàng)傷、無(wú)膿瘡、疥癬、濕疹。(5)頸部：要求頸項(xiàng)端正，如有歪斜提示可能存在內(nèi)耳疾患，不應(yīng)選作實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。(6)消化道：無(wú)嘔吐、腹瀉，糞便成形，肛門附近被毛潔凈。(7)神經(jīng)系統(tǒng)：無(wú)震顫、麻痹。若動(dòng)物(大鼠、小鼠)出現(xiàn)圓圈動(dòng)作或提尾倒置呈圓圈擺應(yīng)放棄該動(dòng)物。(8)四肢及尾：四肢、趾及尾無(wú)紅腫及潰瘍。7（二）動(dòng)物性別鑒定(1)大鼠、小鼠：主要依肛門與生殖孔間的距離區(qū)分，間距大者為雄性，小者為雌性。成年雄鼠臥位可見(jiàn)到辜丸，雌性在腹部可見(jiàn)乳頭。(2)豚鼠；用一只于抓住豚鼠頸部，另一只手扒開(kāi)靠生殖器孔的皮膚，雄性動(dòng)物在圓孔中露出性器官的突起，雌性動(dòng)物則顯示三角形間隙，成年雌性豚鼠胸部有兩個(gè)乳頭。8（三）動(dòng)物抓取正確地抓取固定動(dòng)物，既不損害動(dòng)物健康、不影響觀察指標(biāo)，又防止被動(dòng)物咬傷(1)小鼠：先用右手抓取鼠尾提起，置于鼠籠或?qū)嶒?yàn)臺(tái)上向后拉，在其向前爬行時(shí)，用左手拇指和食指抓住小鼠的兩耳和頸部皮膚，將鼠體置于左手心中，把后肢拉直，以無(wú)名指按住鼠尾，小指按住后腿即可。9(2)大鼠：大鼠的抓取基本同小鼠，只是大鼠比小鼠性情兇猛，不易用襲擊方法抓取。為避免咬傷，可帶上帆布或棉紗手套。采用左手固定法，用拇指和食指捏住鼠耳，余下三指緊捏鼠背皮膚，置于左掌心中。10(3)豚鼠：豚鼠膽小易驚，在抓取時(shí)要穩(wěn)、準(zhǔn)、迅速。用手掌迅速扣住鼠背，抓住其肩胛上方，以拇指和食指環(huán)握頸部，另一只手托住臀部即可。(4)兔：用右手抓住兔頸部的毛皮提起，然后左手托住其臀部或腹部，讓其體重的大部分重量集中在左手上。注意不要抓取雙耳或抓提腹部。11（四）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物稱重、編號(hào)、標(biāo)記染色法：苦味酸、品紅耳緣孔口標(biāo)記：項(xiàng)圈（五）動(dòng)物隨機(jī)分組：隨機(jī)數(shù)字表12（六）染毒途徑和方法經(jīng)口（胃腸道）染毒喂飼：不易揮發(fā)、不易水解、無(wú)異味、不影響營(yíng)養(yǎng)吞咽膠囊：灌胃：灌前禁食空腹，不飲水小鼠、大鼠或豚鼠：左手抓住鼠背部及頸部皮膚將動(dòng)物固定，右手持注射器，將灌胃針插入動(dòng)物口中，沿咽后壁徐徐插入食管。針插入時(shí)應(yīng)無(wú)阻力，若感到阻力或動(dòng)物掙扎，應(yīng)立即停止進(jìn)針或?qū)⑨槹纬?，以免損傷或穿破食管及誤入氣管。13經(jīng)呼吸道染毒靜式吸入動(dòng)式吸入氣管內(nèi)注入14經(jīng)皮膚染毒斑貼法（家兔）被毛的去除：剪毛、拔毛、脫毛浸尾法（大、小鼠）注射染毒：靜脈注射、肌肉注射、腹腔注射、皮下注射、皮內(nèi)注射15（七）生物標(biāo)本采集1.血液采集：大、小鼠鼠尾采血法眼眶靜脈叢采血法腹主動(dòng)脈或股動(dòng)(靜)脈采血法斷頭采血法家兔耳緣靜脈采血法心臟采血法16實(shí)驗(yàn)動(dòng)物安全采血量動(dòng)物品種最大安全采血量(ml)最小致死采血量(ml)小鼠0.10.3大鼠1.02.0豚鼠5.010.0家兔10.040.0172.尿液、糞便收集：代謝籠（八）動(dòng)物處死脊椎脫臼法斷頭法急性大失血法擊打法麻醉致死法麻醉后急性放血法空氣栓塞法化學(xué)藥物致死法開(kāi)放性氣胸法18微核實(shí)驗(yàn)動(dòng)物染毒陰性對(duì)照組：生理鹽水陽(yáng)性對(duì)照組：環(huán)磷酰胺40-60mg/kg高劑量組：敵敵畏20mg/kg中劑量組：敵敵畏10mg/kg低劑量組：敵敵畏5mg/kg19實(shí)驗(yàn)二

