分子雜交技術(shù)課件

ACGT分子雜交技術(shù)基因公司技術(shù)講座****分子雜交****分子生物學(xué)中用于檢測生物樣本中是否含有特定的生物分子（探針）的一門技術(shù)。分子雜交原理及流程圖樣品制備電泳雜交轉(zhuǎn)膜結(jié)果顯示探針制備***分子雜交分類***?SouthernBlotDNA雜交?NorthernBlotRNA雜交?WesternBlot蛋白質(zhì)雜交?原位雜交****樣品制備****?DNA純化?RNA純化****探針制備****隨機(jī)引物法雙鏈DNA探針合成標(biāo)記優(yōu)化技術(shù)DECAprimeTMIIRandomPrimingDNALabelingKit優(yōu)化技術(shù)：*高純度無外切酶活性的Klenow酶提高了標(biāo)記效率10分鐘完成反應(yīng)*改進(jìn)的標(biāo)記動(dòng)力學(xué)增加了探針產(chǎn)量對低純度及低濃度模板也能通過延長反應(yīng)時(shí)間達(dá)到目的*獨(dú)特的Decamer溶液提高引物-模板復(fù)合物穩(wěn)定性減少引物雙體形成，提高了靈敏度*標(biāo)記靈活：提供dATP和dCTP兩種標(biāo)記緩沖液特異性單鏈DNA探針合成標(biāo)記優(yōu)化技術(shù)Prime-A-ProbeTMStrandSpecificDNAProbeSynthesisKit活性大于4×cpm/ug109合成高特異性全長RNA探針的最佳選擇——MAXIscriptTM體外轉(zhuǎn)錄試劑盒特點(diǎn)：*可合成長達(dá)2kb的RNA*產(chǎn)量可達(dá)2-4ug/ul同位素標(biāo)記可達(dá)109cpm/ug*對應(yīng)不同的啟動(dòng)子有不同的試劑盒可供選擇*同位素或非放標(biāo)記均可多次洗脫反復(fù)雜交探針制備技術(shù)——Strip-EZTMSystem專門為需要在同一張膜上反復(fù)標(biāo)記檢測不同信號的用戶設(shè)計(jì)，提供非常溫和的雜交信號洗脫條件，提高膜的使用壽命達(dá)通常的三倍左右。工作原理合成探針的同時(shí)摻入經(jīng)過修飾的dNTP(修飾不影響雜交特性）雜交檢測后將膜浸入探針降解緩沖液中將探針降解68℃溫和洗脫適用于：Northern\Southern\dot/slot及相關(guān)雜交Strip-EZTMRNA探針合成Strip-EZTMRNAProbeSynthesis&RemovalKit特點(diǎn)：*靈敏度高比隨機(jī)引物法DNA探針靈敏10倍以上*溫和洗脫，提高膜壽命*不同啟動(dòng)子有不同試劑盒*同位素和非放標(biāo)記均可效果比較PCR法Strip-EZTMDNA探針的合成Strip-EZTMPCRStripableDNAProbeSynthesis&RemovalKit

特點(diǎn)：*模板多樣：克隆序列、cDNA、PCR產(chǎn)物*不對稱PCR技術(shù)，產(chǎn)物大多為單鏈DNA探針*靈敏度高，比隨機(jī)引物法高3-5倍*提供除模板、標(biāo)記物、Taq酶外所有合成探針及洗膜試劑，包括M13正反向及T7引物結(jié)果比較cDNAdsDNAssDNAssRNAOligonucleotidessRNAssDNAdsDNAOligonucleotideProbeType****標(biāo)記類型****?放射性同位素標(biāo)記：靈敏度高，成本低但操作不便，標(biāo)記效率不太穩(wěn)定，壽命受半衰期限制?非放射性標(biāo)記（地高辛、生物素、熒光素等）：安全，標(biāo)記穩(wěn)定，探針壽命較長但靈敏度較低，背景較高，成本高非放射性雜交系統(tǒng)BrightStarTMPsoralen-BiotinNonisotopiclabelingKit&BioDetectTMNonisotopicDetectionKit靈敏度最高的非放檢測系統(tǒng)之一——BioDetectTMNonisotopicDetectionKit

