芹菜素抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的藥敏試驗研究

芹菜素抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的藥敏試驗研究

杏仁素是一種黃酮類化合物，也被稱為黃酮類化合物和黃酮類化合物。其化學結構為5,7,4-三羥基黃酮,分子式C15H10O6。大量實驗證明芹菜素具有廣泛的藥理作用。研究報道其對中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有鎮(zhèn)靜作用,對皮質(zhì)神經(jīng)元具有保護作用,對心血管系統(tǒng)具有降壓作用和預防動脈粥樣硬化作用;抗菌、抗病毒作用;抑制腫瘤細胞,血管形成和生長作用;抗氧化作用,雌激素樣作用等。本文就芹菜素的抗菌作用做深一步研究。近年來,抗生素的不合理應用導致出現(xiàn)的耐藥菌已引起國內(nèi)外學者的廣泛關注。就臨床檢驗分析可知,耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)是造成許多重癥感染的主要病原菌之一,其多重耐藥的特性使得其對除萬古霉素等少數(shù)幾種抗生素以外的藥物均不敏感,所以尋找有效的、低副作用抗菌藥物迫在眉睫。目前我們的工作正致力于從植物中尋找有抗MRSA活性的化合物,也做出了一些成果,其中黃酮類的抗菌效果比較出色。本實驗將芹菜素作用于10株從臨床重癥感染患者中分離出的MRSA菌株,利用頭孢西丁紙片法和微量稀釋棋盤法等藥敏試驗方法將芹菜素與各類抗生素聯(lián)合作用,觀察其是否存在協(xié)同作用,能否在合用時減少抗生素用量,從而減輕不良反應帶來的不利影響。1材料表面1.1藥物、試劑和儀器芹菜素:經(jīng)柱層析分離提純至紫堇屬植物金鉤如意草,根據(jù)活性追蹤的方法得到活性單體,經(jīng)與參考文獻波譜對照一致,確定為芹菜素,純度≥98%。注射用鹽酸左氧氟沙星注射液(揚子江藥業(yè)集團有限公司,批號10020301);乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液(四川科倫藥業(yè)股份有限公司,批號1151020609);注射用硫酸阿米卡星(江蘇吳中醫(yī)藥集團有限公司,批號H19983021);注射用硫酸慶大霉素(廣州白云山天心制藥有限公司,批號091020800);硫酸依替米星注射液(無錫濟民可信山禾藥業(yè)股份有限公司,批號H19991423)。M-H水解酪蛋白瓊脂(杭州天和微生物試劑有限公司,批號091104),M-H肉湯(杭州天和微生物試劑有限公司,批號20100413);二甲基亞砜(DMSO,天津化學試劑有限公司,批號20070924)。1.2藥代動力學鑒定MRSA:MRSA8、MRSA82、MRSA98、MRSA111、MRSA135、MRSA144、MRSA166、MRSA187、MRSA189、MRSA321(成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院藥學部微生物室臨床分離得到并鑒定)。2方法和結果2.1外藥物敏感試驗2.1.1dmso與培養(yǎng)液復合膜的制備倍比稀釋法測MIC:從打孔法得到的結果并查閱文獻估算測定MIC時的首孔濃度,計算所需樣品的量。用不超過30%的DMSO溶解,然后加入適量的培養(yǎng)液配成溶液,震蕩器混勻。依次倍比稀釋,棄去最后一列的稀釋液體100μL,然后在各行加入不同菌液100μL。另設陰性(只加培養(yǎng)液)、陽性(菌液加培養(yǎng)液)對照及DMSO對照組(觀察DMSO對細菌的影響)。最后放置于35℃恒溫箱中培養(yǎng)18~24h后取出進行觀察,肉眼可見清澈透明者視為無菌生長(實驗前藥液清亮透明),藥液不澄清的需涂片在顯微鏡下加以觀察,以無細菌生長的最低藥物濃度為該藥物的最低抑菌濃度。2.1.2dmso溶液配制單藥法取101定性濾紙,用打孔機制成直徑為6mm的圓型小紙片,放入干燥潔凈的小藥盒中,高壓滅菌(121℃,15min)備用。紙片含藥量根據(jù)MIC來確定。將芹菜素用DMSO溶解,配置成單藥,紙片上所含的藥量濃度為其最小抑菌濃度。將配好的菌液均勻地劃線于整個M-H平板上,將抗生素紙片均勻地貼在培養(yǎng)皿上,再將做好的含藥液紙片與抗生素紙片相隔3cm左右的距離貼上,置于溫箱里培養(yǎng)18~24h,觀察記錄結果。2.1.3藥物相互作用采用微量稀釋棋盤法(chequerboardmicrodilutionassay)即聯(lián)用的2種藥物于96孔平底微量培養(yǎng)板上以二維棋盤的縱向(A至H)橫向(1至12)2個方向分別進行2倍的倍比稀釋。