單核細(xì)胞趨化蛋白-1和核因子-b與冠狀動脈粥樣硬化斑塊形成及狹窄的關(guān)系

單核細(xì)胞趨化蛋白-1和核因子-b與冠狀動脈粥樣硬化斑塊形成及狹窄的關(guān)系

冠狀動脈硬化是冠狀動脈硬化最常見的原因。大量研究表明,炎癥反應(yīng)對動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)的形成起著關(guān)鍵性的作用,尤其是單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng),在粥樣斑塊的形成、發(fā)展及破裂的過程中都起到重要的作用。因此,研究與炎癥反應(yīng)有關(guān)的各種因子,特別是與單核巨噬細(xì)胞浸潤有關(guān)的因子,對于了解動脈粥樣硬化的形成是至關(guān)重要的。核因子-kappaB(nuclearfactor-kappaB,NF-κB)是調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵性因子,并參與了許多與炎癥反應(yīng)有關(guān)的基因的表達(dá)調(diào)控。單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocytechemotacticprotein-1,MCP-1)是一種趨化因子,在AS的發(fā)生與發(fā)展過程中都起到重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)它的表達(dá)與NF-κB有著密切的關(guān)系。有關(guān)動物實(shí)驗(yàn)表明國產(chǎn)紅葡萄酒可顯著抑制食餌性AS時所致的NF-κB的活化,并下調(diào)MCP-1mRNA的表達(dá)。但國內(nèi)尚未見應(yīng)用人體冠狀動脈粥樣硬化的標(biāo)本來研究兩者的表達(dá)情況及其相關(guān)性的報道。本研究通過應(yīng)用組織形態(tài)測量分析,組織化學(xué)染色和免疫組織化學(xué)檢測等方法,選取人冠狀動脈粥樣硬化的標(biāo)本,研究NF-κB和MCP-1與單核巨噬細(xì)胞浸潤、粥樣斑塊的形成以及血管管腔進(jìn)行性狹窄的關(guān)系,以及兩者的相關(guān)性。從而為臨床研究如何預(yù)防和治療冠狀動脈粥樣斑塊的形成及血管管腔狹窄提供一個新的思路。1材料和方法1.1前降支動脈u39例2001～2004年尸檢冠狀動脈左前降支動脈粥樣硬化(選取非動脈分支處,垂直于冠狀動脈長軸)的蠟塊標(biāo)本,年齡為21～77歲,平均年齡51.8歲。1.2一般病理檢查和組1.2.1切割和染色選定標(biāo)本經(jīng)常規(guī)10%福爾馬林固定、脫水、透明、石蠟包埋及切片。進(jìn)行HE及彈力纖維染色。部分切片水化后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。1.2.2血管內(nèi)皮彈性膜的測量彈力纖維染色切片用于血管的組織形態(tài)測量,通過NIHScionImage(60.1)軟件系統(tǒng),分別測量出血管內(nèi)、外彈性膜周長,內(nèi)腔面周長,以及粥樣斑塊周長。根據(jù)其測量結(jié)果,分別計算出:血管截面積、血管中膜面積、血管內(nèi)膜面積及內(nèi)膜粥樣斑塊面積。正常血管內(nèi)膜由單層內(nèi)皮細(xì)胞及其下的內(nèi)彈性膜構(gòu)成。本研究以內(nèi)彈性膜周長構(gòu)成的面積為正常血管內(nèi)腔面積,計算血管的狹窄程度。1.2.3組根據(jù)血管的狹窄程度將其分為三組:即A組(<50%),B組(50%～75%),C組(>75%)。1.3免疫組織化學(xué)檢測1.3.1免疫藥物和試劑鼠抗人平滑肌細(xì)胞α-actin單克隆抗體,鼠抗人單核巨噬細(xì)胞CD-68單克隆抗體,均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司;鼠抗人NF-κBp65單克隆抗體,羊抗人MCP-1多克隆抗體,均購自北京中山生物技術(shù)有限公司。SP超敏試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司(用于α-actin,CD-68,NF-κBp65的檢測),MCP-1的二抗為辣根酶標(biāo)記的兔抗山羊IgG購自于北京中山生物技術(shù)有限公司。前兩種抗體為即用型,NF-κBp65和MCP-1均為濃縮型,其工作液濃度分別為1:50和1:100。1.3.2復(fù)抗原的檢測采用SP法,石蠟切片脫蠟和水化后,3%H2O2-甲醇消化內(nèi)源性過氧化物酶的活性,修復(fù)抗原(NF和MCP-1采用煮沸熱修復(fù),CD68采用胰酶修復(fù)),0.5%小牛血清白蛋白封閉非特異性抗體,滴加一抗,滴加生物素化的二抗,滴加鏈霉菌抗生物素蛋白——過氧化酶,DAB顯色,水洗,蘇木素復(fù)染,脫水、透明、中性樹膠封片。顯微鏡下觀察結(jié)果。