多重腦震蕩后大鼠中縫核團內5-羥色胺的表達

多重腦震蕩后大鼠中縫核團內5-羥色胺的表達

運動腦振動（src）是目前常見的運動損傷類型，尤其是在運動員接近和競爭激烈的體育比賽項目中。雖然SRCC多數為輕型頭部損傷,但在一次腦震蕩(cerebralconcussion,CC)損傷后一部分傷者會出現頭痛、頭暈、注意力不集中、記憶不良等學習記憶等方面的障礙;如果運動員經歷CC后還沒有完全恢復,又遭受第二次CC后會出現更嚴重的神經與學習記憶方面的障礙,甚至死亡。美國運動醫(yī)學界將其定義為二次沖擊綜合征(second-impactsyndrome,SIS)。由于目前關于CC的機理仍然不清,故臨床和運動醫(yī)學也難以對SIS的機理進行合理的解釋,對于SRCC和SIS后學習認知行為相關腦區(qū)的神經病理學變化研究也未見報道。5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)是腦內重要的神經遞質,它對認知功能、交感神經系統(tǒng)的興奮、人體運動功能、疼痛和食欲等方面均起著重要的調節(jié)作用。國內外一些實驗研究及臨床證據表明:5-HT能神經系統(tǒng)在腦損傷后發(fā)生了紊亂,主要表現為腦損傷后腦內不同腦區(qū)5-HT合成和/或釋放增多,或5-HT代謝增強等。但這些變化僅僅來自于一次腦損傷的研究結果,它是否適用于SRCC和SIS還有待于進一步研究。所以,本實驗通過復制多重腦震蕩(MCC)大鼠模型,應用免疫組織化學技術研究MCC后腦干中縫核團內5-HT免疫陽性產物及合成5-HT的限速酶-色氨酸羥化酶(TPH)的表達變化,旨在為進一步研究5-HT是否對MCC和SIS后的認知障礙產生影響提供形態(tài)學依據。材料和方法1.動物供應中心健康雄性SD大鼠56只,體重295±15g,購自昆明醫(yī)學院動物供應中心。隨機分為7組:對照組,多重腦震蕩傷后1、2、4、8、16、24d組(每組n=8)。2.模型的建立與發(fā)展采用于建云等研制的金屬單擺打擊裝置給SD大鼠額頂部連續(xù)三次鈍性打擊(1次/d,連續(xù)3d打擊),復制出具有三次一過性腦功能障礙的MCC大鼠模型。3.抗生物素活性各組動物定時用1%戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉,含4%多聚甲醛的磷酸緩沖液(PB)灌注固定取腦,連續(xù)冰凍切片,厚15μm。用抗5-HT、抗TPH抗體進行免疫組織化學SP法染色,具體步驟如下:用檸檬酸鹽抗原修復液(pH6.0)進行抗原熱修復,一抗為兔抗5-HT多克隆抗體(1∶2000,購于第四軍醫(yī)大學組胚教研室)或綿羊抗TPH多克隆抗體(1∶1200,Chemicon公司),4℃孵育24h;生物素標記的二抗(羊抗兔IgG,1∶150,邁新公司,室溫孵育15min)或(兔抗綿羊IgG,1∶300,KirkegaardandPerryLabs,室溫孵育1h);鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶溶液(SP,1∶150,邁新公司),室溫孵育10min;DAB顯色,室溫孵育10min?？瞻讓φ沼?.01mol/L的PBS代替一抗;置換實驗用正常羊血清或小牛血清代替一抗,其余步驟不變。4.量腦干中縫核團內5-ht和tph陽性反應物的平均粒度值應用HPIAS-1000高清晰圖像文分析系統(tǒng)分別測量腦干中縫核團內5-HT能神經元胞漿內5-HT和TPH陽性反應物的平均灰度值(注:灰度值與所測物質的濃度成反比,即灰度值越大,表示所測物質的濃度越小)。5.單因素方差分析及q檢驗應用SPSS11.0軟件包對圖像分析測定的結果進行單因素方差分析及兩兩比較的q檢驗,數據采用均數±標準誤(xˉ±Sxˉ)(xˉ±Sxˉ)表示,凡P<0.05被認為有統(tǒng)計學意義。結果1.各組tph免疫陽性反應比較TPH免疫陽性產物的表達主要定位于胞漿內,呈棕黃色,胞核不著色。陰性對照實驗未見著色,說明此免疫組化實驗具有特異性。MCC后1d組,中縫背核(dorsalraphenucleus,DR)內TPH免疫陽性反應的產物有所升高,2d組達到高峰,與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。