根據(jù)所測定的兩藥單獨對受試菌的MIC,以兩藥各自4MIC到1/16MIC分別進行聯(lián)合。藥物體外的相互作用方式以部分抑菌濃度指數(shù)(fractionalinhibitoryconcentrationidex,FICI)來判定,分級抑菌濃度為2種抗菌藥物的聯(lián)合藥敏指標。FICI的計算與判讀標準:分別讀取兩點,A藥聯(lián)用的最低MIC和B藥聯(lián)用的MIC分別記為MICA及MICB。兩藥單用時的MIC分別記為A、B。FICI=MICA/A+MICB/B。FICI≤0.5,兩藥為協(xié)同;0.5<FICI≤1,兩藥為相加;1<FICI≤2,兩藥為無關;FICI>2,兩藥為拮抗。2.2結果2.2.1mrsa菌株的鑒定按CLSI頒布的頭孢西丁紙片擴散法標準操作。結果如表1所示。2.2.2紫菜素抗菌藥物聯(lián)合抗菌藥物根據(jù)藥理學實驗方法中的紙片法,初步測定兩藥是否有聯(lián)合作用,將芹菜素與15種抗菌藥物紙片作用,發(fā)現(xiàn)芹菜素與喹諾酮類抗菌藥物和氨基糖苷類抗生素聯(lián)合效果較好。下一步可根據(jù)紙片法聯(lián)合實驗的結果作為參考,進一步用微量稀釋棋盤法驗證其具體的協(xié)同作用(表2)。2.2.3聯(lián)合實驗的結果根據(jù)紙片聯(lián)合實驗的結果選取具有協(xié)同作用的抗菌藥物進一步確定其聯(lián)合作用,結果見表3。3從抗菌藥物的聯(lián)合應用來看,菜芹菜素是一種廣泛存在于自然界中的天然黃酮類化合物,且易于人工合成,體外研究和動物實驗顯示芹菜素具有抗腫瘤、抗炎癥、降血壓、抗動脈硬化和血栓癥、抗焦慮、抗菌、抗病毒以及抗氧化作用等多方面的生物學活性,而且其致畸變毒性與其他黃酮類化合物相比相對較低。許多對芹菜素抗菌活性實驗的研究表明:芹菜素具有廣譜抑制G+菌、G-菌和一些耐藥菌作用,芹菜素對多種革蘭陰性菌具有抑制作用,其中對于陰溝腸桿菌(E.cloacae)及肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)的殺菌作用最強,最低抑制濃度(MIC)可達4μg·mL-1,但其殺菌作用的機制尚不清楚。另有抗菌試驗表明,芹菜素對革蘭陰性菌的抑制作用比對革蘭陽性菌的作用強,對耐受傳統(tǒng)抗生素的菌群(如銅綠假單胞菌等)也有抑制作用,同時對耐甲氧西林和甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌都有選擇性抑制作用。BasileA等發(fā)現(xiàn)芹菜素對產(chǎn)氣腸桿菌(ATCC13048),E.cloacae(ATCC10699),銅綠假單胞菌(ATCC27853)對芹菜素最敏感(MIC為64μg·mL-1),對大腸桿菌(ATCC11229)和肺炎克雷伯菌(ATCC10031)的MIC為128μg·mL-1。對產(chǎn)氣腸桿菌的MIC為4μg·mL-1,銅綠假單胞菌為8μg·mL-1,奇異變形桿菌為16μg·mL-1,傷寒沙門菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌為128μg·mL-1。Sato等對黃岑提取物的研究中發(fā)現(xiàn),其中的芹菜素對耐甲氧西林和甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌都有選擇性抑制作用(MIC為3.9~15.6μg·mL-1)。但對芹菜素的聯(lián)合抗菌作用,特別是臨床上常見的耐藥菌的研究未見報道。由實驗結果可得出:芹菜素與喹諾酮類抗菌藥物和氨基糖苷類抗生素呈現(xiàn)良好聯(lián)合抗菌作用,與左氧氟沙星的聯(lián)合應用時,10株MRSA菌株有4株顯示聯(lián)合作用,且抗菌藥物的用量也都降低到1/2~1/8MIC不等;與環(huán)丙沙星聯(lián)合應用時,有3株菌的FICI值小于0.5,顯示有協(xié)同作用,環(huán)丙沙星的用量也降低到1/2~1/8MIC;與氨基糖苷類抗生素慶大霉素聯(lián)合應用時,有4株菌呈現(xiàn)協(xié)同抗菌作用,同樣也降低抗生素的用量到1/2~1/8MIC;與阿米卡星聯(lián)合應用時,有6株菌呈現(xiàn)協(xié)同抗菌作用,抗生素的用量最低可降到單獨用藥時的1/16;與依替米星聯(lián)合應用時,有5株菌呈現(xiàn)協(xié)同抗菌作用,其余為相加作用,抗生素的用量也分別降低了1/2~1/8MIC不等?？股赜昧康慕档涂蓽p輕抗生素濫