電針神經(jīng)干細胞對脊髓全橫斷大鼠術后運動功能恢復的影響

電針神經(jīng)干細胞對脊髓全橫斷大鼠術后運動功能恢復的影響

根據(jù)現(xiàn)有的神經(jīng)干預研究，對脊柱損傷的移植（ius）進行了治療。其目標是觀察移植到骨髓中的nsi在骨髓中的生存、遷移、分化和修復受損骨髓的組織結構。這些研究表明,NSCs移植在治療脊髓損傷方面有一定的應用前景。國內許健鵬和徐斌等應用督脈電針治療脊髓損傷病人,觀察到患者的運動功能有一定的恢復。我們也應用督脈電針治療全橫斷脊髓大鼠,發(fā)現(xiàn)受損傷脊髓組織結構和后肢運動功能有一定的修復。最近有研究表明,針刺促進受損傷脊髓發(fā)生可塑性變化與其表達神經(jīng)營養(yǎng)素-3(neurotrophine-3,NT-3)增加有關。為此,本研究聯(lián)合應用督脈電針與神經(jīng)干細胞移植,為臨床脊髓損傷探索新的治療策略。材料和方法1.每組的gg的分組將20只成年雌性SD大鼠(體重220～250g)分為4組,每組5只;即督脈電針+神經(jīng)干細胞移植組(電針神經(jīng)干細胞組)、督脈電針組(電針組)、神經(jīng)干細胞移植組(神經(jīng)干細胞組)和對照組。2.動物單次注射激素在上述4組動物腹腔內注射戊巴比妥鈉(25～30mg/kg)進行麻醉,在無菌條件下切開皮膚,分離肌肉,切除T8和T9脊柱椎板暴露脊髓,在T10脊髓段做全橫斷。隨后在橫斷處填入約2mm×2mm×2mm的明膠海綿。其中電針神經(jīng)干細胞組和神經(jīng)干細胞組的明膠海綿內含有10μl神經(jīng)干細胞,電針組和對照組的明膠海綿內含有10μlDMEM/F12培養(yǎng)液。逐層縫合肌肉和皮膚。術后每只動物腹腔內注射青霉素5萬單位/d,連續(xù)3d,人工排尿。術后各組動物均飼養(yǎng)65d。3.神經(jīng)胞培養(yǎng)液制備在無菌條件下獲取SD乳鼠(出生1～2d內)的海馬,置D-Hank液中剪碎,放入離心管離心后去上清液,再加入0.25%胰蛋白酶消化10min(37℃)。用含有胎牛血清的培養(yǎng)液終止酶消化,經(jīng)離心后棄上清液。加入DMEM/F12(含20μg/LbFGF和20ml/LB27)無血清培養(yǎng)液,用吸管吹打成細胞懸液。用200目濾器過濾細胞,離心棄上清液。再加入DMEM/F12培養(yǎng)液,行細胞計數(shù)后制成1×104個細胞/ml的細胞懸液移入培養(yǎng)瓶,置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內進行培養(yǎng)。每5～7d半量更換培養(yǎng)液,行傳代培養(yǎng)。取第2代培養(yǎng)7～8d的神經(jīng)干細胞,用核熒光Hoechst33342(10mg/LMDEM/F12培養(yǎng)液配制)孵育2h。收集核熒光標記好的神經(jīng)干細胞,經(jīng)細胞計數(shù)后制備濃度為8×106個細胞/μl的神經(jīng)干細胞懸液,抽取10μl細胞懸液注入到脊髓橫斷處的明膠海綿內。核熒光標記移植細胞的目的是追蹤移植入脊髓橫斷處的神經(jīng)干細胞存活和分化為神經(jīng)元樣細胞和星形膠質樣細胞情況。4.腰椎近同穴中主刑兩種典型脈內固定電針神經(jīng)干細胞組和電針組動物在術后第5d開始接受隔日1次的電針治療。選擇2組穴位:第1組為兩個督脈阿氏穴,位于脊髓橫斷處上、下約兩個脊髓節(jié)段(T7～8和T11～12)的椎體棘突之間。第2組為督脈的脾俞和長強穴。