急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)20一、目的掌握LD50計(jì)算方法和急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)熟悉經(jīng)口灌胃技術(shù)了解急性毒性試驗(yàn)的設(shè)計(jì)原則21急性毒性、急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)急性毒性：一次或多次接觸，短時(shí)間產(chǎn)生的毒性效應(yīng)，包括一般行為和外觀改變，大體形態(tài)改變以及死亡效應(yīng)等。農(nóng)藥的急性毒性分級(jí)：低、中、高、劇毒22LD50計(jì)算方法改良寇氏法：計(jì)算簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確率高，常用霍恩法序貫法Bliss法23改良寇氏法要求每組動(dòng)物數(shù)相等各劑量組組距呈等比級(jí)數(shù)死亡呈正態(tài)分布最低劑量組死亡<20%最高劑量組死亡>80%死亡不倒置24二、原理健康動(dòng)物按體重隨機(jī)分組一次或多次經(jīng)口給藥觀察中毒特征或死亡劑量-反應(yīng)關(guān)系求出LD50毒性分級(jí)25三、材料與試劑動(dòng)物：昆明種小白鼠器材：試劑：敵敵畏，苦味酸26四、步驟動(dòng)物選擇劑量設(shè)計(jì)：5-8個(gè)劑量（一般不設(shè)對(duì)照組）最高、高、中、低、最低5個(gè)劑量,中劑量組：100mg/kg，組距1.4動(dòng)物稱重、編號(hào)、標(biāo)記受試物配制灌胃：1ml/100g體重觀察：急性毒性試驗(yàn)原始記錄2728LD50計(jì)算：LD50及95%可信區(qū)間29計(jì)算公式m=Xk-i(∑p-0.5)m：lgLD50i:相鄰兩劑量組對(duì)數(shù)值的差Xk：最大劑量的對(duì)數(shù)值P：死亡率q:存活率n：每組動(dòng)物數(shù)∑p=各劑量組死亡率總和30五、評(píng)價(jià)：毒性分級(jí)、毒性特征六、討論：31實(shí)驗(yàn)二

皮膚刺激性/腐蝕性試驗(yàn)（豚鼠）32試驗(yàn)?zāi)康拇_定化學(xué)物對(duì)哺乳動(dòng)物皮膚局部是否有刺激作用或腐蝕作用及其程度，為制定防護(hù)化學(xué)物對(duì)皮膚的刺激保護(hù)措施提供依據(jù)。33皮膚刺激性(DermalIrritation)：皮膚涂敷受試樣品后局部產(chǎn)生的可逆性炎性變化。皮膚腐蝕性(DermalCorrosion)：皮膚涂敷受試樣品后局部引起的不可逆組織損傷。34試驗(yàn)的基本原則將受試物一次(或多次)涂敷于受試動(dòng)物的皮膚上，在規(guī)定的時(shí)間間隔內(nèi)，觀察動(dòng)物皮膚局部刺激作用的程度并進(jìn)行評(píng)分。采用自身對(duì)照，以評(píng)價(jià)受試物對(duì)皮膚的刺激作用。急性皮膚刺激性試驗(yàn)觀察期限應(yīng)足以評(píng)價(jià)該作用的可逆性或不可逆性。