仿刺參補體AjC3部分基因的原核表達及多克隆抗體的制備.x課件_第1頁
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仿刺參補體AjC3部分基因的原核表達及多克隆抗體的制備補體C3(AjC3)在仿刺參的固有免疫系統(tǒng)中扮演著重要角色,是補體系統(tǒng)中含量最高的組成成分。補體AjC3產生的一系列裂解物C3a,C3b等能調節(jié)仿刺參免疫系統(tǒng)。補體AjC3還能夠通過形成溶膜復合物清除靶細胞。目前還沒有檢測仿刺參補體AjC3比較靈敏的工具。本實驗的目的是克隆AjC3部分基因片段,原核表達并純化重組蛋白,制備補體AjC3的多克隆抗體,為進一步研究仿刺參補體AjC3的免疫機制奠定基礎。利用PCR技術擴增AjC3基因片段,將該片段與表達載體pGS-21a連接,構建原核表達重組質粒。將鑒定正確的重組表達質粒轉化到Transetta(DE3)中,在不同溫度,時間,IPTG濃度下誘導表達。超聲破碎后,SDS分析重組蛋白的表達形式。表達的重組蛋白經鎳柱純化后,作為抗原免疫小鼠制備AjC3多克隆抗體。間接ELISA檢測抗體的效價,Westernblot檢測抗體的特異性及AjC3蛋白在各組織中的分布。PCR擴增得到長度分別為1185bp(1d),873bp(2d),555bp(3d)的目的片段;基因測序證明成功的構建了pGS-21a-1d,pGS-21a-2d,pGS-21a-3d重組質粒;其中pGS-21a-1d未表達蛋白質,pGS-21a-2d,pGS-21a-3d最佳誘導條件是30℃,0.2mmol/LIPTG,誘導6h;SDS分析表明pGS-21a-2d,pGS-21a-3d均以包涵體的形式表達。鎳柱純化后重組蛋白純度達到90%,pGS-21a-2d表達的重組蛋白分子量約為67KDa,pGS-21a-3d表達的重組蛋白分子量約為56KDa;間接ELISA檢測抗體效價分別為1:400,1:25600;Westernblot結果顯示多克隆抗體具有良好的特異性,AjC3蛋白在體腔液及體壁中均有分布。構建了重組表達載體pGS-21a-1d,pGS-21a-2d,pGS-21a-3d;純化獲得了重組蛋白;成功制備了具有高效價和特異性的補體AjC3多克隆抗

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