電針刺激足三里穴位對神經(jīng)病理性疼痛大鼠痛響應(yīng)磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響

電針刺激足三里穴位對神經(jīng)病理性疼痛大鼠痛響應(yīng)磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響

電針（ea）可以降低或治療神經(jīng)退行性疼痛（pd）。電針鎮(zhèn)痛機(jī)制主要分為阿片機(jī)制和非阿片機(jī)制,非阿片機(jī)制主要包括:激活大腦中的血清素能或去甲腎上腺素能下行抑制系統(tǒng)、增加生長抑素(somatostatin,SOM)表達(dá)和激活膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glialcellline-derivedneurotrophicfactor,GDNF)與生長因子α-1(GFRα-1)等。脊髓及背根神經(jīng)節(jié)中絲裂原激活蛋白激酶(mitogenactivatedproteinkinase,MAPK)家族在NP的發(fā)生和發(fā)展過程中起重要作用。本研究擬觀察EA對坐骨神經(jīng)結(jié)扎損傷(chronicconstrictioninjury,CCI)大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)p38MAPK表達(dá)的變化,以探討EA的鎮(zhèn)痛機(jī)制。方法1.cci大鼠模型建立及分組40只健康雄性Wistar大鼠(200~230g)被隨機(jī)均分為4組(n=10):對照組(Con組),不給予大鼠行任何處理。其余30只大鼠,參照BennettandXie的方法建立CCI模型:將大鼠用2%~3%的七氟烷進(jìn)行吸入麻醉,充分暴露右側(cè)坐骨神經(jīng)主干長約7mm,用4-0的羊腸線以寬度約2mm的間隔打4個(gè)松緊合適的結(jié)。操作結(jié)束后逐層縫合肌肉及皮膚;然后將CCI模型成功大鼠30只隨機(jī)分為3組(n=10):CCI組,模型成功后不予處置;假電針組(CCI+A組),對CCI大鼠進(jìn)行假電針治療,即只將針灸針插入雙側(cè)足三里穴位,但不給予電刺激;電針治療組(CCI+EA組),CCI大鼠,在造模成功后第15d開始給予電針刺激治療。2.“足三里”穴位的選取在安靜舒適的環(huán)境中,每天上午9:00~10:00將模型成功大鼠放置于自制固定裝置,能夠暴露四肢及尾部,但不能自由活動(dòng)。待大鼠安靜后,根據(jù)先前的文獻(xiàn)描述選取“足三里”穴位,將華佗牌針灸針(直徑:0.25mm;長度:30mm;蘇州醫(yī)療用品廠有限公司,蘇州)插入雙側(cè)“足三里”穴位,深度約為5mm。然后將電刺激儀(長城牌KWD-808,杭州丹頓醫(yī)療器械有限公司,杭州)連接在兩只針灸針上,給予連續(xù)波(頻率:2HZ,強(qiáng)度:3mA)進(jìn)行電刺激治療。從模型成功后第15天開始,每天1次,每次20min,連續(xù)治療7次。3.環(huán)境適應(yīng)測定觀察各組大鼠的一般生長情況,并記錄大鼠體重、飲食等情況。分別在實(shí)驗(yàn)前及實(shí)驗(yàn)的第7、14、21d,測定大鼠的熱縮足反射潛伏期(pawwithdrawalthermallatency,PWL)和機(jī)械縮足反應(yīng)閾值(pawwithdrawalmechanicalthreshold,PWT)。測定前所有大鼠都在被測裝置中進(jìn)行每天15min的環(huán)境適應(yīng),共兩天。(1)PWL的測定:設(shè)定熱板儀(modelYLS-6B,益延科技發(fā)展有限公司,山東)的溫度為52℃,使大鼠的基礎(chǔ)PWL為15s左右,并在實(shí)驗(yàn)過程中保持一致。將大鼠置于安靜舒適的環(huán)境中,等待大鼠的梳理和探究活動(dòng)基本消失;然后將大鼠放到熱板儀上,當(dāng)大鼠迅速抬足、舔足時(shí),記錄此刻的時(shí)間,即為PWL。每只鼠測3次,每次間隔10min,取3次的平均值作為PWL值。(2)PWT的測定:將大鼠置于金屬網(wǎng)格籠子(18cmx8cmx8cm)中,先讓大鼠適應(yīng)環(huán)境;待大鼠的梳理和探究活動(dòng)基本消失,足底伸展適中后,用范圍是0.6~15.0g的vonFrey纖維絲(Stoelting公司,美國)刺激大鼠右足底測定PWT。測量時(shí)將vonFrey纖維絲從鐵絲網(wǎng)格籠子下方豎直向上抵住大鼠右后肢足底中心部,使之彎成S形,持續(xù)5~6s;在刺激時(shí)間內(nèi)或在移開vonFrey纖維絲時(shí)大鼠有抬足、躲避、舔足等動(dòng)作則視為陽性反應(yīng),而身體活動(dòng)所引起的縮足反應(yīng)不記作陽性反應(yīng)。按Chaplan等報(bào)道的“upanddown”的方法,計(jì)算大鼠50%機(jī)械縮足反射閾值。每只鼠測3次,每次間隔10min。4.術(shù)后運(yùn)動(dòng)情況參照Hwang所描述的方法,分別觀察實(shí)驗(yàn)前及實(shí)驗(yàn)后第7、14、21d,電針治療后大鼠受累后肢的運(yùn)動(dòng)情況。