35強(qiáng)酸或強(qiáng)堿物質(zhì)如pH≤2或pH≥11.5，由于可預(yù)見(jiàn)其腐蝕特性，不必做本試驗(yàn)；若已知受試樣品有很強(qiáng)的經(jīng)皮吸收毒性（LD50≤200mg/kgbw）的物質(zhì)不必進(jìn)行本試驗(yàn)；36試驗(yàn)方法1、受試樣品液態(tài)受試樣品采用原液或人類實(shí)際應(yīng)用濃度固體受試樣品經(jīng)研磨，過(guò)100目篩后用水或適當(dāng)?shù)馁x形劑（如凡士林、阿拉伯樹(shù)膠、乙醇和水、羧甲基纖維素、聚乙二醇、丙三醇、植物油和礦物油等）按一定比例調(diào)制，以保證與皮膚充分接觸。372、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和飼養(yǎng)環(huán)境

首選健康成年白色家兔，其次為白色豚鼠。至少需要4只健康成年動(dòng)物（雄性和/或雌性均可）。每只動(dòng)物相鄰的未處理的皮膚可作為對(duì)照。每只單籠飼養(yǎng)，試驗(yàn)前動(dòng)物要在實(shí)驗(yàn)室中適應(yīng)3d。常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水383、劑量設(shè)計(jì)受試樣品0.5ml(g)，均勻涂布于受試部位。如受試樣品難以獲得，或易產(chǎn)生全身毒性等原因，用量可適當(dāng)減少。但為了試驗(yàn)的一致性，測(cè)試面積應(yīng)力求相等。394、試驗(yàn)步驟1）試驗(yàn)前準(zhǔn)備試驗(yàn)前24h，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物脊柱兩側(cè)毛剪去或剃掉，不可損傷表皮，去毛范圍左右各3cm×3cm。24h后，選擇皮膚健康完整無(wú)損的動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)。不應(yīng)在長(zhǎng)有濃密島狀毛的部位進(jìn)行受試樣品試驗(yàn)。402）染毒受試樣品0.5ml(g)直接涂布在皮膚上，用二層紗布（2.5cm×2.5cm）和一層玻璃紙或類似物覆蓋，再用無(wú)刺激性膠布和繃帶加以固定。另一側(cè)皮膚作為對(duì)照。采用封閉試驗(yàn)，敷用時(shí)間為4h。41對(duì)化妝品產(chǎn)品而言，可根據(jù)人的實(shí)際使用和產(chǎn)品類型，延長(zhǎng)或縮短敷用時(shí)間。對(duì)用后沖洗的化妝品產(chǎn)品，僅采用2h敷用試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)束后用溫水或無(wú)刺激性溶劑清除殘留受試物。42如懷疑受試樣品可能引起嚴(yán)重刺激或腐蝕作用，可采用分段試驗(yàn)，將三個(gè)涂布受試樣品的紗布?jí)K同時(shí)或先后敷貼于一只家兔背部脫毛區(qū)皮膚上，分別于涂敷后3min、60min和4h取下一塊紗布，皮膚涂敷部位在任一時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)腐蝕作用，即可停止試驗(yàn)。433）觀察期限觀察時(shí)間的確定應(yīng)足以觀察到可逆和不可逆刺激作用的全過(guò)程，一般不超過(guò)14d。于清除受試樣品后的1、24、48、72h分別觀察給予受試樣品部位的皮膚反應(yīng)，按表1進(jìn)行皮膚反應(yīng)評(píng)分，以受試動(dòng)物積分的平均值進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，根據(jù)24、48和72h各觀察時(shí)點(diǎn)最高積分均值，按表2判定皮膚刺激強(qiáng)度。4445465、試驗(yàn)報(bào)告試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)以表格形式總結(jié)，包括如下內(nèi)容：受試物名稱、理化性狀、配制方法和用量。