芹菜素抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的藥敏試驗(yàn)研究

芹菜素抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的藥敏試驗(yàn)研究

杏仁素是一種黃酮類化合物，也被稱為黃酮類化合物和黃酮類化合物。其化學(xué)結(jié)構(gòu)為5,7,4-三羥基黃酮,分子式C15H10O6。大量實(shí)驗(yàn)證明芹菜素具有廣泛的藥理作用。研究報(bào)道其對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有鎮(zhèn)靜作用,對(duì)皮質(zhì)神經(jīng)元具有保護(hù)作用,對(duì)心血管系統(tǒng)具有降壓作用和預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化作用;抗菌、抗病毒作用;抑制腫瘤細(xì)胞,血管形成和生長(zhǎng)作用;抗氧化作用,雌激素樣作用等。本文就芹菜素的抗菌作用做深一步研究。近年來,抗生素的不合理應(yīng)用導(dǎo)致出現(xiàn)的耐藥菌已引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。就臨床檢驗(yàn)分析可知,耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)是造成許多重癥感染的主要病原菌之一,其多重耐藥的特性使得其對(duì)除萬古霉素等少數(shù)幾種抗生素以外的藥物均不敏感,所以尋找有效的、低副作用抗菌藥物迫在眉睫。目前我們的工作正致力于從植物中尋找有抗MRSA活性的化合物,也做出了一些成果,其中黃酮類的抗菌效果比較出色。本實(shí)驗(yàn)將芹菜素作用于10株從臨床重癥感染患者中分離出的MRSA菌株,利用頭孢西丁紙片法和微量稀釋棋盤法等藥敏試驗(yàn)方法將芹菜素與各類抗生素聯(lián)合作用,觀察其是否存在協(xié)同作用,能否在合用時(shí)減少抗生素用量,從而減輕不良反應(yīng)帶來的不利影響。1材料表面1.1藥物、試劑和儀器芹菜素:經(jīng)柱層析分離提純至紫堇屬植物金鉤如意草,根據(jù)活性追蹤的方法得到活性單體,經(jīng)與參考文獻(xiàn)波譜對(duì)照一致,確定為芹菜素,純度≥98%。注射用鹽酸左氧氟沙星注射液(揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司,批號(hào)10020301);乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液(四川科倫藥業(yè)股份有限公司,批號(hào)1151020609);注射用硫酸阿米卡星(江蘇吳中醫(yī)藥集團(tuán)有限公司,批號(hào)H19983021);注射用硫酸慶大霉素(廣州白云山天心制藥有限公司,批號(hào)091020800);硫酸依替米星注射液(無錫濟(jì)民可信山禾藥業(yè)股份有限公司,批號(hào)H19991423)。M-H水解酪蛋白瓊脂(杭州天和微生物試劑有限公司,批號(hào)091104),M-H肉湯(杭州天和微生物試劑有限公司,批號(hào)20100413);二甲基亞砜(DMSO,天津化學(xué)試劑有限公司,批號(hào)20070924)。1.2藥代動(dòng)力學(xué)鑒定MRSA:MRSA8、MRSA82、MRSA98、MRSA111、MRSA135、MRSA144、MRSA166、MRSA187、MRSA189、MRSA321(成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院藥學(xué)部微生物室臨床分離得到并鑒定)。2方法和結(jié)果2.1外藥物敏感試驗(yàn)2.1.1dmso與培養(yǎng)液復(fù)合膜的制備倍比稀釋法測(cè)MIC:從打孔法得到的結(jié)果并查閱文獻(xiàn)估算測(cè)定MIC時(shí)的首孔濃度,計(jì)算所需樣品的量。用不超過30%的DMSO溶解,然后加入適量的培養(yǎng)液配成溶液,震蕩器混勻。依次倍比稀釋,棄去最后一列的稀釋液體100μL,然后在各行加入不同菌液100μL。另設(shè)陰性(只加培養(yǎng)液)、陽性(菌液加培養(yǎng)液)對(duì)照及DMSO對(duì)照組(觀察DMSO對(duì)細(xì)菌的影響)。最后放置于35℃恒溫箱中培養(yǎng)18~24h后取出進(jìn)行觀察,肉眼可見清澈透明者視為無菌生長(zhǎng)(實(shí)驗(yàn)前藥液清亮透明),藥液不澄清的需涂片在顯微鏡下加以觀察,以無細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為該藥物的最低抑菌濃度。2.1.2dmso溶液配制單藥法取101定性濾紙,用打孔機(jī)制成直徑為6mm的圓型小紙片,放入干燥潔凈的小藥盒中,高壓滅菌(121℃,15min)備用。紙片含藥量根據(jù)MIC來確定。將芹菜素用DMSO溶解,配置成單藥,紙片上所含的藥量濃度為其最小抑菌濃度。將配好的菌液均勻地劃線于整個(gè)M-H平板上,將抗生素紙片均勻地貼在培養(yǎng)皿上,再將做好的含藥液紙片與抗生素紙片相隔3cm左右的距離貼上,置于溫箱里培養(yǎng)18~24h,觀察記錄結(jié)果。2.1.3藥物相互作用采用微量稀釋棋盤法(chequerboardmicrodilutionassay)即聯(lián)用的2種藥物于96孔平底微量培養(yǎng)板上以二維棋盤的縱向(A至H)橫向(1至12)2個(gè)方向分別進(jìn)行2倍的倍比稀釋。