蛋白酶激活受體2對(duì)大鼠脊髓損傷后膠質(zhì)瘢痕形成早期損傷區(qū)神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白及波形蛋白表達(dá)的影響

蛋白酶激活受體2對(duì)大鼠脊髓損傷后膠質(zhì)瘢痕形成早期損傷區(qū)神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白及波形蛋白表達(dá)的影響

有機(jī)質(zhì)損害是中樞神經(jīng)系統(tǒng)（cns）損傷后神經(jīng)過渡的主要障礙之一。該標(biāo)志是星形細(xì)胞中的絲質(zhì)蛋白（gfp）和波形蛋白（iv）的強(qiáng)化。眾多研究提示蛋白酶激活受體2(proteaseactivatedreceptor2,PAR2)可能在脊髓損傷后膠質(zhì)瘢痕形成中起關(guān)鍵作用。本研究通過PAR2特異性抑制劑、PAR2特異性激動(dòng)劑及PAR2siRNA對(duì)脊髓損傷后損傷區(qū)GFAP與Vimentin蛋白表達(dá)變化的影響,探討PAR2對(duì)脊髓損傷后膠質(zhì)瘢痕形成的作用,并為臨床研究抑制膠質(zhì)瘢痕形成促進(jìn)神經(jīng)軸突再生的治療策略提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1大鼠術(shù)后時(shí)間點(diǎn)篩選180只成年SpragueDawley(SD)雌性大鼠()購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,并隨機(jī)分為假手術(shù)組(shamoperation組)、模型組(model組)、PAR2激動(dòng)劑組(SLIGRL-NH2組)、PAR2抑制劑組(FSLLRY-NH2組)及PAR2siRNA組。每組大鼠36只,共選取術(shù)后第1d、7d及14d3個(gè)時(shí)間點(diǎn),每個(gè)時(shí)間點(diǎn)大鼠12只,其中6只用于免疫熒光分析,另6只用于Westernblot分析。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中共有19只大鼠死亡,其中手術(shù)造模時(shí)麻醉致死5只,在術(shù)后輔助排尿過程中膀胱破裂引起腹膜炎癥致死4只,術(shù)后腎衰死亡7只,不明原因死亡3只。在發(fā)現(xiàn)大鼠死亡時(shí),均立即以符合實(shí)驗(yàn)要求的大鼠在相同的實(shí)驗(yàn)條件下再次造模并給予相應(yīng)的干預(yù),直至所有大鼠順利存活至實(shí)驗(yàn)規(guī)定的時(shí)間,且所有研究組中沒有因死亡造成的大鼠數(shù)量差異。1.2硬膜下foly-nh2的注射按照UsulH的方法進(jìn)行。將大鼠麻醉消毒后暴露T11-12節(jié)段脊髓硬膜,用0.88N力Yasargil動(dòng)脈瘤夾(65750T,Rebstock,德國(guó))持續(xù)夾脊髓60s,造成脊髓嚴(yán)重?fù)p傷。傷后立即打開硬脊膜并于損傷局部硬膜下分別注射FSLLRY-NH210μL(10mg∕L,PAR-3888-PI,PEPTIDESINTERNATIONAL,美國(guó))、SLI-GRL-NH210μL(100μmol∕L,ab120176,abcam,美國(guó))、PAR2siRNA10μL(30mmol∕L,SC-156080,SANTACRUZBIOTECHNOLOGY,INC,美國(guó))及生理鹽水10μL。注射完成后,于損傷處硬脊膜下腔留置導(dǎo)管并固定,縫合硬膜、肌肉,以含慶大霉素的生理鹽水沖洗后縫合皮膚。傷后第2d,經(jīng)留置導(dǎo)管注入與首次同劑量的干擾劑,完成后拔出導(dǎo)管。假手術(shù)組大鼠只打開椎板,不進(jìn)行其他操作。所有大鼠術(shù)后給予輔助排尿及常規(guī)護(hù)理。1.3聯(lián)合免疫治療將大鼠麻醉,以4﹪多聚甲醛經(jīng)心臟灌注固定后,取出脊髓組織(損傷旁各0.5cm)置于4﹪多聚甲醛中后固定4h,然后放入30﹪蔗糖溶液中脫水至其沉底。脫水完成后行冰凍切片(12μm)。PBS漂洗切片(5min×3)后以0.3﹪tritonx-100浸泡5min,再次PBS漂洗(3min×3)后以正常山羊血清封閉液封閉60min(37℃),去除多余封閉液后GFAP一抗4℃孵育過夜(mouseanti-GFAP,556328,BDBiosciences,美國(guó),1:40)。