將運(yùn)動(dòng)功能共分為4級(jí):0分沒有運(yùn)動(dòng)改變,正常行走;1分輕度運(yùn)動(dòng)功能減弱,對足底的刺激縮爪反應(yīng)正常;2分自主活動(dòng)減弱,中度運(yùn)動(dòng)功能減弱,正常行走,對足底的刺激有縮爪反應(yīng),但減弱;3分不能自主活動(dòng),不能行走。有拖爪現(xiàn)象,對足底的刺激沒反應(yīng)。5.免疫陽性細(xì)胞的表達(dá)在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將大鼠全部在深麻醉下進(jìn)行灌注、取材、固定。首先經(jīng)鼠尾靜脈行全身肝素化,然后左心室插管灌注250ml的4℃鹽水,繼之灌注4%多聚甲醛250ml。灌注完畢后固定2h,在冰板上將大鼠右側(cè)的L4~6背根神經(jīng)節(jié)取下,置于多聚甲醛中4℃固定備用。按照試劑的說明及免疫組化的步驟將磷酸化p38(p-p38MAPK)的一抗(CellSignaling公司,美國)按1:200的濃度滴加在組織切片上,經(jīng)過二抗孵化、DAB復(fù)染等步驟,最后在顯微鏡下觀察p-p38MAPK免疫陽性細(xì)胞的表達(dá)。陽性細(xì)胞參照文獻(xiàn)進(jìn)行計(jì)數(shù):隨機(jī)選取每組大鼠的背根神經(jīng)節(jié)切片,在400倍的視野下,每張切片上隨機(jī)選取6個(gè)視野進(jìn)行觀察,以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒計(jì)為陽性細(xì)胞。采用雙盲法在具有網(wǎng)格測微尺的目鏡下觀察并計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)及陽性細(xì)胞個(gè)數(shù),計(jì)算陽性細(xì)胞的平均百分率。6.資料處理及測量方差分析數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件處理,正態(tài)計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,組間比較采用單因素方差分析,連續(xù)性資料采用重復(fù)測量方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.cci+ea對大鼠坐骨神經(jīng)粘結(jié)模型的影響Con組大鼠生長狀況良好,體重均衡提高,飲食狀況良好。其余3組CCI大鼠生長狀況良好,飲食良好,體重提高較慢,但與Con組比較無顯著性差異。CCI模型成功大鼠均出現(xiàn)了典型的坐骨神經(jīng)結(jié)扎模型的姿勢:跛行、受累后肢外翻及受累后肢肌肉萎縮等癥狀。但在CCI+EA組,大鼠跛行、后肢外翻等癥狀都得到了一定的改善。實(shí)驗(yàn)過程中CCI組和EA組中各死亡大鼠1只、CCI組大鼠出現(xiàn)自噬1只、CCI+A組大鼠中有1只未出現(xiàn)痛覺過敏,均被篩選出去,在實(shí)驗(yàn)過程中對應(yīng)補(bǔ)齊數(shù)據(jù)。2.4骨神經(jīng)結(jié)構(gòu)特征4組大鼠的PWL基礎(chǔ)值相近,相互之間無顯著性差異。CCI大鼠從坐骨神經(jīng)結(jié)扎后第3d開始PWL即開始降低,并于第14d降到最低。第21dCCI+EA組PWL顯著高于CCI、CCI+A組(P<0.05,見表1)。PWT變化趨勢同PWL(見表2)。3.運(yùn)動(dòng)障礙dCon組大鼠未出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)功能改變,運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分為0。其余3組大鼠受累后肢于實(shí)驗(yàn)開始第3d出現(xiàn)明顯的運(yùn)動(dòng)功能障礙。CCI組和CCI+A組大鼠運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分持續(xù)升高,而CCI+EA組大鼠受累后肢的運(yùn)動(dòng)功能從第2次電針治療后(即第16d)就開始逐漸改善,CCI+EA組和CCI組、CCI+A組比較,運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分顯著地降低(P<0.05,見表3)。4.cci和cci+a對大鼠免疫陽性細(xì)胞的影響免疫組化結(jié)果顯示:p-p38MAPK陽性細(xì)胞為棕黃色的胞漿或胞核著色,多數(shù)呈圓形或橢圓形。在Con組大鼠背根神經(jīng)節(jié)中p-p38MAPK免疫陽性細(xì)胞的表達(dá)較少(7.37%±0.64%),而在CCI組(61.57%±2.22%)及CCI+A組(63.20%±1.44%)大鼠中的表達(dá)則顯著升高。經(jīng)過電針治療后,CCI+EA組(15.38%±1.77%)大鼠背根神經(jīng)節(jié)中p-p38MAPK陽性細(xì)胞數(shù)顯著低于CCI組及CCI+A組(見圖1,2,P<0.05)。背根神經(jīng)節(jié)中p-3gpbk表達(dá)的變化本實(shí)驗(yàn)成功復(fù)制了CCI模型,PWL、PWT和運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分顯著下降,免疫組化結(jié)果顯示CCI模型大鼠背根神經(jīng)節(jié)中活化的p-p38MAPK表達(dá)有顯著升高。