在這4個穴位的進針深度為穿皮后再進針約2mm,刺激強度為12～15mV(以觀察到動物全身肌肉輕微顫動為度),頻率為疏密波,留針時間為15min。5.術后運動能力測試對4組動物進行日常行為學的拍攝錄像。參照Basso等提出的脊髓損傷大鼠功能恢復評判標準(BBB評分法),對所有動物后肢運動能力進行評估。采用Ramon-Cueto等的爬網(wǎng)格測試方法,對術后4組動物進行爬網(wǎng)格訓練(45°斜坡),觀察其后肢運動的恢復情況。BBB評分和爬網(wǎng)格測試均在術后55d～58d進行,每只動物各測試3次,測試時間為:BBB評分2min/次;網(wǎng)格測試5min/次,取平均分值。6.皮質誘發(fā)電位測量各組動物均在術后65d進行電生理測試。采用氯醛糖(20mg/kg)和1%戊巴比妥鈉(30mg/kg)聯(lián)合腹腔注射麻醉后,將大鼠固定于腦立體定位儀上,暴露雙側坐骨神經(jīng)。參照大鼠腦立體定位圖譜,在對應雙側皮質軀體感覺運動區(qū)的部位打開顱骨,剝去表面腦膜,暴露大腦皮質。將1根電極與坐骨神經(jīng)接觸,另1根電極與大腦皮質表面接觸。另外,參考電極插入頭皮下,地線插入鼠尾。所有電極均接駁在Biolap-410智能型生物信號顯示與處理儀上。測試時先在一側坐骨神經(jīng)上的電極接刺激電源,同時在相應大腦皮質上的電極接記錄端口。選用粗電壓作單刺激,波寬1ms,強度1mV,記錄皮質體感誘發(fā)電位(corticalsamatosensoryevokedpotential,CSEP)。每只動物分別收集10個以上的穩(wěn)定波型。然后更換電極連接,即坐骨神經(jīng)上的電極接記錄端口,而大腦皮質上的電極接刺激電源,記錄皮質運動誘發(fā)電位(corticalmotorevokedpotential,CMEP)。記錄完一側的誘發(fā)電位后按同樣方法檢測另一側坐骨神經(jīng)與軀體感覺運動區(qū)皮質之間的誘發(fā)電位。測量所有大鼠的CSEP和CMEP潛伏期(latency)和峰峰值(amplitude),并進行統(tǒng)計學分析。7.織物檢測7.1動物樣品的采集用1%戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔內注射麻醉上述術后65d的4組動物,開胸經(jīng)左心室插管至主動脈。先快速灌注每100ml含1%亞硝酸鈉0.2ml和肝素200IU的生理鹽水約180ml,隨后灌注含有4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸緩沖液(pH7.4)固定動物。取T8～T12脊髓段置入上述新鮮固定液中做后固定(4℃過夜),再放入30%蔗糖溶液浸泡至沉底(4℃)。將T8～T12脊髓段作連續(xù)冰凍縱切片,片厚均為20μm。組織切片先在熒光顯微鏡下觀察、拍攝核熒光標記的神經(jīng)干細胞,再留作免疫細胞化學及組織學染色。7.2組織切片及顯色試劑取各組動物T8～T12脊髓段縱切片分別做nestin、NF(neurofilament)和GFAP(glialfibrillaryacidicprotein)免疫細胞化學染色。3種一抗均購自SantaCruzBiotechnology公司,二抗、生物素及DAB顯色試劑均購自博士德公司。nestin、NF和GFAP的一抗工作濃度為1∶600。先用H2O2-甲醇液固定組織切片20min,洗3次,各5min;用正常山羊血清封閉20min;室溫下滴加一抗孵育2h,洗3次,各5min;生物素化二抗孵育30min,洗3次,各5min;SABC復合液孵育20min,PBS洗4次,各5min;DAB顯色約3min。