采用的化學(xué)發(fā)光劑CDP-Star為發(fā)光最強(qiáng)、發(fā)光時(shí)間最長的化學(xué)發(fā)光底物之一，靈敏度與同位素相當(dāng)。*曝光10-30分鐘相當(dāng)于32P壓片1-2天*發(fā)光時(shí)間穩(wěn)定持續(xù)2天，發(fā)光峰值無明顯下降允許反復(fù)多次壓片*背景很低Phototope?化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)NEBlot?Phototope?Kit&Phototope?-StarChemiluminescentDetectionKitNorthern雜交Southern雜交Phage文庫篩選菌落及質(zhì)粒文庫篩選用途原位雜交及檢測試劑盒mRNAlocator-HybTMInSituHybridizationKitmRNAlocator-BiotinTMmRNAInSituDetectionKit6小時(shí)完成雜交RNasecure保證無RNase污染高效靈敏的NBT/BCIP-生物素探針顯色檢測提供對照改良的Northern雜交技術(shù)——Ambion公司的Northern雜交系列完整的Northern雜交試劑盒

包括從瓊脂糖、上樣、配膠、電泳、轉(zhuǎn)移緩沖液到雜交、洗膜液，除RNase、膜、Marker的全套試劑。簡便、無污染、背景低、分辨率高；同位素、非放標(biāo)記均可雜交用瓊脂糖及聚丙烯酰氨凝膠——電泳膠專業(yè)廠家：BMA公司Agarose&PAGE預(yù)制膠Reliantgelsystem

ReliantRNAgelsystem

PAGErPrecastgelsNEB公司各種規(guī)格的優(yōu)質(zhì)DNA/RNA/ProteinMWMarkersProteinMarker,BroadRange(2-212kDa)PrestainedProteinMarker,BroadRange(6-175kDa)HRPProteinMarkerDetectionPack世界標(biāo)準(zhǔn)雜交膜——Schleicher&Schuell公司產(chǎn)品*Protran?硝酸纖維素膜*Optitran?BA-S加強(qiáng)型硝酸纖維素膜*Nytran?尼龍膜*Nytran?SuPerCharge高負(fù)荷正電荷尼龍膜

單位面積所帶正電荷是普通膜的3倍大大降低了背景及非特異性結(jié)合膜孔徑、表面均一性、對稱毒度、潔凈度好分析基因差異表達(dá)的預(yù)制雜交膜熱點(diǎn)領(lǐng)域中基因的cDNA點(diǎn)陣各種來源的mRNACLONTECH公司的高效雜交液——ExpressHybHybridizationSolution特點(diǎn)：通過升高雜交溫度并使用修飾的雜交液不僅將雜交時(shí)間由傳統(tǒng)的12-24小時(shí)減為1-2小時(shí)，還大大降低了非放標(biāo)記檢測的背景。特別適用于Northern雜交檢測低拷貝RNA和Southern雜交檢測單拷貝基因新型方便的除RNase試劑RNaseZAPRNaseDecontaminationSolution一種能完全去除玻璃、塑料表面RNase污染的噴霧劑ElectroZap

還可除電極及pH計(jì)等表面的RNaseRNAsecure

比傳統(tǒng)的DEPC使用安全、簡便無須滅菌等后續(xù)處理，不影響RT-PCR、體外轉(zhuǎn)錄等后續(xù)實(shí)驗(yàn)RNAlater最方便的樣品貯藏液5倍體積即可抑制組織中的RNase穩(wěn)定的樣品可：室溫保存一周，4℃保存一月，-20℃長期保存不凍結(jié)樣品類型：組織（骨除外）、植物、大腸桿菌、果蠅、魚等分子雜交實(shí)驗(yàn)所用部分儀器雜交箱