丙泊酚對(duì)肝細(xì)胞肝癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的抑制作用及機(jī)制研究

丙泊酚對(duì)肝細(xì)胞肝癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的抑制作用及機(jī)制研究第一部分丙泊酚抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的體外研究研究背景：丙泊酚是一種常用于腫瘤切除手術(shù)的靜脈麻醉藥,近年丙泊酚對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的抑制作用及對(duì)腫瘤免疫的影響逐漸受到關(guān)注。丙泊酚體外可以直接抑制人宮頸癌、纖維肉瘤、骨肉瘤等細(xì)胞系的侵襲能力首先被報(bào)道,隨后,體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)均證明丙泊酚能抑制乳腺癌細(xì)胞系的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移,關(guān)于食道癌、肺癌等離體細(xì)胞研究也證實(shí)了丙泊酚的抗癌作用。但是,丙泊酚對(duì)肝癌細(xì)胞的具體作用目前國(guó)內(nèi)外尚無報(bào)道。研究目的：本研究的目的是明確丙泊酚對(duì)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲能力的具體作用及初步機(jī)制。研究方法：1.不同濃度的丙泊酚與肝癌HepG2細(xì)胞、正常肝L-02細(xì)胞共培養(yǎng)。2.MTT法測(cè)定肝癌HepG2細(xì)胞、正常肝L-02細(xì)胞的細(xì)胞活性。3.酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)Caspase8、Caspase9活性表達(dá)。4.Transwell小室進(jìn)行細(xì)胞侵襲試驗(yàn)。5.明膠酶譜分析基質(zhì)屬蛋白酶-9的活性。6.westernblot測(cè)定MMP-9蛋白表達(dá)。研究結(jié)果1.丙泊酚抑制肝癌細(xì)胞HepG2(A)和正常肝細(xì)胞L02(B)的生長(zhǎng)。其中,正常細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的丙泊酚抗性。2.丙泊酚誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2產(chǎn)生細(xì)胞凋亡,并伴隨Caspase-8和Caspase-9活性的顯著增強(qiáng)。而且,HepG2細(xì)胞凋亡率的增加與丙泊酚作用濃度呈正相關(guān)趨勢(shì)。3.5ug/ml和10ug/m丙泊酚與HepG2細(xì)胞共培養(yǎng)后均能顯著降低HepG2細(xì)胞的附著力。4.分別用5、10μg/ml的丙泊酚處理HepG2細(xì)胞16小時(shí),MMP-9的活性呈劑量依賴性地降低,在HepG2細(xì)胞中的MMP-9的蛋白表達(dá)水平明顯降低。結(jié)論：臨床相關(guān)濃度的丙泊酚能夠濃度依賴誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2凋亡,可能與激活凋亡蛋白Caspase-8和Caspase-9有關(guān)。丙泊酚也能抑制HepG2的侵襲能力,明顯抑制HepG2細(xì)胞MMP-9的活性。丙泊酚對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用是多方面的,所以詳細(xì)的機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。第二部分丙泊酚通過上調(diào)巨噬細(xì)胞及微泡中miR-142-3p發(fā)揮抗肝癌作用的研究研究背景：本研究第一部分發(fā)現(xiàn)丙泊酚能夠?qū)﹄x體肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移發(fā)揮抑制作用,但是這對(duì)指導(dǎo)臨床還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠,我們進(jìn)一步研究其作用機(jī)制,研究丙泊酚抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的動(dòng)物實(shí)驗(yàn),特別是丙泊酚對(duì)機(jī)體免疫功能的影響。巨噬細(xì)胞具有異質(zhì)性和多樣性,在不同微環(huán)境信號(hào)刺激下,能分化成為生物學(xué)功能相反的亞群。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞作為腫瘤免疫微環(huán)境中最豐富的免疫細(xì)胞,受到腫瘤細(xì)胞的募集與其他基質(zhì)細(xì)胞一起共同構(gòu)成腫瘤免疫微環(huán)境。肝癌患者體內(nèi)巨噬細(xì)胞集落刺激因子水平升高可預(yù)測(cè)肝癌術(shù)后轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)情況。對(duì)多種腫瘤的研究表明,miRNA在腫瘤致病過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用,miR-142-3p在抑制肝癌細(xì)胞遷移和侵襲中起著重要的作用,而增強(qiáng)miR-142-3p的表達(dá)可以抑制腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的分化,發(fā)揮抗腫瘤作用。微泡中負(fù)載包括miRNA在內(nèi)的多中生物活性分子,共同組成“信號(hào)復(fù)合體”。巨噬細(xì)胞受到誘導(dǎo)后釋放富含信息的微泡,通過釋放到胞外環(huán)境的這些微泡,將信息物質(zhì)傳遞給周圍及遠(yuǎn)處的腫瘤細(xì)胞發(fā)揮相應(yīng)的作用。已有研究證明丙泊酚可以減少巨噬細(xì)胞釋放的活性氧家族,發(fā)揮抗腦膠質(zhì)瘤的作用,本部分研究假設(shè)丙泊酚能夠活化腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞,上調(diào)miR-142-3p表達(dá)并刺激腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞分泌富含miR-142-3p的微泡,通過微泡發(fā)揮抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲的能力。研究目的：本研究假設(shè)丙泊酚能夠活化腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞,上調(diào)miR-142-3p的表達(dá),并刺激腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞分泌微泡,微泡運(yùn)送miR-142-3p到肝癌細(xì)胞,從而抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。實(shí)驗(yàn)方法：1.建立肝癌細(xì)胞系Hepa1-6小鼠皮下移植瘤模型；差速離心分離血漿中MVs,根據(jù)處理藥物的不同對(duì)荷瘤小鼠分組,共分8組：(1)20mg/kg丙泊酚；(2)100μg/kgclodrolip;(3)20mg/kg丙泊酚+100μg/kgclodrolip;(4)50mg/kg丙泊酚；(5)50mg/kg丙泊酚+100μg/kgclodrolip;(6)20μgMVs;(7)miR-142-3p抑制劑；(8)20mg/kg丙泊酚+miR-142-3p抑制劑。荷瘤小鼠處死后測(cè)量腫瘤體積和重量。2.分離荷瘤小鼠TAMs并與肝癌Hepal-6細(xì)胞共培養(yǎng),(?)ranswell小室進(jìn)行細(xì)胞侵襲試驗(yàn)。3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定各組提取的巨噬細(xì)胞、微泡及肝癌Hepa1-6細(xì)胞內(nèi)的miR-142-3p含量,使用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染miR-142-3p抑制劑給肝癌細(xì)胞荷瘤小鼠或巨噬細(xì)胞后測(cè)定miR-142-3p含量。結(jié)果：1.丙泊酚抑制肝細(xì)胞癌荷瘤小鼠腫瘤的生長(zhǎng)。2.丙泊酚處理后的腫瘤組織TAMs可上調(diào)Hepa1-6細(xì)胞miR-142-3p的表達(dá)。3.丙泊酚刺激巨噬細(xì)胞miR-142-3p表達(dá)升高并作用于Hepa1-6細(xì)胞。4