經(jīng)脫水、二甲苯透明后,中性樹膠封片。以PBS代替一抗作為陰性對照染色。7.3熒光標記檢測在放置顯微測試方格的顯微鏡下分別計數(shù)脊髓橫斷處附近即顯示核熒光標記又具有nestin、NF或GFAP免疫細胞化學染色陽性的雙標細胞。每只動物計數(shù)5張切片,每張切片測4個視野,每組5只動物共計測試100個視野。測試數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理。7.4四肢肌肉的重量將固定好的4組動物后肢肌肉按肌群組分離,并稱量其濕重,比較各組間的肌肉濕重差別,并行統(tǒng)計學分析。結果1.行為測試的結果1.1術后關節(jié)活動觀察對照組大鼠經(jīng)T10脊髓段全橫斷手術后,其后肢隨即完全癱瘓。此組動物在地面或斜坡網(wǎng)格爬行時,雙后肢通常被拖在身體的后方(圖2),沒有觀察到后肢關節(jié)活動,按BBB法評分為0分。而其他各組大鼠在連續(xù)2min地面爬行過程中,后肢均顯示不同程度的關節(jié)和肌肉運動。依BBB評分測評,電針神經(jīng)干細胞組評分優(yōu)于電針組和神經(jīng)干細胞組(表1)。1.2組大鼠術后運動情況術后50d,每組5只受試動物在5min內應用后肢爬行0.7m長、45°斜面的網(wǎng)格坡道,并攀上平臺。對照組大鼠后肢無運動,只能依靠前肢拖行(圖2),該組無1只攀上平臺。其他3組大鼠均能不同程度地利用后肢運動攀爬,有些還能用后肢支撐爬行(圖3)。神經(jīng)干細胞組有2只攀上平臺;電針組有3只攀上平臺;電針神經(jīng)干細胞組有5只攀上平臺。2.髓內提高--三亞甲基-3-現(xiàn)有小鼠骨髓中主反應波形的檢測正常大鼠皮質體感誘發(fā)電位(CSEP)和皮質運動誘發(fā)電位(CMEP)的主反應均呈先正后負的PN型波(圖1)。當脊髓全橫斷后立即檢測CSEP和CMEP,記錄到的波形均無明顯的PN波型或近水平的規(guī)則波浪線(圖1)。存活65d的4組脊髓全橫斷大鼠均能檢測到主反應波形。不論是CSEP還是CMEP,從潛伏期和峰峰值都能看出脊髓損傷后可導致誘發(fā)電位發(fā)生顯著的潛伏期增長和峰峰值變小(圖1)。經(jīng)電針刺激治療后,電針神經(jīng)干細胞組的潛伏期和峰峰值均較電針組和神經(jīng)干細胞組有較明顯的改善,但與正常大鼠比較(特別是峰峰值)有顯著性差異(表2,3)。3.免疫細胞化學染色采用縱切面、HE染色觀察各組大鼠脊髓損傷區(qū)組織,可大致劃分為3個區(qū)域:脊髓殘端、網(wǎng)狀區(qū)和疤痕結構,而移植神經(jīng)干細胞主要集中在脊髓殘端與網(wǎng)狀區(qū)的交界處。免疫細胞化學染色顯示神經(jīng)干細胞移植區(qū)含有核熒光標記的nestin陽性細胞(圖6,7)、NF陽性細胞(圖8,9)和GFAP陽性細胞(圖10,11),表明移植的神經(jīng)干細胞已有部分分化為神經(jīng)元樣細胞和星形膠質樣細胞,并長出突起(圖4,5)。細胞計數(shù)顯示電針神經(jīng)干細胞組雙標陽性染色的細胞數(shù)量與神經(jīng)干細胞組比較有明顯增加(表4)。4.電針神經(jīng)干細胞和電針神經(jīng)干細胞對大鼠肌群濕重的影響雙側后肢肌群濕重稱量顯示(表5),肌肉萎縮最明顯的是對照組,而萎縮較輕的是電針神經(jīng)干細胞組和電針組,這兩個組大鼠的肌群濕重無顯著性差異。因此,提示電針刺激能減少(或延緩)脊髓全橫斷大鼠雙側后肢肌肉萎縮。