川丁特羅代謝與排泄研究

川丁特羅代謝與排泄研究川丁特羅,2-(3-氯-4-氨基-5-(三氟甲基)苯基)-2-(叔丁氨基)-乙醇,是沈陽藥科大學(xué)藥化實驗室自主合成的一種結(jié)構(gòu)全新的β2-腎上腺素受體激動劑。川丁特羅具有選擇性高、低毒、長效等特點,在中國正處于Ⅲ期臨床研究階段。本論文的研究目的是結(jié)合多種方法制備川丁特羅代謝物對照品,并對其進行結(jié)構(gòu)鑒定,系統(tǒng)研究川丁特羅在大鼠體內(nèi)、微生物模型及大鼠和人體外肝微粒體孵育體系中的代謝情況,并利用獲得的代謝物對照品,研究川丁特羅及其主要代謝物在大鼠體內(nèi)的排泄情況,以及對川丁特羅的主要代謝物進行酶表型確認研究。為全面評價川丁特羅的有效性和安全性提供依據(jù)并為臨床安全、合理用藥提供指導(dǎo)。一、川丁特羅代謝物對照品的制備及結(jié)構(gòu)鑒定建立了短刺小克銀漢霉AS3.970的微生物模型,并進行了轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化,用于川丁特羅在微生物體內(nèi)的代謝研究及代謝產(chǎn)物的制備。通過對川丁特羅的短刺小克銀漢霉AS3.970制備規(guī)模的轉(zhuǎn)化液樣品和大鼠多劑量灌胃給予川丁特羅后收集的尿液樣品中的代謝物的分離純化,獲得了5種代謝物對照品;設(shè)計并優(yōu)化了川丁特羅羥胺衍生物的合成方法,通過同生物體內(nèi)代謝物色譜和質(zhì)譜行為的比較,確認其為川丁特羅體內(nèi)代謝物之一。綜合運用核磁共振光譜(NMR)、電噴霧離子化質(zhì)譜(ESI-MS/MS)和飛行時間高分辨質(zhì)譜(TOF-MS)對制備得到的6種代謝物對照品進行結(jié)構(gòu)鑒定,確定其分別為:2-(3-氯-4-(羥基氨基)-5-(三氟甲基)苯基)-2-(叔丁氨基)-乙醇(即川丁特羅芳香羥胺代謝物,M2)、2-(3-氯-4-氨基-5-(三氟甲基)苯基)-2-(2-羥基-1,1-二甲基)乙氨基-乙醇(即川丁特羅叔丁基羥基取代代謝物,M3)、2-(3-氯-4-氨基-5-(三氟甲基)苯基)-2-(叔丁氨基)-乙酸(即1-羧基川丁特羅,M4)、2-(3-甲基亞磺?；?4-氨基-5-(三氟甲基)苯基)-2-(叔丁氨基)-乙醇(即川丁特羅甲基亞砜取代代謝物,包含一對差向異構(gòu)體,M5和M6)和2-(3-甲磺?；?4-氨基-5-(三氟甲基)苯基)-2-(叔丁氨基)-乙醇(即川丁特羅甲基砜取代代謝物,M7)。除M4外,其余均為首次制備得到的代謝物對照品。其中,川丁特羅芳香羥胺代謝物(M2)具有不穩(wěn)定的性質(zhì),容易發(fā)生氧化還原反應(yīng),本實驗初步考察了其穩(wěn)定性并進行了探討,發(fā)現(xiàn)其在酸性條件下最為穩(wěn)定。實驗中獲得的代謝物對照品可用于川丁特羅代謝物結(jié)構(gòu)鑒定、體內(nèi)排泄及酶表型確認研究。二、川丁特羅大鼠體內(nèi)及微生物模型中的代謝研究采用HPLC-MS/MS分析方法,綜合分析代謝產(chǎn)物的準分子離子和多級碎片離子,并與6種代謝產(chǎn)物對照品比較,結(jié)合藥物體內(nèi)代謝規(guī)律,系統(tǒng)研究川丁特羅在大鼠體內(nèi)和微生物模型中的代謝情況,鑒定了代謝物結(jié)構(gòu)。共檢測到20種代謝物,包括4種Ⅰ相代謝物:苯環(huán)單羥基取代代謝物(M1)、芳香羥胺代謝物(M2)、叔丁基單羥基取代代謝物(M3)和1-羧基川丁特羅(M4);16種Ⅱ相代謝物:川丁特羅N-或O-葡萄糖醛酸結(jié)合物(M8和M9)、單羥基取代川丁特羅的葡萄糖醛酸結(jié)合物(M10、M11和M12)、乙?