共軛亞油酸甲酯化方法的比較

共軛亞油酸甲酯化方法的比較

共軛脂肪酸（cla）是亞硝酸鹽的位置和幾何異構(gòu)體。自從Pariza等人首次分離并確認(rèn)CLA是一種抗癌劑以來(lái),關(guān)于CLA生理活性的研究就成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。國(guó)外的研究表明,CLA具有抑制癌癥、降低膽固醇、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗氧化及有效防止免疫刺激的分解代謝等作用。目前,國(guó)內(nèi)在CLA作用方面的研究已取得了很大的進(jìn)展。氣相色譜法是分析CLA的一種簡(jiǎn)便而有效的方法,通過(guò)分析可以確定CLA的組成和含量。油脂中脂肪酸特別是長(zhǎng)碳鏈脂肪酸一般不直接進(jìn)行氣相色譜分析,須先將它們衍生為易揮發(fā)的甲酯再進(jìn)行分析。若直接進(jìn)行分析,柱溫很高,高溫固定相難以選擇,色譜峰易拖尾,保留時(shí)間不重復(fù),有時(shí)有假峰出現(xiàn)等。脂肪酸的甲酯化方法可分為3大類(lèi),酸催化法、堿催化法和三甲基硅重氮甲烷(TMS)法。一般游離脂肪酸的甲酯化可采用酸催化或TMS法,三甘油酯型的脂肪酸可采用酸催化或堿催化法。不同的衍生方法對(duì)CLA造成的影響不同,在衍生過(guò)程中CLA可能會(huì)生成不完全甲酯衍生物,也可能產(chǎn)生異構(gòu)化、氧化或者水解等反應(yīng)。因此,必須找到一種最佳的衍生方法,以便準(zhǔn)確測(cè)定CLA。本文主要探討3種甲酯化方法在不同存在類(lèi)型的CLA氣相色譜分析中的異同,通過(guò)薄層層析法和氣相色譜法測(cè)定脂肪酸酯化的程度以及CLA甲酯化后異構(gòu)體組成的變化。1材料和方法1.1c12t-cla,10t12c-cla,cl2樣品CLA1(青島澳海生物有限公司,主要成分9c12t-CLA和10t12c-CLA)、CLA2(上海科寧大中華營(yíng)養(yǎng)與健康部,主要成分9c12t-CLA和10t12c-CLA)。1.2儀器6890型氣相色譜儀(Agilent公司),FID檢測(cè)器,CP-Sil88石英毛細(xì)管柱(100m×0.25mm)。1.3色譜、溶液三甲基硅重氮甲烷(TMS-DZM)、正己烷、無(wú)水甲醇、氯仿等均為色譜純,HCl甲醇溶液,乙酸甲酯,苯(分析純)。脂肪酸463標(biāo)樣和CLA混合物標(biāo)樣(NU-CHEK-PREP公司)。1.4CLA甲酯化1.4.1酸、堿的反應(yīng)樣品2mg溶于1.5mL正己烷中,加乙酸甲酯40μL振蕩,再加入100μL溶有甲醇鈉的甲醇溶液在室溫下反應(yīng)20min,冷凍10min后加60μL草酸,無(wú)水硫酸鈉過(guò)濾得濾液備用。1.4.2甲酯化cla取5%的HCl甲醇溶液4mL、苯1mL,加入CLA樣品1滴,混勻。在80℃下甲酯化1h。冷卻后加1mL水,3mL正己烷,振蕩1min,收集上層正己烷層,無(wú)水硫酸鈉過(guò)濾得濾液備用。1.4.3甲基硅重氮甲烷的制備取甲醇溶液0.5mL、苯0.5mL,加入CLA樣品1滴,混和均勻。加入三甲基硅重氮甲烷(TMS-DZM)0.2mL,劇烈振蕩,室溫下反應(yīng)30min,加入1滴乙酸,2mL正己烷,2mL水和2滴0.5mol/L的NaOH,離心取正己烷層,無(wú)水硫酸鈉過(guò)濾得濾液備用。1.5甲酯化cla的合成取甲酯化后的濾液,用氮?dú)獯蹈珊?加氯仿,以正己烷∶乙醚∶乙酸(85∶15∶1)為展開(kāi)劑,在硅膠G板做薄板層析,分離純化甲酯化CLA樣品,用2,7-二氯熒光黃顯色,在紫外燈下刮下有甲酯化CLA的硅膠,用氯仿洗出,氮?dú)獯蹈?正己烷溶解后上氣相色譜儀分析。1.6升溫速率的確定程序升溫過(guò)程:45℃時(shí)保持3min,然后以13℃/min的升溫速率將溫度升至175℃,保持27min,再以4℃/min的升溫速率將溫度升至215℃,保持5min,載氣為氫氣。