督脈電針治療髓中神經(jīng)胞體的電針刺激是落實髓神經(jīng)功能的重要方法已有研究表明,移植的神經(jīng)干細胞能在脊髓損傷區(qū)存活、遷移和分化,同時能促進脊髓損傷大鼠肢體運動功能的恢復。據(jù)認為,這與脊髓損傷區(qū)及其鄰近組織分泌的神經(jīng)營養(yǎng)因子所起的作用有關。本研究也觀察到同樣的結果,神經(jīng)干細胞移植區(qū)有帶有核熒光標記的nestin陽性細胞、NF陽性細胞和GFAP陽性細胞,表明移植的神經(jīng)干細胞已有部分分化為神經(jīng)元樣細胞和星形膠質樣細胞。移植的神經(jīng)干細胞一方面受到脊髓損傷區(qū)及其鄰近組織分泌的內源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的影響;另一方面它們也可能會合成和分泌一些神經(jīng)營養(yǎng)活性物質。在這兩類神經(jīng)營養(yǎng)活性物質作用下,有可能促使脊髓損傷區(qū)的結構恢復,從而促進脊髓全橫斷大鼠后肢運動功能的恢復。但是,這種運動功能恢復的程度是有限的。為了能更好地促進脊髓全橫斷大鼠后肢運動功能的恢復,本研究聯(lián)合應用神經(jīng)干細胞移植與督脈電針,利用電針刺激引起脊髓全橫斷損傷大鼠機體反應,促使其脊髓合成和分泌更多的內源性神經(jīng)營養(yǎng)因子,從而促進移植的神經(jīng)干細胞存活和分化以及修復受損傷脊髓大鼠的后肢運動功能。臨床上一直有用督脈電針治療脊髓損傷病人的方案,并取得一些療效。選擇督脈進行電針刺激與其在機體走行和分布有關。中醫(yī)針灸理論認為,督脈循行于脊柱正中,手、足三陽經(jīng)均與督脈交匯,具有總督一身之陽經(jīng)、調節(jié)陽經(jīng)經(jīng)氣的作用。所以采用針灸治療脊髓損傷時,督脈是首選穴位。本研究選擇一組督脈阿氏穴是位于脊髓全橫斷處上、下兩個脊椎的棘突間;另一組為督脈的腰俞穴和長強穴。腰俞穴正對應于脊髓馬尾的根部,在此穴給予電針刺激可能會影響到分布在腰、骶部的諸多脊神經(jīng)的分支。而長強穴是支配陰部和尾部神經(jīng)必經(jīng)之處。從解剖學構造看,這4個穴位的電針刺激可以直接作用于脊髓創(chuàng)傷處鄰近脊髓節(jié)段和腰、骶段脊髓所發(fā)出的脊神經(jīng)分支,從而影響脊髓內部結構的變化。從我們先前采用督脈電針治療脊髓全橫斷大鼠的研究知道,督脈電針治療后脊髓損傷處的組織潰變減輕,空泡減少變小;大腦皮質感覺運動區(qū)和腦干紅核的神經(jīng)元胞體密度恢復性增加;在脊髓橫斷處尾側組織注射熒光金逆行標記再生神經(jīng)纖維,觀察到脊髓橫斷處頭側端的脊髓組織、腦干紅核和大腦皮質感覺運動區(qū)有少量被熒光金標記的神經(jīng)元胞體。這表明,督脈電針治療不僅能減輕脊髓的繼發(fā)性損傷,而且能促使受損傷的中樞神經(jīng)元存活及其軸突再生。這可能與上述研究中觀察到督脈電針治療后,受損傷的脊髓組織內生長相關蛋白-43(growthassociatedprotein-43,GAP-43)表達增強有關。已知GAP-43是神經(jīng)元特有的一種磷酸化糖蛋白,在神經(jīng)元發(fā)生、發(fā)育及其軸突再生以及突觸形成中起重要作用。在本研究中,聯(lián)合應用督脈電針與神經(jīng)干細胞移植治療的脊髓損傷大鼠,其后肢關節(jié)和肌肉活動、后肢攀爬運動、誘發(fā)電位潛伏期和峰峰值以及后肢肌肉萎縮程度等指標都得到較明顯的改善,表明督脈電針治療與神經(jīng)干細胞移植之間有較好的協(xié)同作用。這為繼續(xù)研究督脈電針與神經(jīng)干細胞移植聯(lián)合應用促進脊髓全橫斷大鼠后肢運動功能恢