高效液相色譜法檢測豬腸衣中4種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殘留量

高效液相色譜法檢測豬腸衣中4種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殘留量

大環(huán)內(nèi)酯類抗生素是一種類似于化學(xué)結(jié)構(gòu)和抗菌作用的堿性抗生素。它具有大環(huán)內(nèi)酯的共同結(jié)構(gòu)。它以14、15和16元的大內(nèi)酯結(jié)構(gòu)而聞名。廣泛用于家禽、昆蟲和腺體感染的化療和治療。合理使用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素,遵守用藥劑量、間隔時間和停藥期規(guī)定,對于預(yù)防動物疾病、促進動物生長、控制藥物殘留和提高養(yǎng)殖經(jīng)濟效益都有著重要意義。然而當(dāng)過量或不當(dāng)使用此類抗生素時,會造成大環(huán)內(nèi)酯類抗生素及其代謝產(chǎn)物的殘留,并通過食物鏈進入人體,將對人類健康構(gòu)成嚴(yán)重危害。MALs在動物性食品中的殘留檢測和監(jiān)控與其他獸藥一樣已受到許多國家包括我國政府的高度重視,目前我國、日本、澳大利亞等國家以及歐盟等國際組織均對MALs提出了限量要求。大環(huán)內(nèi)酯類獸藥的檢測方法主要有:微生物法、免疫分析法(ELISA)、薄層色譜法(TLC)、氣質(zhì)聯(lián)用法(GC/MS)、高效液相色譜法(HPLC)、液質(zhì)聯(lián)用法(LC/MS,LC-MS/MS)等。其中前4種方法因方法本身的缺欠,少有報導(dǎo)。HPLC方法是應(yīng)用較廣泛的一種分析方法,檢測器通常為紫外檢測器。Naoto報導(dǎo)了測定蛋和雞肉中螺旋霉素;Marco等報導(dǎo)了測定豬肉、肝臟和腎臟中泰樂菌素;Dudrikova等報導(dǎo)了測定牛奶中泰樂菌素。近年來液質(zhì)聯(lián)用法檢測大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的研究比較活躍,用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測牛奶、蜂王漿、蜂蜜、鰻魚、目魚、河水中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的方法已有報導(dǎo)。腸衣基質(zhì)比較復(fù)雜,有關(guān)腸衣中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的檢測,目前國內(nèi)外鮮見報道,本文利用固相萃取-高效液相色譜技術(shù),研究建立基質(zhì)比較復(fù)雜的豬腸衣中大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殘留量的檢測方法。1材料和方法1.1萃取裝置kha高效液相色譜儀(Agilent1100,配有DAD紫外檢測器);固相萃取裝置(Waters,12孔);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器:IKA公司,HB-4型;離心機:LD5-2A,轉(zhuǎn)速4000r/min以上;均質(zhì)器:WARING,10000r/min;氮吹儀:N-EVAPIII型,24孔。1.2酒石酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品溶液10mmol/L乙酸胺溶液(pH4.5),0.05mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH=8.5),0.25mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.0)。C18固相萃取小柱(500mg/6mL),Oasis(HLB)固相萃取小柱(500mg/6mL),MCX固相萃取小柱(500mg/6mL)。螺旋霉素、替米考星、泰樂菌素酒石酸鹽、交沙霉素標(biāo)準(zhǔn)品,純度≥95%。4種大環(huán)內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:分別稱取經(jīng)折算適量標(biāo)準(zhǔn)品,分別用甲醇溶解為濃度為100μg/mL,1℃~4℃冰箱保存,臨用前根據(jù)需要用甲醇稀釋適當(dāng)濃度的工作液。1.3提取和清潔1.3.1或加乙腈提取液制備稱取5g均勻試樣(精確到0.01g)置于50mL具塞離心管中,加25mL乙腈,渦旋,于4000r/min離心3min,將上層乙腈提取液收集于50mL容量瓶中,再加20mL乙腈,重復(fù)上述操作,合并乙腈提取液,加乙腈定容至50mL。