研究生抗體技術(shù)第1講

單克隆抗體技術(shù)

生物技術(shù)學(xué)院董文其

一、學(xué)習(xí)目的了解和掌握細(xì)胞培養(yǎng)根本知識(shí)和技能了解和掌握單克隆抗體制備技術(shù)有關(guān)培養(yǎng)的幾個(gè)概念細(xì)胞培養(yǎng)〔cellculture〕組織培養(yǎng)〔tissueculture〕器官培養(yǎng)〔organculture〕

離體細(xì)胞在培養(yǎng)過程中不出現(xiàn)分化、不形成組織。

取自動(dòng)物的某類組織，在培養(yǎng)過程中細(xì)胞一直保持原本已分化的特性，該組織的結(jié)構(gòu)和功能不發(fā)生明顯變化。整個(gè)器官或器官的一局部在體外條件下的保存或生長。細(xì)胞系〔cellline〕細(xì)胞株〔cellstrain〕原代培養(yǎng)〔primaryculture〕傳代〔passage或subcultuer〕克隆〔clone〕

系原代培養(yǎng)物經(jīng)首次傳代成功后即成為細(xì)胞系，強(qiáng)調(diào)細(xì)胞來源。

系通過選擇法或克隆形成法,從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中挑選出單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)形成的具特定生長特性的細(xì)胞培養(yǎng)物，強(qiáng)調(diào)細(xì)胞特性。

指取自新鮮組織的細(xì)胞在傳代前稱為原代培養(yǎng)。

指由一個(gè)細(xì)胞增值形成的群體后代。有關(guān)培養(yǎng)細(xì)胞的幾個(gè)概念體外培養(yǎng)的細(xì)胞繁值到一定程度就不再繁殖了〔由于外表接觸抑制〕，此時(shí)將細(xì)胞按一定比例創(chuàng)新分配到新的培養(yǎng)體系中，細(xì)胞就可以重新生長，這樣就可一代一代傳下去。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)根本條件無菌條件：超凈工作臺(tái)、紫外燈、高壓滅菌器、濾器、抗生素、電熱枯燥箱等。細(xì)胞生長條件：CO2培養(yǎng)箱、純水裝置、培養(yǎng)板〔瓶〕等。細(xì)胞檢測(cè)條件：倒置顯微鏡、酶標(biāo)儀等。細(xì)胞保存條件：液氮存儲(chǔ)裝置、-70度冰箱等。細(xì)胞營養(yǎng)條件：培養(yǎng)基、血清、pH等。細(xì)胞的長期保存與復(fù)蘇低溫冷凍保存〔液氮〕10％二甲基亞砜〔DMSO)慢速冷凍細(xì)胞程序降溫儀先4℃冰箱，后-20℃冰箱，最后液氮。細(xì)胞密度以2～5×106為宜。一定要作好標(biāo)記凍存細(xì)胞的復(fù)蘇

復(fù)蘇溫度：37～39℃水浴

快速復(fù)蘇1～3

℃/min至-30℃15～30℃/min至-196℃細(xì)胞培養(yǎng)物污染及其防治

細(xì)菌污染：用高濃度抗生素〔青、鏈霉素〕霉菌污染：用抗真菌藥〔制霉菌素、兩性霉素〕支原體污染：比較棘手，有人建議用卡那霉素、慶大霉素。一種抗原侵入人體后，在無數(shù)種淋巴細(xì)胞中，只有外表本來就帶有和這種抗原互補(bǔ)的受體的少數(shù)淋巴細(xì)胞能和抗原結(jié)合。一經(jīng)結(jié)合，這種淋巴細(xì)胞就恢復(fù)了分裂的能力，連續(xù)分裂產(chǎn)生大量帶有同樣抗體的淋巴細(xì)胞群。這一群細(xì)胞由于是同一來源的，所以稱為克隆(clone)，這就是克隆選擇學(xué)說。理論根底技術(shù)根底克隆選擇學(xué)說細(xì)胞融合技術(shù)微量蛋白檢測(cè)技術(shù)單克隆抗體技術(shù)來源：

?