；x物(M13)、川丁特羅N-或O-葡萄糖結(jié)合物(M18、M19)、硫酸結(jié)合物(M20)、川丁特羅脫氯后的谷胱甘肽結(jié)合物(M14)及其進一步發(fā)生分解、氧化代謝生成的次級代謝產(chǎn)物,即半胱氨酰甘氨酸結(jié)合物(M15)、半胱氨酸結(jié)合物(M16)、乙酰半胱氨酸結(jié)合物(M17)、甲基亞砜取代代謝物(M5和M6)和甲基砜取代代謝物(M7),其中13種為首次檢測到的代謝物。觀察到大鼠體內(nèi)代謝途徑主要單羥基化、C-氧化、乙酰化、葡萄糖醛酸化,這些代謝途徑還可能相互交叉,生成次級代謝產(chǎn)物。此外,還發(fā)現(xiàn)了一種新的重要的代謝途徑,即谷胱甘肽結(jié)合及其進一步發(fā)生分解代謝、氧化代謝途徑。在微生物模型中發(fā)現(xiàn)5種代謝途徑,除了同體內(nèi)代謝途徑相同的單羥基化、C-氧化及乙?；?還首次發(fā)現(xiàn)了葡萄糖結(jié)合和硫酸結(jié)合代謝途徑,微生物模型中未發(fā)現(xiàn)這些代謝途徑的相互交叉及生成的次級代謝產(chǎn)物。川丁特羅在大鼠體內(nèi)和微生物模型中的代謝差異主要體現(xiàn)在Ⅱ相代謝物的種類。此結(jié)果說明微生物轉(zhuǎn)化可以作為研究藥物體內(nèi)代謝的一個重要工具,但是其只能部分替代實驗動物,而不可能將其完全取代。三、川丁特羅及其主要代謝物在大鼠體內(nèi)排泄研究為了深入了解川丁特羅及其主要代謝物大鼠體內(nèi)排泄情況,建立了同時測定大鼠尿液和糞便樣品中川丁特羅及及代謝物M2、M3、M4和M7濃度的HPLC-MS/MS方法,該法專屬、快速、靈敏、準確,成功應(yīng)用于川丁特羅灌胃給予大鼠后的排泄實驗研究。同時通過對經(jīng)葡萄糖苷酸酶水解后尿液樣品的分析,計算得到川丁特羅及代謝物M2、M3的葡萄糖醛酸結(jié)合物的累計排泄量占給藥劑量的百分比。大鼠灌胃給予川丁特羅后,原形藥、M2、M3、M4、M7、原型的葡萄糖醛酸結(jié)合物及M2和M3的葡萄糖醛酸結(jié)合物物的累積排泄總量約為給藥劑量的28%。針對上述幾種形式而言,尿液是最主要的排泄途徑,其次是糞便,二者的比值約為7.6:1。代謝物M4是川丁特羅最主要的排泄形式,其次是原型和M2,它們的累積排泄量分別約占劑量的12.72%、4.40%和4.36%。原型藥從糞便排泄的比例略高于尿液,M3和M4主要從尿液排泄,其它幾種代謝物(M2、M7和葡萄糖醛酸結(jié)合物)則僅從尿液排泄。四、川丁特羅體外代謝物鑒定及代謝物M2和M3的CYP450酶表型確認研究采用同體內(nèi)代謝物鑒定相同的分析方法,以NADPH作為輔因子,研究了川丁特羅在大鼠肝微粒體和人肝微粒體中的代謝情況,結(jié)果顯示,二者產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物相同,包括兩種單羥基化代謝物(M2和M3)、一種C-氧化代謝物M4以及一種Ⅱ相的乙?；x物(M13),提示川丁特羅在大鼠和人體的Ⅰ相代謝不存在明顯的種屬差異,且CYP450酶對川丁特羅的代謝消除起著十分重要的作用。從質(zhì)譜響應(yīng)來看,M2和M3是川丁特羅最主要的體外CYP450酶系統(tǒng)代謝產(chǎn)物。建立了同時測定人肝微粒體和重組酶中代謝物M2和M3的UPLC-MS/MS方法,用于進行川丁特羅兩個主要代謝物的酶表型確認研究,并進行了方法學(xué)驗證。結(jié)合化學(xué)抑制劑法和重組酶法,考察了六種重組酶CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4和CYP2E1,并最終確定CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4可催化川丁特羅生成芳香羥胺代謝物M2,且CYP2C19具有最大的親和力和最高反應(yīng)速度及最大的內(nèi)在清除率;CYP2C19和CYP3A4均可催化川丁特羅