線粒體轉(zhuǎn)氫酶-1（TH-1）試劑盒說(shuō)明書

第第頁(yè)線粒體轉(zhuǎn)氫酶—1（TH—1）試劑盒說(shuō)明書線粒體轉(zhuǎn)氫酶1（TH1）試劑盒說(shuō)明書微量法100管/96樣注意：正式測(cè)定前務(wù)必取23個(gè)預(yù)期差別較大的樣本做猜測(cè)定測(cè)定意義：TH位于線粒體的內(nèi)膜上，又稱為呼吸電子傳遞鏈復(fù)合體六，催化NADH+NADP+和NAD++NADPH相互轉(zhuǎn)化。催化正向反應(yīng)稱為TH1.線粒體NADH含量加添時(shí)會(huì)導(dǎo)致線粒體膜的H+電化學(xué)梯度升高，因而促進(jìn)了電子傳遞鏈上ROS的產(chǎn)生。TH1促進(jìn)NADH轉(zhuǎn)換為NADPH，從而提高線粒體的抗氧化本領(lǐng)。測(cè)定原理：NADH和NADPH均在340nm有特征汲取，因此TH催化的轉(zhuǎn)氫反應(yīng)不能導(dǎo)致340nm吸光度發(fā)生變動(dòng)。用人工合成底物3乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸磷酸（APADP+）替代NADP+，TH1催化APADP+還原生成的APADPH在375nm有特征光汲取，因此通過(guò)測(cè)定375nm光汲取加添速率，來(lái)計(jì)算TH1活性。需自備的儀器和用品：可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。試劑的構(gòu)成和配制：試劑一：液體100mL×1瓶，20℃保管；試劑二：液體50mL×1瓶，20℃保管；試劑三：液體18mL×1瓶，4℃保管；試劑四：粉劑×1支，20℃保管；試劑五：粉劑×1支，20℃保管；樣本的前處理：組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分別：①準(zhǔn)確稱取0.1g組織或收集500萬(wàn)細(xì)胞，加入1mL試劑一，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。②將勻漿600g，4℃離心5min。③棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11100g，4℃離心10min。④上清液即為除掉線粒體的胞漿蛋白，可用于測(cè)定從線粒體泄漏的TH1（此步可選做）。⑤步驟④中的沉淀即為線粒體，加入500uL試劑二，超聲波碎裂（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10秒，重復(fù)30次），用于TH1活性測(cè)定。測(cè)定步驟：1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)整波長(zhǎng)至375nm，蒸餾水調(diào)零。2、樣本測(cè)定（1）工作液的配制：臨用前將試劑四、五轉(zhuǎn)移到試劑三中混合溶解，置于37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴5min；用不完的試劑分裝后20℃保管，禁止反復(fù)凍融。（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入20μL樣本和180μL工作液，混勻，立刻記錄375nm處初始吸光值A(chǔ)1和10min后的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA=A2A1.TH1活性計(jì)算：a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmolAPADPH定義為一個(gè)酶活性單位。TH1活性（nmol/min/mgprot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（V樣×Cpr）÷T=149×ΔA÷Cpr（2）按樣本鮮重計(jì)算單位的定義：每g組織每分鐘產(chǎn)生1nmolAPADPH定義為一個(gè)酶活性單位。TH1活性（nmol/min/g鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（W×V樣÷V樣總）÷T=74.5×ΔA÷W（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1nmolAPADPH定義為一個(gè)酶活性單位。TH1活性（nmol/min/104cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（500×V樣÷V樣總）÷T=0.149×ΔAV反總：反應(yīng)體系總體積，2×104L；ε：APADPH摩爾消光系數(shù)，6.7×103L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.02mL；V樣總：加入提取液體積，0.5mL；T：反應(yīng)時(shí)間，10min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)。b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1nmolAPADPH定義為一個(gè)酶活性單位。TH1活性（nmol/min/mgprot）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（V樣×Cpr）÷T=298×ΔA÷Cpr（2）按樣本鮮重計(jì)算單位的定義：每g組織每分鐘產(chǎn)生1nmolAPADPH定義為一個(gè)酶活性單位。TH1活性（nmol/min/g鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（W×V樣÷V樣總）÷T=149×ΔA÷W（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1nmolAPADPH定義為一個(gè)酶活性單位。TH1活性（nmol/min/104cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷（500×V樣÷V樣總）÷T=0.298×ΔAV反總：反應(yīng)體系總體積，2×104L；ε：APADPH摩爾消光系數(shù)，6.7×103L/mol/cm；d：96