1.3.3評估結(jié)果(1)血管內(nèi)皮和中膜平滑細(xì)胞數(shù)的計算依據(jù)SMCα-actin染色,隨機(jī)選擇4個不同視野下(×400)的區(qū)域,分別計數(shù)血管內(nèi)膜和中膜的平滑肌細(xì)胞數(shù)。兩人分別計數(shù)取其均值,即為該血管內(nèi)膜或中膜的平滑肌細(xì)胞密度。(2)+xdm的細(xì)胞數(shù)依據(jù)CD68染色,分別計數(shù)血管截面的內(nèi)膜、中膜及外膜的巨噬細(xì)胞數(shù)。兩人分別計數(shù)取其均值,即為該血管內(nèi)膜、中膜及外膜的巨噬細(xì)胞密度。(3)切片的陽性強(qiáng)度參照許良中等的免疫組織化學(xué)反應(yīng)結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn),綜合考慮切片中陽性細(xì)胞占所觀察同類細(xì)胞數(shù)的百分比和陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度兩項指標(biāo),半定量判斷結(jié)果。根據(jù)切片中陽性細(xì)胞占計數(shù)細(xì)胞百分比分為4級:≤5%為0分;6%～25%為1分;26%～50%為2分;≥51%為3分。根據(jù)顯色程度判斷陽性強(qiáng)度:基本不著色者為0分;著色淡黃色者為1分;棕黃色者為2分;棕褐色者為3分。將每張切片著色程度得分與著色細(xì)胞百分率得分相乘,為其最后得分。0～1為陰性(-);2～3分為弱陽性(+);4～6分為中等陽性(++);6分以上為強(qiáng)陽性(+++)。1.4參數(shù)等級相關(guān)性檢驗(yàn)應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計軟件中的t檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)、非參數(shù)等級相關(guān)性(Spearsman)檢驗(yàn)。三組間比較用One-WayANOVA檢驗(yàn),用Bonferroni方法進(jìn)行兩兩比較。P<0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1組間血管內(nèi)皮面積及血管內(nèi)皮可達(dá)方差的分析組織學(xué)觀察及測量結(jié)果顯示所檢測的冠狀動脈血管外徑基本一致,且血管中膜面積基本相同,然而血管內(nèi)膜面積及血管內(nèi)徑顯示三組間存在有顯著性差異(P<0.001,表1)。此結(jié)果表明,血管內(nèi)膜的增厚是導(dǎo)致血管狹窄的主要原因。2.2兩組亞群的劃分粥樣斑塊出現(xiàn)于狹窄程度>50%的冠狀動脈中(B組、C組)。同時B、C兩組中粥樣斑塊面積占內(nèi)膜面積的比例各異。以其所占內(nèi)膜面積是否>20%和30%為界,將它們分為兩組亞群B1、B2;C1、C2(表2)。2.3兩組平滑細(xì)胞密度和百分率的比較中膜平滑肌細(xì)胞密度隨內(nèi)膜增厚而逐漸減少;而內(nèi)膜非粥樣斑塊區(qū)域中膜平滑肌細(xì)胞密度基本一致,極少有平滑肌細(xì)胞出現(xiàn)于粥樣斑塊區(qū)域(表1,圖1)。A組的平滑肌細(xì)胞密度與B組和C組存在顯著性差異(P<0.01)。1)B2組與B1組比較;2)C2組與C1組比較B2亞組的百分率明顯大于B1亞組,P<0.001;C2亞組的百分率明顯大于C1亞組,P<0.0012.4阿斯塔納的不同代爾a、b、c組中膜光整浸質(zhì)充質(zhì)分布免疫組織化學(xué)染色顯示:CD68陽性細(xì)胞廣泛存在于冠狀動脈的外膜、中膜及內(nèi)膜(圖2)。外膜巨噬細(xì)胞浸潤無明顯差異。B組及C組中中膜內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤明顯大于A組(P<0.01)(表1),提示中膜巨噬細(xì)胞的浸潤參與了血管中膜的平滑肌細(xì)胞的代謝和生存。內(nèi)膜中巨噬細(xì)胞浸潤與內(nèi)膜增厚及粥樣斑塊形成相并行。特別是B、C組的不同亞組中,內(nèi)膜的巨噬細(xì)胞浸潤呈顯著性差異(P<0.05)(表3),說明在斑塊越大的亞組中巨噬細(xì)胞浸潤的數(shù)目越多。1)B2組與B1組比較,P<0.05;2)C2組與C1組比較,P<0.052.5as中mcp-1表達(dá)情況免疫組織化學(xué)檢測顯示NF-κB和MCP-1陽性反應(yīng)主要存在于血管內(nèi)膜區(qū)域,在內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞及巨噬細(xì)胞中表達(dá)(圖3、4)。兩者在內(nèi)膜的表達(dá)強(qiáng)度均為C組>B組>A組(表4、5)。如表4所示,在39例AS中,NF-κB在31例中有表達(dá)(+～+++),其陽性率為79.5%(31/39)。其中A組陽性率50%(5/10),B組陽性率83.3%(15/18),C組陽性率100%(11/11)。