復(fù)元膠囊含藥血清對(duì)體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞凋亡及p38絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路的影響

復(fù)元膠囊含藥血清對(duì)體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞凋亡及p38絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路的影響

0復(fù)元膠囊對(duì)snp誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡的信號(hào)檢測(cè)軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨中唯一的細(xì)胞，在軟骨的形成、代謝和恢復(fù)中起著非常重要的作用。在骨關(guān)節(jié)炎的過(guò)程中，軟骨細(xì)胞的死亡被認(rèn)為是關(guān)節(jié)軟骨退行性改變的病理因素之一。然而，關(guān)于在國(guó)內(nèi)外從信號(hào)轉(zhuǎn)移到治療骨關(guān)節(jié)炎的藥物的報(bào)道很少。復(fù)元湯由人參、陰陽(yáng)虛羊茅、鹿茅、黃甘草、川藥、當(dāng)歸、枸杞、三七等組成。這是一種長(zhǎng)期治療骨關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)制劑，在復(fù)元膠囊中含有藥物對(duì)sph對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的影響，并從信號(hào)轉(zhuǎn)移到治療骨關(guān)節(jié)炎的角度探討了其功能機(jī)制。1材料和方法1.1試劑和儀器雄性3wk齡清潔級(jí)SD大鼠10只,平均體質(zhì)量(50±5)g;雄性成年普通級(jí)SD大鼠20只,平均體質(zhì)量(220±10)g(由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供).復(fù)元膠囊由曬參、淫羊藿、鹿茸、黃芪、川芎、當(dāng)歸、枸杞子、三七等組成,委托重慶希爾安藥業(yè)有限責(zé)任公司制成膠囊,僅供實(shí)驗(yàn)使用.SNP粉針劑(批號(hào):H111021635,北京雙鶴現(xiàn)代醫(yī)藥技術(shù)有限責(zé)任公司);FD(F12∶DMEM=1∶1)培養(yǎng)基、優(yōu)級(jí)胎牛血清(美國(guó)Hyclone公司);Ⅱ型膠原酶(美國(guó)Sigma公司);胰蛋白酶(美國(guó)Gibic公司);總蛋白提取試劑盒(中國(guó)升博生物公司);P38MAPK抑制劑SB203580(中國(guó)上?？党缮锕?;AnnexinV-FITC試劑盒(中國(guó)晶美生物工程有限公司);Caspase-3比色法檢測(cè)試劑盒(美國(guó)BioVision公司);磷酸化抗體P38(美國(guó)cellsignaing公司);P53抗體、蛋白內(nèi)參β-actin(美國(guó)SantaCruz公司);PBS緩沖液、辣根酶標(biāo)記兔抗山羊IgG(中國(guó)北京中衫生物技術(shù)有限公司);免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑(中國(guó)碧云天生物公司);PVDF膜(美國(guó)Millipore公司);SW-CJ-2A型凈化工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司);2001-13型二氧化碳培養(yǎng)箱(上海常思工貿(mào)有限公司);CK-2型倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS公司);7500型透射電鏡(日本HITACHI公司);FACSAria型流式細(xì)胞分析儀(美國(guó)BD公司);凝膠成像儀(美國(guó)BioRad公司);ELX800型酶標(biāo)儀(德國(guó)Gene公司).1.2方法1.2.1消化酶的消化參照文獻(xiàn)的方法,將大鼠斷頸處死后,無(wú)菌條件下分離股骨頭,浸入含青霉素和鏈霉素的雙抗水中漂洗3次,FD培養(yǎng)基中漂洗3次;將軟骨剪成1mm3大小,移入2.5g/L胰蛋白酶中,37℃水浴箱中消化30min;胎牛血清終止消化,PBS緩沖液清洗2遍;再加入2g/LⅡ型膠原酶,37℃水浴箱消化,每30min輕輕搖蕩1次,4h后消化成絮狀;1000r/min離心5min,棄上清,PBS緩沖液清洗2遍;加入含150mL/L胎牛血清的FD培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液,用200目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾后接種于培養(yǎng)瓶中,置于37℃,50mL/LCO2培養(yǎng)箱進(jìn)行原代培養(yǎng).倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞長(zhǎng)滿80%后傳代培養(yǎng),Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定細(xì)胞.1.2.2對(duì)10倍等效劑量的影響雄性成年SD大鼠20只,隨機(jī)分為復(fù)元膠囊組(10只)和對(duì)照組(10只).復(fù)元膠囊組按Meeh-Rubner氏公式給予10倍等效劑量藥物,充分溶于生理鹽水后灌胃;對(duì)照組給予等體積的生理鹽水灌胃,每日2次,連續(xù)3d.末次灌胃后2h心臟取血,4℃靜置過(guò)夜,3000r/min離心20min,取上清,經(jīng)0.22μm抽濾除菌后,分裝,-20℃保存?zhèn)溆?1.2.3培養(yǎng)基的制備實(shí)驗(yàn)分為正常組(含150mL/L胎牛血清的FD培養(yǎng)基正常培養(yǎng))、模型組(2mmol/LSNP+FD培養(yǎng)基)、空白血清組(2mmol/LSNP+含100mL/L空白血清的FD培養(yǎng)基)、中藥組(2mmol/LSNP+含100mL/L復(fù)元膠囊含藥血清的FD培養(yǎng)基)、抑制劑組(2mmol/LSNP+50μmol/LSB203580+無(wú)血清的FD培養(yǎng)基,預(yù)先用SB203580孵育1h,再加入SNP和培養(yǎng)基)、中藥+抑制劑組(2mmol/LSNP+50μmol/LSB203580+含100mL/L復(fù)元膠囊含藥血清的FD培養(yǎng)基,預(yù)先用SB203580孵育1h,再加入SNP和培養(yǎng)基).1.2.4細(xì)胞葉片電子染色觀察將SNP誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞用2.5g/L胰酶消化后進(jìn)行收集,2000r/min4℃離心成細(xì)胞團(tuán)塊,用25g/L的戊二醛固定2h,10g/L四氧化鋨再固定1.5h,經(jīng)梯度丙酮脫水,環(huán)氧樹(shù)脂浸透包埋,超薄切片機(jī)切片,電子染色,HITACHI-7500型透射電鏡下觀察.1.2.5facsaria流式細(xì)胞檢測(cè)選用第2代軟骨細(xì)胞,2×105個(gè)/mL密度種植于6孔培養(yǎng)板中.培養(yǎng)24h細(xì)胞貼壁后,除正常組外,用不含血清的FD培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h使細(xì)胞同步化.按1.2.3所述進(jìn)行分組、處理,繼續(xù)培養(yǎng)48h后,收集培養(yǎng)上清和胰酶消化的細(xì)胞,離心后按FITCAnnexinV/PI試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作,采用FACSAria流式細(xì)胞分析儀檢測(cè),每個(gè)樣本檢測(cè)計(jì)數(shù)的細(xì)胞數(shù)量均固定為10000個(gè),應(yīng)用CELLQuest軟件獲取、分析輸出實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù).1.2.6蛋白濃度的測(cè)定選用第2代軟骨細(xì)胞,2×105個(gè)/mL密度種植于6孔培養(yǎng)板中.培養(yǎng)24h細(xì)胞貼壁后,除正常組外,用不含血清的FD培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h使細(xì)胞同步化.按1.2.3所述進(jìn)行分組、處理,繼續(xù)培養(yǎng)48h.參照試劑說(shuō)明書(shū),分組提取總蛋白,采用Bradford法測(cè)定蛋白濃度.取50μL含100μg蛋白的細(xì)胞裂解上清(如體積不足50μL,用LysisBuffer補(bǔ)足)置于96孔板中,加入50μL的2×ReactionBuffer,再加入5μL4mmol/L的DEVD-ρNASubstrate并于37℃水浴箱中避光孵育2h,用ELX800型酶標(biāo)儀在λ=405nm測(cè)定其吸光度值,根據(jù)其A值換算成每微升所含Caspase-3的質(zhì)量.每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔.1.2.7蛋白表達(dá)及分析MAPK激酶、P53蛋白表達(dá)選用第2代軟骨細(xì)胞,2×105個(gè)/mL密度種植于6孔培養(yǎng)板中.培養(yǎng)24h細(xì)胞貼壁后,除正常組外,用不含血清的FD培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h使細(xì)胞同步化.按1.2.3所述進(jìn)行分組、處理,繼續(xù)培養(yǎng)48h.參照試劑說(shuō)明書(shū),分組提取總蛋白,采用Bradford法測(cè)定蛋白濃度.在BIO-RAD凝膠成像儀下暴光顯影,觀察拍照.用QuantityOne凝膠圖像分析軟件檢測(cè)各組目的蛋白及其內(nèi)參蛋白的吸光度值,計(jì)算兩者的比值,以此作為各組蛋白的相對(duì)表達(dá)量.重復(fù)4次.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,各組數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示,組間比較用One-WayANOVA方差分析,多重比較采用SNK-q檢驗(yàn).2結(jié)果2.1期凋亡細(xì)胞,細(xì)胞目前在細(xì)胞內(nèi)聚合反應(yīng)凋亡以早期為主,鏡下可見(jiàn)軟骨細(xì)胞體積縮小,細(xì)胞膜完整,細(xì)胞表面的微絨毛明顯減少,甚至消失,細(xì)胞漿致密,細(xì)胞器完整,核染色質(zhì)濃縮,集聚于核膜下(圖1A).