粗糙鏈孢霉有性雜交的四分子分析

粗糙鏈孢霉有性雜交的四分子分析一、相關(guān)理論知識二、目的要求三、實驗原理四、試劑與器材五、實驗步驟六、實驗結(jié)果七、本卷須知八、思考題吉林大學(xué)生物根底實驗教學(xué)中心相關(guān)理論知識(1)鏈孢霉俗稱紅霉菌。鏈孢霉菌絲生長疏松，呈棉絮狀，白色，分生孢子成串懸掛在氣生菌絲上，呈桔紅色，鏈孢霉廣泛分布于自然界土壤中和禾木科植物上，分生孢子在空氣中飄浮，靠氣流傳播，是高溫季節(jié)發(fā)生的最重要的雜菌。7-9月是盛發(fā)頂峰。在20-30℃條件下，遇適合的栽培料，蔓延迅速，傳播力強，菌絲生長階段一旦發(fā)現(xiàn)菌袋上感染鏈孢霉，三天后整個生產(chǎn)場地都布滿了鏈孢霉的孢子，有時會造成消滅性危害。防止鏈孢霉蔓延的最簡單方法是發(fā)生部位涂上煤油柴油等可控制其危害。鏈孢霉有兩種繁殖方式，一種是無性繁殖，當(dāng)其孢子〔N〕或菌絲落在營養(yǎng)物上，孢子萌發(fā)，菌絲生長形成菌絲體〔N〕。另一種是有性繁殖，兩個親本必須是不同的交配型〔matigtype〕A和a，各自的分生孢子會散落在不同交配型子實體的受精絲上，進(jìn)入子實體，進(jìn)行核融合，形成2n核，〔A/a〕。二倍體時期十分短暫，很快進(jìn)行減數(shù)分裂，最后再經(jīng)過一次有絲分裂，在子囊中產(chǎn)生8個單倍體的子囊孢子，子囊孢子成熟后有可萌發(fā)，長成新的菌絲體。

相關(guān)理論知識(2)相關(guān)理論知識(3)鏈孢霉后代多，樣本大，統(tǒng)計分析的誤差小，生活周期段短，在短時間內(nèi)可獲得結(jié)果。鏈孢霉易培養(yǎng)和操作，可利用選擇培養(yǎng)基篩選各種突變型；鏈孢霉又屬真核生物，可作為真核的研究模型，因此是很好的遺傳學(xué)實驗材料。子囊孢子是單倍體，不存在顯隱性的問題，表型和基因型一致；孢子按順序排列在子囊中，我們稱其為順序四分子〔Orderedtetrad〕，經(jīng)過分析易于確定是否是重組類型及基因的轉(zhuǎn)變，其著絲粒本身也可看作是一個位點來研究，因此在四分體時期進(jìn)行遺傳分析是很方便的，這種方法稱為四分子分析〔terardanalysis〕。目的要求1、學(xué)習(xí)菌種活化法,雜交方法及培養(yǎng)基配制方法。2、了解順序排列的四分子遺傳分析方法。3、掌握有關(guān)基因與著絲粒距離的計算和作圖。實驗原理鏈孢霉〔Neurosporacrassa〕屬真菌類，染色體為n倍，繁殖方式可以有營養(yǎng)體菌絲或分生孢子經(jīng)有絲分裂直接發(fā)育成菌絲體，并產(chǎn)生大量的分生孢子。如果把兩個不同品系鏈孢霉接種雜交培養(yǎng)基上，鏈孢霉又能進(jìn)行有性生殖。在有性生殖時，菌絲體的頂端，分生孢子的基部先長出一個原子囊果，類似高等植物的性器官，原子囊果能接受來自不同品系菌絲體上的分生孢子，原來n倍的原子囊果就變成了2n的子囊果，這個2倍體的合子經(jīng)過減數(shù)分裂形成4個子細(xì)胞，每個子細(xì)胞又經(jīng)過一次有絲分裂，使原來的4個細(xì)胞變成8個細(xì)胞，這8個細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)育成8個子囊孢子排列在一個子囊中，它們是一次減數(shù)分裂的產(chǎn)物。實驗原理有性雜交是在形狀不同的兩個品系中進(jìn)行的，子囊孢子的顏色有黑有白，通過雜交產(chǎn)生的8個子囊孢子應(yīng)該是4黑4白，但排列的方式有不同，這是由于染色體交換引起的。減數(shù)分裂同源染色體配對時，4條染色單體發(fā)生交換的概率相同，造成8個子囊孢子有4種排列方式，加上沒有交換親組合2種排列方式，8個子囊孢子一共有6種排列方式，這是顯微鏡下可以直接觀察到的。