在各組中,NF-κB的表達(dá)均存在顯著性差異,A組與B組比較,P<0.05,B組與C組比較,P<0.01,A組與C組比較,P<0.001。如表5所示,在39例AS中,MCP-1在26例中有表達(dá)(+～+++),其陽性率為64.1%(25/39)。其中A組陽性率20%(2/10),B組陽性率66.7%(12/18),C組陽性率100%(11/11)。在各組中,MCP-1的表達(dá)均存在顯著性差異,A組與B組比較,P<0.05,B組與C組比較,P<0.01,A組與C組比較,P<0.001。用spearsman等級相關(guān)性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NF-κB的表達(dá)與MCP-1的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.632,P<0.001)(表6)。3mtp-b表達(dá)對動脈硬性的調(diào)節(jié)本實(shí)驗(yàn)通過對尸檢標(biāo)本的冠狀動脈左前降支的蠟塊標(biāo)本的研究,對造成冠狀動脈粥樣硬化斑塊的形成及其管腔進(jìn)行性狹窄的一些因素有了進(jìn)一步的認(rèn)識。本實(shí)驗(yàn)通過對不同狹窄程度的冠狀動脈的研究發(fā)現(xiàn),血管的狹窄主要是與內(nèi)膜的增厚有關(guān)。既往的研究曾提出內(nèi)膜的增厚不僅與斑塊的大小有關(guān),而且與中膜的平滑肌細(xì)胞的遷入和增殖有關(guān)。作者研究發(fā)現(xiàn)在三組內(nèi)膜中均有平滑肌細(xì)胞的出現(xiàn),在內(nèi)膜非粥樣斑塊區(qū)域平滑肌細(xì)胞密度基本一致,極少的平滑肌細(xì)胞出現(xiàn)于粥樣斑塊區(qū)域,說明平滑肌細(xì)胞的遷入和增殖在內(nèi)膜的增厚過成中并不占主導(dǎo)地位。同時,本研究還發(fā)現(xiàn)粥樣斑塊的面積占內(nèi)膜面積的百分比三組間明顯不同,B組和C組明顯大于A組,此結(jié)果說明粥樣斑塊的形成是導(dǎo)致內(nèi)膜增厚的主要原因,也是導(dǎo)致血管管腔進(jìn)行性狹窄的主要根源。有研究證明巨噬細(xì)胞在粥樣斑塊的構(gòu)成、發(fā)展和破裂的過程中起到重要的作用,其可以導(dǎo)致急性冠脈綜合征。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)在不同狹窄程度的冠狀動脈的管壁中巨噬細(xì)胞的浸潤明顯不同。B組和C組的巨噬細(xì)胞浸潤明顯高于A組,而在B組和C組又尤以B2亞組和C2亞組為多。在粥樣斑塊面積越大的部位巨噬細(xì)胞的含量亦越高。此結(jié)果說明巨噬細(xì)胞的浸潤直接或間接參與了粥樣斑塊的形成及血管的狹窄。MCP-1作為一種趨化因子,不僅能夠促進(jìn)單核細(xì)胞在粥樣斑塊處的浸潤,而且能促進(jìn)血管壁平滑肌細(xì)胞的增殖,對動脈粥樣硬化的形成起到重要的作用。本次實(shí)驗(yàn)研究中,作者應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測了冠狀動脈粥樣硬化中MCP-1的表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)在B組和C組中巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞中都有MCP-1的表達(dá),尤其是在巨噬細(xì)胞(主要是泡沫細(xì)胞)聚集處表達(dá)最明顯。提示MCP-1在巨噬細(xì)胞浸潤及粥樣斑塊形成過程中起到了重要的作用。NF-κB作為一種炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)因子,長時間以來一直被認(rèn)為是一種重要的致動脈粥樣硬化發(fā)生的因子,主要是由于它對一些致動脈粥樣硬化的炎癥基因的調(diào)節(jié)作用,包括介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6等;細(xì)胞黏附分子如VCAM-1、ICAM-1等;趨化因子如MCP-1、IL-8等等。同時有研究證實(shí),阻斷NF-κB的表達(dá)能顯著抑制炎癥相關(guān)因子的產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)中,作者檢測了NF-κB在冠狀動脈粥樣硬化病變處的表達(dá),發(fā)現(xiàn)NF-κB主要表達(dá)于斑塊處的巨噬細(xì)胞(主要是泡沫細(xì)胞)、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞漿(強(qiáng)陽性者在細(xì)胞核也有表達(dá)),尤以在巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞處表達(dá)最為明顯,說明NF-κB在巨噬細(xì)胞浸潤及粥樣斑塊形成的過程中