PBS漂洗切片(5min×3),相應(yīng)二抗37℃孵育90min[Flur?488-ConjugatedAffiniPureGoatAnti-MouseIgG(H+L),ZF-0512,中杉金橋,1:200],經(jīng)PBS漂洗(5min×3)后封片。在LEICATCSSP2激光共聚焦顯微鏡下觀察并照相。1.4丙烯酰胺電泳將大鼠麻醉處死后取出脊髓組織(損傷旁各0.5cm),提取脊髓組織蛋白(P0013B,碧云天)。經(jīng)變性后,測(cè)定蛋白濃度(P0010,碧云天)以定量結(jié)果,取50μg總蛋白樣品經(jīng)10%SDS(十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺)電泳,轉(zhuǎn)至PVDF膜(IPVH00010,Millipore,美國(guó)),以western封閉液封閉90min(37℃)。加入相應(yīng)一抗4℃孵育過夜(mouseanti-GFAP,556328,BDBiosciences,美國(guó),1:500;Anti-Vimentinantibody[V9],ab8069,abcam,美國(guó),1:1500),洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(GoatpolyclonalSecondaryAntibodytoMouseIgG1-heavychain,ab97240,abcam,美國(guó),1:1000)37℃孵育90min,在暗室中經(jīng)DAB試劑于PVDF膜上顯色,掃描各免疫印跡條帶并分析。1.5脊柱損傷后下肢運(yùn)動(dòng)功能的bbb評(píng)分傷后第1d、7d及14d對(duì)大鼠行后肢運(yùn)動(dòng)功能BBB評(píng)分,觀察各PAR2干擾劑對(duì)其后肢運(yùn)動(dòng)功能的影響。1.6gfap陽(yáng)性染色面積率gfap陽(yáng)性染色面積率gfap陽(yáng)性染色面積率用Image-ProPlus6.0軟件分析計(jì)算免疫熒光圖片中GFAP的陽(yáng)性染色面積及組織總面積,求得GFAP陽(yáng)性染色面積率(GFAP陽(yáng)性染色面積/組織總面積)。以QuantityOne-4.6.2軟件分析western條帶陽(yáng)性產(chǎn)物IOD值,計(jì)算陽(yáng)性產(chǎn)物和內(nèi)參GAPDH的IOD值比。1.7比較方法:均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差以IBMSPSSStatistics19行統(tǒng)計(jì)分析,統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)皆用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。多組間比較用單因素方差分析,各組數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布并經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)后,兩兩比較采用最小顯著差異法(LSD)或Tamhane,sT2檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05,雙側(cè)檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1gfap陽(yáng)性染色面積率損傷后第1d,各干預(yù)組GFAP陽(yáng)性染色面積率與model組相比無顯著差異(F=0.388,P=0.763)。傷后第7d及第14d,各實(shí)驗(yàn)組之間比較有顯著差異(7d,F=76.250,P<0.01;14d,F=141.243,P<0.01)。兩兩比較顯示,FSLLRY-NH2組(7d,P<0.01;14d,P<0.01)及siRNA組(7d,P<0.01;14d,P<0.01)的GFAP陽(yáng)性染色面積率均顯著低于model組;SLIGRL-NH2組(7d,P<0.01;14d,P=0.019)GFAP陽(yáng)性染色面積率顯著高于model組;而在FSLLRY-NH2組與siRNA組之間比較,GFAP陽(yáng)性染色面積率未見明顯差異(7d,P=0.289;14d,P=0.940)(圖1,表1)。2.2gfap表達(dá)損傷后第1d,各干預(yù)組GFAP的表達(dá)與model組相比無顯著差異(F=0.085,P=0.968)。傷后第7d及第14d,各組之間GFAP(7d,F=85.858,P<0.01;14d,F=163.143,P<0.01)的表達(dá)有顯著差異。