把觀察到的子囊數(shù)目進(jìn)行整理，按以下公式計算：重組值=交換子囊數(shù)/子囊總數(shù)×100%×1/2得到的重組值就是該性狀在染色體上距著粒之間的距離。試劑與器材1、材料：〔1〕野生型粗糙鏈孢霉，自身可以合成賴氨酸，用lys+表示。子囊孢子是黑色的?！?〕賴氨酸缺陷型粗糙鏈孢霉，自身失去合成賴氨酸的能力，必須在培養(yǎng)基中添加賴氨酸才能生長，用lys-表示。子囊孢子是白色的。鏈孢霉染色體數(shù)n=7，是單倍體。沒有同源染色體，也就沒有基因的顯隱性，染色體上基因控制的性狀可以直接在子代中表現(xiàn)出來。另外鏈孢霉進(jìn)行有性生殖，通過兩個不同性狀親本之間的雜交，可以直接在顯微鏡下觀察到染色體的別離交換現(xiàn)象。2、試劑：瓊脂、蔗糖、賴氨酸、玉米粒、次氯酸鈉、馬鈴薯3、器材：恒溫培養(yǎng)箱、高壓滅菌器、燒杯、量筒、天平、試管、濾紙片、載玻片、蓋玻片、記號筆、玻璃棒、藥匙實驗步驟1、配制菌種活化培養(yǎng)基〔1〕根本培養(yǎng)基〔供lys+活化用〕，將土豆去皮洗凈，切成0.5cm3小塊，分別裝入試管中，每個試管5—7塊。2%的瓊脂條和2%蔗糖煮沸溶解后分裝在有土豆塊的試管中，經(jīng)121℃，高壓滅菌15min后，制做斜面?zhèn)溆谩！?〕補充培養(yǎng)基〔供lys-活化用〕，在根本培養(yǎng)基中按5mg/100mL參加賴氨酸即為補充培養(yǎng)基，其它相同。實驗步驟2、菌種活化：從冰箱中取出lys+和lys-菌種，在無菌條件下把lys+接在根本培養(yǎng)基上，把lys-接在補充培養(yǎng)基上。接種好的試管放在25℃條件下培養(yǎng)5—6天，直至試管中長出許多菌絲，并且有大量的分生孢子時，說明菌種已經(jīng)活化好。菌種活化時間不要過長，否那么菌絲和分生孢子已經(jīng)老化，影響雜交成功率。實驗步驟3、配制雜交培養(yǎng)基：將玉米粒浸泡24h后洗凈，，每支試管裝3粒。將2%的瓊脂條和2%蔗糖煮沸溶解后分裝在有玉米粒的試管中，經(jīng)121℃，高壓滅菌15min后，制做斜面?zhèn)溆谩嶒灢襟E4、雜交：將活化好的菌種lys+和lys-同時接到雜交培養(yǎng)基上，接種菌絲體和分生孢子都可以。接種完以后，在培養(yǎng)基外表放一小塊濾紙片，接種后的試管放在25℃恒溫培養(yǎng)箱中二周左右便有黑色顆粒狀子囊果出現(xiàn)，但還沒有完全成熟，到三周左右，子囊果根本成熟，可以在顯微鏡下觀察，觀察的最正確時間是雜交后的23—25天這段時間內(nèi)。實驗步驟5、顯微鏡觀察〔1〕先把長有子囊果的試管中參加少量無菌水充分搖動，把水倒入燒杯中加熱煮沸，防止分生孢子飛揚。〔2〕用接種針挑選個大飽滿的子囊果放在載玻片上，滴上一滴5%次氯酸鈉溶液浸泡2min左右。次氯酸鈉的作用是對子囊果壁起腐蝕作用，以便將子囊果壓破。壓片時用力不宜過大，因為一次分裂產(chǎn)生的8個子囊孢子順序的排列在一個子囊中，觀察時要以子囊為單位進(jìn)行統(tǒng)計，假設(shè)用力過大，8個子囊孢子被壓出子囊都分散開了，不利于觀察。實驗結(jié)果子囊類型觀察數(shù)++++－－－－－－－－++++++－－++－－－－++－－++++－－－－++－－++++－－總計實驗結(jié)果實驗結(jié)果分析經(jīng)過顯微鏡下的觀察，子囊孢子的排列方式有以下6種：第一次分裂別離子囊〔親本類型〕〔1〕++++－－－－〔2〕－－－－++++第二次分裂別離子囊〔重組類型〕〔3〕++－－++－－〔4〕－－++－－++〔5〕++－－－－++〔6〕－－++++－－產(chǎn)生〔1〕和〔2〕兩種親本類型，是因為沒有染色體之間的交換。本卷須知1、培養(yǎng)菌種是要注意培養(yǎng)溫度。2、雜交后