精密量取10mL乙腈提取液于20mL離心管中,在45℃以下水浴減壓濃縮至近干,用15mL磷酸鹽緩沖溶液分次溶解殘渣。1.3.2洗脫離心管C18小柱(500mg,6mL,或相當(dāng)者)依次用5mL甲醇、5mL水預(yù)洗。將提取液轉(zhuǎn)移過C18凈化柱,棄去流出液,用5mL水和5mL甲醇-水(2∶8,體積比)依次洗滌離心管,洗滌液過C18柱,棄去流出液,負(fù)壓抽干,用6mL甲醇洗脫。收集全部洗脫液,在45℃以下水浴減壓濃縮至近干,加1mL甲醇-水(3∶7,體積比)溶解,混勻,過0.22μm針筒濾膜,進HPLC分析。1.4色譜柱及流動相的制備a)檢測器:DAD檢測器,檢測波長為螺旋霉素、交沙霉素230nm,替米考星、泰樂菌素287nm;b)色譜柱:LichrospherC18柱,4.6mm×250mm(i.d),5μm;c)流動相:A為0.2%磷酸;B為乙腈;流速為1mL/min;進樣量100μL;d)梯度程序:0min,20%B→15min,50%B→20min,20%B。在上述分析條件下,4種大環(huán)內(nèi)酯類獸藥的HPLC色譜圖見圖1。2結(jié)果與討論2.1色譜柱的選擇分別選用ZORBAXEclipseXDB-C85μm,4.6mm×150mm、ZORBAXEclipseXDB-C185μm,4.6mm×150mm、LichrospherC18柱,5μm,4.6mm×250mm(i.d),結(jié)果表明各種色譜柱均適用,實驗選定LichrospherC18柱,5μm,4.6mm×250mm(i.d)色譜柱。2.2流動相的篩選流動相的選擇對待測物質(zhì)的峰形、分離度和靈敏度有很大影響。根據(jù)大環(huán)內(nèi)酯的性質(zhì),流動相一般呈酸性。研究了乙腈-0.01mol/LNaH2PO4、甲醇-0.2%磷酸、乙腈-0.2%磷酸、甲醇-0.15%甲酸和乙腈-0.15%甲酸溶液5種流動相的色譜分離效果,選擇乙腈-0.01mol/LNaH2PO4作為流動相出現(xiàn)雜質(zhì)峰;甲醇-0.15%甲酸和乙腈-0.15%甲酸溶液作為流動相螺旋霉素和交沙霉素基線發(fā)飄、甲醇-0.2%磷酸、乙腈-0.2%磷酸作為流動相各組分峰形對稱、尖銳,并且達到良好分離,其中尤其以乙腈-0.2%磷酸溶液效果最好。因此采用乙腈-0.2%磷酸溶液作為流動相。2.3樣品的提取方法大環(huán)內(nèi)酯類獸藥屬于極性物質(zhì),易溶于甲醇、乙腈。實驗結(jié)果表明,用乙腈、甲醇提取樣品,大環(huán)內(nèi)酯類獸藥的回收率大于70%,兩者沒有顯著差異,本文選用乙腈提取方法。2.4cd8和uaityhlb凈化柱的凈化效果實驗了C18、Oasis(HLB)和MCX固相萃取柱對樣品中大環(huán)內(nèi)酯類獸藥殘留的凈化效果。C18和Oasis(HLB)兩種凈化柱效果較好,回收率在70%~110%之間。對MCX小柱,交沙霉素不能洗脫下來。綜合考慮,實驗選定C18柱,淋洗條件為:5mL水和5mL甲醇-水(3∶7,體積比)依次洗滌小柱,然后用6mL甲醇洗脫。2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取4種大環(huán)內(nèi)酯混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,濃度分別為0.5、1.0、10、25μg/mL,按照上述確定的實驗條件下進行分析,測定其峰面積,以質(zhì)量濃度X(μg/kg)為橫坐標(biāo),峰面積的比值Y為縱坐標(biāo),繪制4種大環(huán)內(nèi)酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液工作曲線,見表1。結(jié)果表明,4種大環(huán)內(nèi)酯類藥物濃度與對應(yīng)的峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,線性范圍:0.5μg/mL~25μg/mL。按所建立的色譜條件,以3倍噪音比作為檢測低限,測得本方法4種大環(huán)內(nèi)酯類藥物的測定低限均為0.5mg/kg。2.6回收率和精密度以不含大環(huán)內(nèi)酯類藥物殘留的腸衣為空白樣品,分別添加4種大環(huán)內(nèi)酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,添加濃度為1.0、5.0、10.0mg/kg3個濃度水平,按照上述方法進行6次重復(fù)試驗,測得4種大環(huán)內(nèi)酯類藥物的回收率和精密度。平均回收率為70.2%~94.6%;變異系數(shù)為3.2%~8.9%。空白腸衣樣品和添加樣品的HPLC譜圖見圖2、圖3。3抗生素的提取與檢測建立了腸衣中螺旋霉素、替米考星、泰樂菌素、交沙霉素等4種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素殘留量的高效液相色譜測定方法。試樣用乙腈提取,C18固相萃