進(jìn)一步兩兩比較顯示FSLLRY-NH2組(7d,P<0.01;14d,P<0.01)及siRNA組(7d,P<0.01;14d,P<0.01)GFAP的表達(dá)低于model組;而SLI-GRL-NH2組(7d,P<0.01;14d,P<0.01)GFAP的表達(dá)高于model組;而在FSLLRY-NH2組與siRNA組之間比較,GFAP的表達(dá)未見明顯差異(7d,P=0.598;14d,P=0.713)(圖2,表2)。2.3fluslr-nh2對(duì)sirnin蛋白表達(dá)的影響損傷后第1d,各干預(yù)組Vimentin蛋白的表達(dá)與model組相比無顯著差異(F=0.423,P=0.739)。傷后第7d及第14d,各組間Vimentin蛋白(7d,F=66.040,P<0.01;14d,F=113.653,P<0.01)的表達(dá)有顯著差異。進(jìn)一步兩兩比較顯示FSLL-RY-NH2組(7d,P<0.01;14d,P<0.01)及siRNA組(7d,P<0.01;14d,P<0.01)Vimentin蛋白的表達(dá)低于model組;而SLIGRL-NH2組(7d,P=0.001;14d,P<0.01)Vimentin蛋白的表達(dá)高于model組;而在FSLLRY-NH2組與siRNA組之間比較,Vimentin蛋白的表達(dá)未見明顯差異(7d,P=0.900;14d,P=0.822)(圖3,表3)。2.4運(yùn)動(dòng)功能bcb評(píng)分脊髓損傷后第1d及第7d(7d,F=2.626,P=0.079),各干預(yù)組大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能BBB評(píng)分無顯著差異。而在傷后第14d,各實(shí)驗(yàn)組大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能BBB評(píng)分有顯著差異(F=773.889,P=0.000)。進(jìn)一步兩兩比較顯示FSLLRY-NH2組(P=0.003)及siRNA組(P=0.006)BBB評(píng)分高于model組;而SLIGRL-NH2組(P=0.030)BBB評(píng)分則低于模型組(表4)。FSLLRY-NH2組與siRNA組比較無顯著差異(P=1.000)。3par2對(duì)髓傷痛大鼠骨髓損傷后gfap和vintin表達(dá)的影響脊髓損傷(spinalcordinjury,SCI)是一種常見的高致殘性傷害,造成了巨大的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),然而針對(duì)SCI后損傷機(jī)制和治療措施的研究至今仍未獲得較為滿意的結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn),CNS損傷后發(fā)生反應(yīng)性膠質(zhì)增生,初期可能有利于維持損傷局部微環(huán)境的穩(wěn)定,但持續(xù)的膠質(zhì)增生將導(dǎo)致膠質(zhì)瘢痕形成,并成為損傷后軸突再生的主要障礙,這一點(diǎn)在SCI修復(fù)中表現(xiàn)得尤為突出。膠質(zhì)瘢痕最主要的構(gòu)成成份為星形膠質(zhì)細(xì)胞,其在CNS損傷后反應(yīng)性膠質(zhì)增生的過程中大量增殖,并明顯上調(diào)表達(dá)其細(xì)胞骨架的兩種中間絲成分——GFAP和Vimentin,成為膠質(zhì)瘢痕形成的標(biāo)志。在我們前期的研究中亦發(fā)現(xiàn),同時(shí)抑制中間絲GFAP和Vimentin的表達(dá)后,膠質(zhì)瘢痕的形成減弱,神經(jīng)芽生增強(qiáng)。該研究證實(shí)了GFAP、Vimentin在膠質(zhì)瘢痕形成中的重要意義,同時(shí)亦初步證實(shí)抑制膠質(zhì)瘢痕對(duì)神經(jīng)再生的促進(jìn)作用。然而作為膠質(zhì)瘢痕基本構(gòu)成成分,GFAP、Vimentin表達(dá)的分子調(diào)節(jié)機(jī)制至今仍不清楚。PAR2為PARs(G蛋白偶聯(lián)受體家族)家族成員,其廣泛地分布于CNS中的神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞,能被胰蛋白酶及肥大細(xì)胞類胰蛋白酶所激活,并在CNS炎癥反應(yīng)、缺血及神經(jīng)退行性改變等病理過程中發(fā)揮著重要作用。眾多研究提示PAR2可能在脊髓損傷后炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的膠質(zhì)瘢痕形成中發(fā)揮了重要作用,但目前尚缺乏相關(guān)研究證實(shí)。