2結(jié)果與分析2.1甲酯的合成CLA經(jīng)薄板層析后,噴20%的硫酸,置于180℃電熱板上加熱使脂肪酸碳化,掃描獲得圖1、圖2薄板層析圖譜。從圖1可以看出:CLA1以游離脂肪酸的形式存在,CLA2以甘油三酯的形式存在,經(jīng)過(guò)堿法甲酯化后,CLA1幾乎沒(méi)有得到甲酯,而CLA2全部轉(zhuǎn)化為甲酯。從圖2可以看出:經(jīng)過(guò)TMS法甲酯化后,CLA1全部轉(zhuǎn)變?yōu)榧柞?而CLA2幾乎沒(méi)有得到甲酯;酸法甲酯化后,CLA1和CLA2都有部分轉(zhuǎn)化為甲酯,但轉(zhuǎn)化不完全。2.2cc-cla的合成CLA樣品甲酯化后的氣相色譜圖見(jiàn)圖3,CLA樣品中脂肪酸百分含量見(jiàn)表1。從表1可以看出:經(jīng)過(guò)3種甲酯化方法后,CLA1和CLA2獲得的CLA異構(gòu)體的百分含量各不相同,酸法甲酯化后的CLA有部分轉(zhuǎn)化為cc-CLA;不同甲酯化方法影響同一樣品CLA的測(cè)定結(jié)果,TMS法比酸法測(cè)得的CLA含量高,堿法也比酸法測(cè)得的CLA含量高。3討論3.1甲酯化程度上的比較經(jīng)過(guò)酸催化、堿催化和三甲基硅重氮甲烷(TMS)法甲酯化脂肪酸后,可以看出這3種方法在脂肪酸甲酯化程度上有比較大的差異。游離脂肪酸的甲酯化采用TMS法比較好,而甘油三酯型的脂肪酸采用堿催化法效果較好,甲酯化程度高;游離型和甘油三酯型的脂肪酸都可以用酸催化法甲酯化,但甲酯化的程度比前兩種方法低;堿催化甲酯化法不太適合游離型脂肪酸甲酯的制備,TMS法不適合甘油三酯型的脂肪酸的甲酯化。3.2甲酯化方法合成脂肪酸甲酯從結(jié)構(gòu)分析可知,CLA均可能存在以下幾種構(gòu)象:順順(cc),反反(tt)和反順(tc)3種位置異構(gòu)體。不同甲酯化方法得到的脂肪酸甲酯組成不同。TMS法甲酯化后CLA樣品結(jié)構(gòu)改變最少,而其他兩種方法對(duì)CLA構(gòu)成都有影響,酸催化法對(duì)CLA易形成異構(gòu)化,兩種CLA樣品的tt-CLA明顯增加。3.3甲醇催化合成本構(gòu)酸共保持低碳經(jīng)濟(jì)技術(shù)在油脂體系中的應(yīng)用,其產(chǎn)生、發(fā)展開(kāi)環(huán)率低,其造成油脂肪酸甲酯化,是把高沸點(diǎn)不易揮發(fā)、汽化的脂肪酸酯先水解或皂化得到脂肪酸和甘油,再使脂肪酸與甲醇反應(yīng)生成相應(yīng)的脂肪酸甲酯(甲酯化)使其變成低沸點(diǎn)易揮發(fā)、汽化的物質(zhì),或由油脂直接與甲醇發(fā)生醇解反應(yīng)制取脂肪酸甲酯,從而降低汽化溫度,提高分離效果,有利于氣相色譜法分離并逐一測(cè)定其組成和含量的方法。多烯酸的油脂醇解,不宜在60℃以上進(jìn)行,避免雙鍵轉(zhuǎn)移產(chǎn)生油脂的異構(gòu)化。而酸催化法需較高溫度(約80℃)反應(yīng)。堿催化法在室溫下就可醇解完全,反應(yīng)迅速且可避免低級(jí)脂肪酸在高溫下?lián)]發(fā)及不飽和脂肪酸氧化。但油脂中游離脂肪酸含量高時(shí),則不宜用堿催化法,因?yàn)橹舅嵊鰤A成為穩(wěn)定的羧酸離子,其反應(yīng)極慢且甲酯化不完全。TMS活性很高,在甲醇催化下可與脂肪酸發(fā)生反應(yīng)生成甲酯,對(duì)于多不飽和脂肪酸反應(yīng)速度很快,此法甲酯化反應(yīng)速度快,不發(fā)生副反應(yīng)。脂肪酸甲酯化后產(chǎn)生異構(gòu)化,異構(gòu)化實(shí)質(zhì)上是氫質(zhì)子的位置異構(gòu)與幾何異構(gòu)的綜合,是使油脂結(jié)構(gòu)上的雙鍵發(fā)生變化的重要反應(yīng)之一,異構(gòu)化反應(yīng)包括立體變更的順、反-構(gòu)型變化與雙鍵轉(zhuǎn)移的共軛化反應(yīng)。立體變更是天然烯酸在多種催化條件下如光、熱、離子反應(yīng)催化劑與自由基反應(yīng)催化劑,由天然的順式構(gòu)型轉(zhuǎn)化為反式構(gòu)