根據(jù)所測(cè)定的兩藥單獨(dú)對(duì)受試菌的MIC,以兩藥各自4MIC到1/16MIC分別進(jìn)行聯(lián)合。藥物體外的相互作用方式以部分抑菌濃度指數(shù)(fractionalinhibitoryconcentrationidex,FICI)來判定,分級(jí)抑菌濃度為2種抗菌藥物的聯(lián)合藥敏指標(biāo)。FICI的計(jì)算與判讀標(biāo)準(zhǔn):分別讀取兩點(diǎn),A藥聯(lián)用的最低MIC和B藥聯(lián)用的MIC分別記為MICA及MICB。兩藥單用時(shí)的MIC分別記為A、B。FICI=MICA/A+MICB/B。FICI≤0.5,兩藥為協(xié)同;0.5<FICI≤1,兩藥為相加;1<FICI≤2,兩藥為無關(guān);FICI>2,兩藥為拮抗。2.2結(jié)果2.2.1mrsa菌株的鑒定按CLSI頒布的頭孢西丁紙片擴(kuò)散法標(biāo)準(zhǔn)操作。結(jié)果如表1所示。2.2.2紫菜素抗菌藥物聯(lián)合抗菌藥物根據(jù)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法中的紙片法,初步測(cè)定兩藥是否有聯(lián)合作用,將芹菜素與15種抗菌藥物紙片作用,發(fā)現(xiàn)芹菜素與喹諾酮類抗菌藥物和氨基糖苷類抗生素聯(lián)合效果較好。下一步可根據(jù)紙片法聯(lián)合實(shí)驗(yàn)的結(jié)果作為參考,進(jìn)一步用微量稀釋棋盤法驗(yàn)證其具體的協(xié)同作用(表2)。2.2.3聯(lián)合實(shí)驗(yàn)的結(jié)果根據(jù)紙片聯(lián)合實(shí)驗(yàn)的結(jié)果選取具有協(xié)同作用的抗菌藥物進(jìn)一步確定其聯(lián)合作用,結(jié)果見表3。3從抗菌藥物的聯(lián)合應(yīng)用來看,菜芹菜素是一種廣泛存在于自然界中的天然黃酮類化合物,且易于人工合成,體外研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示芹菜素具有抗腫瘤、抗炎癥、降血壓、抗動(dòng)脈硬化和血栓癥、抗焦慮、抗菌、抗病毒以及抗氧化作用等多方面的生物學(xué)活性,而且其致畸變毒性與其他黃酮類化合物相比相對(duì)較低。許多對(duì)芹菜素抗菌活性實(shí)驗(yàn)的研究表明:芹菜素具有廣譜抑制G+菌、G-菌和一些耐藥菌作用,芹菜素對(duì)多種革蘭陰性菌具有抑制作用,其中對(duì)于陰溝腸桿菌(E.cloacae)及肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)的殺菌作用最強(qiáng),最低抑制濃度(MIC)可達(dá)4μg·mL-1,但其殺菌作用的機(jī)制尚不清楚。另有抗菌試驗(yàn)表明,芹菜素對(duì)革蘭陰性菌的抑制作用比對(duì)革蘭陽性菌的作用強(qiáng),對(duì)耐受傳統(tǒng)抗生素的菌群(如銅綠假單胞菌等)也有抑制作用,同時(shí)對(duì)耐甲氧西林和甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌都有選擇性抑制作用。BasileA等發(fā)現(xiàn)芹菜素對(duì)產(chǎn)氣腸桿菌(ATCC13048),E.cloacae(ATCC10699),銅綠假單胞菌(ATCC27853)對(duì)芹菜素最敏感(MIC為64μg·mL-1),對(duì)大腸桿菌(ATCC11229)和肺炎克雷伯菌(ATCC10031)的MIC為128μg·mL-1。對(duì)產(chǎn)氣腸桿菌的MIC為4μg·mL-1,銅綠假單胞菌為8μg·mL-1,奇異變形桿菌為16μg·mL-1,傷寒沙門菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌為128μg·mL-1。Sato等對(duì)黃岑提取物的研究中發(fā)現(xiàn),其中的芹菜素對(duì)耐甲氧西林和甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌都有選擇性抑制作用(MIC為3.9~15.6μg·mL-1)。但對(duì)芹菜素的聯(lián)合抗菌作用,特別是臨床上常見的耐藥菌的研究未見報(bào)道。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得出:芹菜素與喹諾酮類抗菌藥物和氨基糖苷類抗生素呈現(xiàn)良好聯(lián)合抗菌作用,與左氧氟沙星的聯(lián)合應(yīng)用時(shí),10株MRSA菌株有4株顯示聯(lián)合作用,且抗菌藥物的用量也都降低到1/2~1/8MIC不等;與環(huán)丙沙星聯(lián)合應(yīng)用時(shí),有3株菌的FICI值小于0.5,顯示有協(xié)同作用,環(huán)丙沙星的用量也降低到1/2~1/8MIC;與氨基糖苷類抗生素慶大霉素聯(lián)合應(yīng)用時(shí),有4株菌呈現(xiàn)協(xié)同抗菌作用,同樣也降低抗生素的用量到1/2~1/8MIC;與阿米卡星聯(lián)合應(yīng)用時(shí),有6株菌呈現(xiàn)協(xié)同抗菌作用,抗生素的用量最低可降到單獨(dú)用藥時(shí)的1/16;與依替米星聯(lián)合應(yīng)用時(shí),有5株菌呈現(xiàn)協(xié)同抗菌作用,其余為相加作用,抗生素的用量也分別降低了1/2~1/8MIC不等。抗生素用量的降低可減輕抗生素濫