對(duì)此,本實(shí)驗(yàn)深入研究了PAR2對(duì)脊髓損傷早期損傷區(qū)GFAP和Vimentin表達(dá)的影響。結(jié)果表明,在脊髓損傷后的第7d及14d,FSLLRY-NH2組及PAR2siRNA組大鼠GFAP及Vimentin蛋白的表達(dá)低于模型組,而SLIGRL-NH2組高于模型組,差異皆有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在脊髓損傷后第14d的BBB評(píng)分表明FSLLRY-NH2組及PAR2siRNA組大鼠的BBB評(píng)分高于模型組,而SLI-GRL-NH2組大鼠的評(píng)分則低于模型組,差異皆有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。然而,值得注意的是各干預(yù)組中BBB評(píng)分在傷后第7d與模型組相比未見顯著差異(P>0.05),但仔細(xì)分析數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)FSLLRY-NH2組及PAR2siRNA組大鼠的BBB評(píng)分絕對(duì)值仍高于模型組,而SLIGRL-NH2組大鼠的BBB評(píng)分絕對(duì)值仍低于模型組。出現(xiàn)此種情況的可能原因?yàn)?本實(shí)驗(yàn)中造成的脊髓損傷重,傷后的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)緩慢,且干預(yù)PAR2對(duì)脊髓損傷后功能恢復(fù)的影響可能具有時(shí)間累積效應(yīng),以致傷后第7d還不足以表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但是,本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)傷后第7d各干預(yù)組GFAP及Vimentin蛋白的表達(dá)與模型組相比具有顯著差異(P<0.05),BBB評(píng)分結(jié)果似乎與此結(jié)果不一致,可能的原因?yàn)镻AR2對(duì)脊髓損傷后功能恢復(fù)的作用是通過影響GFAP及Vimentin蛋白的表達(dá)進(jìn)而影響神經(jīng)軸突生長(zhǎng)來完成,脊髓損傷后的功能恢復(fù)與GFAP及Vimentin蛋白的表達(dá)相比具有時(shí)間滯后性,因此在該兩種蛋白表達(dá)表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)差異時(shí),BBB評(píng)分卻未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這些結(jié)果表明在大鼠脊髓損傷早期激動(dòng)PAR2能促進(jìn)大鼠脊髓損傷后膠質(zhì)瘢痕形成早期損傷區(qū)GFAP與Vimentin的表達(dá),而抑制PAR2則可抑制該兩種蛋白的表達(dá),并改善脊髓損傷后膠質(zhì)瘢痕形成早期的后肢運(yùn)動(dòng)功能。從而初步證實(shí)了PAR2參與脊髓損傷后炎癥介導(dǎo)的膠質(zhì)瘢痕形成過程,PAR2可能是抑制損傷后膠質(zhì)瘢痕形成的治療靶點(diǎn)。然而,PAR2影響脊髓損傷后GFAP及Vimentin表達(dá)的具體機(jī)制是什么,目前尚未有直接研究證實(shí),但近年的研究卻提供了一些間接的線索。研究發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后損傷局部的炎癥細(xì)胞將釋放大量前炎癥因子,這些前炎癥因子不僅可以激活星形膠質(zhì)細(xì)胞中的PAR2,還可促進(jìn)PAR2在該細(xì)胞中的表達(dá)上調(diào)。ParkGH等在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)激活的PAR2能激活cJun氨基端激酶(c-JunN-terminalKinase,JNK),并觀察到星膠細(xì)胞形態(tài)變化;同時(shí),GadeaA等在細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)JNK激活后,GFAP及Vimentin表達(dá)增加、星膠細(xì)胞增生及反應(yīng)性膠質(zhì)化形成,而BernardiA在研究中發(fā)現(xiàn)抑制JNK激活后,GFAP表達(dá)下降。因此我們推