必要時(shí)說(shuō)明pH值實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種屬、品系、性別、體重和來(lái)源(合格證號(hào)和級(jí)別)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境：飼料來(lái)源、室溫、相對(duì)濕度、動(dòng)物房合格證號(hào)每個(gè)動(dòng)物在每一觀察時(shí)點(diǎn)的皮膚刺激反應(yīng)積分具體描述除刺激性以外的其它毒性作用結(jié)論47488試驗(yàn)結(jié)果的解釋急性皮膚刺激試驗(yàn)結(jié)果從動(dòng)物外推到人的可靠性很有限。白色家兔和豚鼠在大多數(shù)情況下對(duì)有刺激性或腐蝕性的物質(zhì)較人類敏感。若用其它品系動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)也得到類似結(jié)果，則會(huì)增加從動(dòng)物外推到人的可靠性。試驗(yàn)中使用封閉式接觸是一種超常的實(shí)驗(yàn)室條件下的試驗(yàn)，在人類實(shí)際接觸化學(xué)品過(guò)程中很少存在這種接觸方式。49附：多次皮膚刺激性試驗(yàn)步驟1試驗(yàn)前將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物背部脊柱兩側(cè)被毛剪掉，去毛范圍各為2cm×3cm，涂抹面積2.5cm×2.5cm。2取受試物約0.5mL(g)涂抹在一側(cè)皮膚上，當(dāng)受試物使用無(wú)刺激性溶劑配制時(shí)，另一側(cè)涂溶劑作為對(duì)照，每天涂抹1次，連續(xù)涂抹14d。從第二天開(kāi)始，每次涂抹前應(yīng)剪毛，用水或無(wú)刺激性溶劑清除殘留受試物。一小時(shí)后觀察結(jié)果，按表1評(píng)分，對(duì)照區(qū)和試驗(yàn)區(qū)同樣處理。50結(jié)果評(píng)價(jià)：按下列公式計(jì)算每天每只動(dòng)物平均積分，以表2判定皮膚刺激強(qiáng)度。5152DDV：LD50：50～80mg/kg(大鼠經(jīng)口)；75-107，113mg/kg(大鼠經(jīng)皮)；LC50：15mg/(大鼠吸入，4h)二甲苯：LD50：5000mg/kg（大鼠經(jīng)口）；LC50：1947mg/m3（大鼠吸入）;輕微粘膜刺激。引起皮膚發(fā)紅。家兔經(jīng)皮：500mg/24h，中度刺激甲醛：急性毒性：LD50800mg/kg（大鼠經(jīng)口），2700mg/kg（兔經(jīng)皮）；LC50590mg/m3（大鼠吸入）；人吸入60～120mg/m3，發(fā)生支氣管炎、肺部嚴(yán)重?fù)p害；人吸入12～24mg/m3，，鼻、咽粘膜嚴(yán)重灼務(wù)、流淚、咳嗽；人經(jīng)口10～20ml，致死。53實(shí)驗(yàn)三

小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)54一、目的：掌握小鼠骨髓PCE微核測(cè)定方法二、原理染色體斷裂染色體完整性紡錘絲受影響染色體分離改變有核細(xì)胞：難與核的分葉鑒別紅細(xì)胞：最后一次分裂后將主核排出（PCE）PCE24小時(shí)NCE（大多微核排出）55三、材料、試劑試劑：受試物、陽(yáng)性物、小牛血清、染液等動(dòng)物器材56四、步驟動(dòng)物選擇：雌雄各半劑量選擇：陰性、陽(yáng)性對(duì)照，3-5個(gè)劑量組