也可見(jiàn)中晚期凋亡細(xì)胞,細(xì)胞體積明顯縮小,核膜發(fā)生皺褶,胞質(zhì)密度增高,有典型的凋亡小體,內(nèi)有細(xì)胞器,細(xì)胞周?chē)梢?jiàn)脫落的凋亡小體(圖1B).2.2意義p>0.05與模型組和空白血清組比較,中藥組細(xì)胞凋亡率明顯降低,Caspase-3活性抑制,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);使用SB203580阻斷P38信號(hào)通路后,抑制劑組與模型組比較,凋亡率顯著降低,伴有Caspase-3活性抑制(P<0.01),而抑制劑與含藥血清合用后,與抑制劑組比較,細(xì)胞凋亡率也下降,Caspase-3活性抑制,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,表1).2.3p-338表達(dá)結(jié)果如圖2所示,與模型組和空白血清組比較,中藥組能抑制p-P38和P53的表達(dá),其差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01).SB203580抑制p-P38后,p-P38表達(dá)明顯減少,其下游基因P53表達(dá)也減少,與模型組比較,差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01).當(dāng)抑制劑與中藥聯(lián)合使用時(shí),與抑制劑組比較,p-P38表達(dá)無(wú)明顯減少(P>0.05),而P53表達(dá)明顯減少(P<0.01,表2).3復(fù)元膠囊抑制snp誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡的機(jī)制復(fù)元膠囊具有補(bǔ)益肝腎、益氣活血之功效,可通過(guò)調(diào)節(jié)軟骨中基質(zhì)金屬蛋白酶和組織型金屬蛋白酶抑制劑、白介素-1β和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2的平衡而減輕兔膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨的退變.本實(shí)驗(yàn)從復(fù)元膠囊對(duì)軟骨細(xì)胞凋亡及P38信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的角度進(jìn)一步探討其作用機(jī)制.骨關(guān)節(jié)炎病變過(guò)程中有軟骨細(xì)胞凋亡的特征性形態(tài),細(xì)胞凋亡率顯著上升.本實(shí)驗(yàn)中SNP誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞在透射電鏡下可觀察到典型的凋亡形態(tài),包括細(xì)胞體積縮小、染色質(zhì)凝聚、核碎片、細(xì)胞皺縮、凋亡小體等.我們發(fā)現(xiàn),P38信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在SNP誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡過(guò)程中激活,其下游基因P53表達(dá)同步增加,Caspase-3活性增強(qiáng).應(yīng)用復(fù)元膠囊含藥血清作用于SNP誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞后,磷酸化P38蛋白表達(dá)顯著降低,伴隨有P53表達(dá)下降和Caspase-3活性抑制,同時(shí),細(xì)胞凋亡率明顯下降,而空白血清組無(wú)明顯變化.這提示復(fù)元膠囊能有效的抑制SNP誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中p-P38的表達(dá)和活化,進(jìn)而抑制SNP誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡.既往研究發(fā)現(xiàn),P38通過(guò)磷酸化IKK(IκB的一個(gè)上游激酶)和磷酸化P53的絲氨酸15殘基,穩(wěn)定P53蛋白,使其含量增加.阻斷P38信號(hào)通路后,下游與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因如P53,Caspase-3,Bax,Bcl-2等的表達(dá)紊亂,從而對(duì)細(xì)胞凋亡有抑制作用.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示復(fù)元膠囊抑制SNP誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡可能的機(jī)制是通過(guò)抑制p-P38的表達(dá)和活化,引起其通路下游與細(xì)胞凋亡相關(guān)基因如P53,Caspase-3等的表達(dá)或活性降低,進(jìn)而減少