電針刺激“足三里”穴位改善了CCI大鼠痛覺過敏癥狀和受累后肢運(yùn)動(dòng)功能,同時(shí)抑制背根神經(jīng)節(jié)中p-p38MAPK的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn):MAPK是信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)部的重要傳遞者,通過對轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化來調(diào)節(jié)參與細(xì)胞反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá),包括p38MAPK、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellularsignalregulatedkinase,ERK)和c-jun氨基末端激酶(c-junN-terminalkinase,JNK)。p38MAPK通過對細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、蛋白合成和受體表達(dá)等的調(diào)節(jié),在神經(jīng)元的可塑性變化及痛覺信息轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用。Katsura等發(fā)現(xiàn):在脊神經(jīng)結(jié)扎模型(SNL)中,脊神經(jīng)損傷的同側(cè)脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞p-p38MAPK免疫熒光水平和蛋白水平均明顯增加,而神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞中則無表達(dá),這表明小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)p38MAPK的活化在NP中起重要作用。而CHU等發(fā)現(xiàn):在坐骨神經(jīng)結(jié)扎后的大鼠的同側(cè)背根神經(jīng)節(jié)中p-p38MAPK表達(dá)是增強(qiáng)的;本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示CCI大鼠背根神經(jīng)節(jié)中p-p38MAPK隨著機(jī)械痛覺過敏及熱痛覺過敏的形成而表達(dá)增強(qiáng),與CHU的研究結(jié)果一致。再次證明了磷酸化的p38MAPK在神經(jīng)病理性疼痛的形成及發(fā)展過程中的重要作用。中右下角有,但是顯示不清楚,排版時(shí)請加粗)但是遺憾的是我們并未對背根神經(jīng)節(jié)中的神經(jīng)細(xì)胞使用特異性標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記,因此不能夠明確的表明p-p38MAPK是在何種細(xì)胞中表達(dá)的,我們將在以后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行深入的研究。38MAPK38MAPK陽性細(xì)胞率的比較nthefourgroupsatthe;*P<0.05,ComparedLao等研究發(fā)現(xiàn):EA可減輕弗氏完全佐劑誘導(dǎo)的痛覺過敏模型中大鼠的疼痛,EA的抗痛覺過敏呈參數(shù)依賴和穴位特異性。3mA電針在痛覺過敏的治療上比低強(qiáng)度(1~2mA)有效,作用20min效果最佳;2Hz電流對減輕冷痛覺異常比100Hz的電針效果更好;盡管EA對NP有較好的鎮(zhèn)痛效果,但具體機(jī)制尚不清楚,目前認(rèn)為可能有阿片機(jī)制和非阿片機(jī)制。非阿片機(jī)制主要包括:抑制脊髓中COX-2的表達(dá);激活膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)與生長因子α-1(GFRα-1);增加生長抑素(SOM)表達(dá);抑制神經(jīng)元活化,調(diào)節(jié)脊髓神經(jīng)元可塑性;抑制孤啡肽及抑制下丘腦蛋白表達(dá)等。本實(shí)驗(yàn)顯示EA刺激“足三里”穴位能夠有效的降低CCI模型背根神經(jīng)節(jié)中p-p38MAPK蛋白的表達(dá),同時(shí)隨著p-p38MAPK表達(dá)的降低,痛覺過敏及大鼠受累后肢的運(yùn)動(dòng)功能也得到了良好的改善。Chang等在完全弗氏佐劑誘導(dǎo)炎性痛模型中證明,EA刺激“足三里”和“昆侖”兩個(gè)穴位,能夠有效抑制脊髓中p-p38MAPK的表達(dá),此結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)一致。因此,我們推論抑制背根神經(jīng)節(jié)中p-p38MAPK的表達(dá)可能是EA治療NP的機(jī)制之一。本實(shí)驗(yàn)采用的CCI模型制備簡單,對大鼠的損傷小,模型成功率高?！白闳铩毖ㄎ?/p>