分子水平：？細(xì)胞水平：？個(gè)體水平：？社會(huì)生活：？克隆概念嫁接分子〔基因〕克隆細(xì)胞克隆動(dòng)物克隆〔無性繁殖〕克隆是英文“clone〞的音譯，來自希臘文klon，原意為苗或嫩枝單克隆抗體的特點(diǎn)特異性均一性〔重復(fù)性〕可大量制備單克隆抗體的制備原理〔融合細(xì)胞的篩選〕基于酶缺陷和藥物抗性篩選融合細(xì)胞：最常用HAT培養(yǎng)基篩選系統(tǒng)。H為次黃嘌呤〔hypoxathine〕，A為氨基蝶呤〔aminopterin〕，T為胸腺嘧啶〔thymidine〕。目的性創(chuàng)新性可行性二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)〔條件、儀器〕超凈工作臺(tái)二氧化碳培養(yǎng)箱倒置顯微鏡液氮儲(chǔ)存器高壓滅菌器器超純水儀電熱恒溫枯燥箱三、實(shí)驗(yàn)器材的消毒干烤：玻璃器皿高壓蒸汽滅菌：玻璃、橡膠、金屬等，有時(shí)培養(yǎng)液過濾除菌：培養(yǎng)基、試劑等紫外線殺菌：實(shí)驗(yàn)室空氣、物臺(tái)，有時(shí)塑料制品射線殺菌：不耐熱物品熏蒸消毒：實(shí)驗(yàn)室、無菌室等化學(xué)消毒劑消毒：手、物品外表等抗原致敏淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞融合選擇性培養(yǎng)抗體分泌細(xì)胞篩選克隆化單抗制備單抗純化單抗鑒定動(dòng)物免疫別離脾細(xì)胞制備骨髓瘤細(xì)胞細(xì)胞融合〔PEG法〕HAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞陽性孔克隆化、擴(kuò)大培養(yǎng)再次克隆化克隆擴(kuò)大培養(yǎng)擴(kuò)大培養(yǎng)收集上清接種小鼠收集腹水單克隆抗體純化、保存、雜交瘤細(xì)胞凍存四、單克隆抗體制備過程單克隆抗體的應(yīng)用1.治療〔抗體的人源化、靶向作用〕單克隆抗體的應(yīng)用2.診斷

常用雙抗體夾心法：感染性疾病、病原體的分型及鑒定、腫瘤標(biāo)記物等。單克隆抗體的應(yīng)用3.研究試劑

最早用于親和層析純化抗原。目前已成為人類基因組學(xué)、蛋白組學(xué)研究的重要工具。單克隆抗體親和層析蛋白舉例〔賽百注射用纖溶酶〕單克隆抗體鑒定新蛋白舉例FunctionalanalysisState1State22DEPMFMS/MSLC-MS/MSDatabasesearchDifferentialanalysis?McAb五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告研究生《抗體技術(shù)》實(shí)驗(yàn)報(bào)告學(xué)號(hào)姓名專業(yè)、班實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)指導(dǎo)教師時(shí)間實(shí)驗(yàn)工程名稱：一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康乃?、分析與討論教師評(píng)語三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與步驟成績：簽名：日期：

日期課次

教學(xué)內(nèi)容

時(shí)數(shù)及方法授課教員備注理論實(shí)驗(yàn)

10.30（周一晚上）1實(shí)驗(yàn)一：?jiǎn)慰寺】贵w制備實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)二：細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室常用儀器設(shè)備4董文其李珍11.2（周四晚上）2實(shí)驗(yàn)三：實(shí)驗(yàn)器材的清洗、包裝和消毒實(shí)驗(yàn)四：細(xì)胞培養(yǎng)常用液4陳白虹11.6（周一晚上）3實(shí)驗(yàn)五：小鼠免疫實(shí)驗(yàn)六：細(xì)胞融合4董文其李珍11.9（周四晚上）4實(shí)驗(yàn)七：陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選4董文其李珍11.14（周二晚上）5實(shí)驗(yàn)八：雜交瘤細(xì)胞的擴(kuò)增、克隆化4董文其李珍11.16（周四晚上）6實(shí)驗(yàn)九：細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇實(shí)驗(yàn)十：?jiǎn)慰寺】贵w的鑒定4陳白虹張艷玲11.20（周一晚上）7實(shí)驗(yàn)十一：?jiǎn)慰寺】贵w的制備4