正中中縫核(medianraphenucleus,MnR)內TPH免疫陽性反應產物在傷后1d時明顯升高(P<0.01);2d組陽性反應最強(P<0.01),4、8d組陽性反應有所減弱,但仍明顯高于對照組(P<0.05);24d組基本恢復正常。中縫大核(raphemagnusnucleus,RMg)內TPH免疫陽性反應產物在傷后1、2、4、8d升高,與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其中以1d組陽性反應最強(P<0.01),16、24d組基本恢復。中縫蒼白核(raphepallidusnucleus,RPa)內TPH免疫陽性反應產物在傷后1、2、4d升高,與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),其中以4d組陽性反應最強(P<0.01),24d組基本恢復(表1,Figs.1A-1F)。2.皮膚免疫反應陽性產物的表達5-HT免疫陽性產物的表達主要定位于胞漿內,呈棕黃色,胞核不著色。陰性對照實驗未見著色,說明此免疫組化實驗具有特異性。與對照組比較,中縫背核內5-HT免疫陽性反應產物的表達在傷后1d時明顯升高(P<0.05),2d達到高峰(P<0.01),4、8d組有所減輕,但仍均高于對照組(P<0.05),16、24d組與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義。正中中縫核內5-HT免疫反應陽性產物在傷后2、4d時高于對照組(P<0.05),其中2d組達到高峰,16、24d組基本恢復正常。中縫大核和中縫蒼白核內5-HT免疫反應陽性產物的表達也在傷后出現升高,但各損傷組與對照組相比差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05,表2,Figs.1G-1L)。中縫小體中5-ht的表達國內外許多研究表明:腦損傷后不同時間內腦組織內5-HT含量升高;血漿、腦脊液中5-HT的濃度明顯升高。但是,這些實驗結果僅針對開放性腦損傷。于是,有學者對實驗性腦震蕩腦內5-HT遞質的變化進行了研究,發(fā)現在腦震蕩后早期,腦組織內5-HT含量升高。本實驗所顯示的MCC后早期大鼠腦干中縫核團內TPH和5-HT免疫反應陽性產物增強的結果與以往的報道相似,進一步證實了腦損傷后早期腦干內5-HT能神經元的活性確實有所增強。關于腦損傷后早期腦干中縫核團內TPH和5-HT增高的原因,可能是腦損傷后神經元過度興奮的一種反應。有資料表明,腦損傷時作用于神經系統(tǒng)的瞬間機械暴力達到一定程度,導致廣泛的神經元過度興奮,Ca2+通道開放,大量細胞外的Ca2+迅速進入細胞;同時由于損傷導致局部組織缺血缺氧,能量代謝障礙,Na+-K+-ATP酶活性下降,ATP酶耗竭,鈣泵活性受到抑制,使細胞內Ca2+的轉出減少。這些因素共同作用造成細胞內Ca2+處于超載狀態(tài)。一方面,大量的Ca2+可促使突觸前成分釋放5-HT增多,突觸前終末內5-HT的含量減少,從而通過反饋調節(jié)機制使胞體中的5-HT的合成進一步增加;另一方面,神經元內TPH的活性也可被Ca2+激活而提高,加速了5-HT的合成,造成5-HT大量堆積。本實驗結果中,中縫背核(DR,B7群)和正中中縫核(MnR,B6+B8群)神經元內TPH和5-HT免疫反應陽性產物的表達均在傷后2d達到高峰,說明MCC后DR和MnR內TPH蛋白表達增強,活性增高,進而使5-HT合成增多。中縫大核(RMg,B3群)和中縫蒼白核(RPa,B1群)神經元內TPH免疫反應陽性產物的表達也分別在傷后1d和4d最強,而RMg和RPa神經元內5-HT免疫反應陽性產物的表達在傷后變化不明顯。我們推測這種陽性反應表達的非同步性可能是由于合成5-HT的前體氨基酸-色氨酸在RMg和RPa內含量不足,或者是在RMg和RPa中表達的TPH不能完全發(fā)揮其生物學活性,而使RMg和RPa內5-HT表達的增高不明顯所致。TPH作為合成5-HT的限速酶,在反應過程中需要有輔酶四氫生物喋呤(BH4)的參與,如果BH4不足或缺失,TPH將不能完全催化底物生成足夠的產物。RMg和RPa中TPH的表達高于5-HT的表達,這種不一致性,究竟是由于RMg和RPa內色氨酸攝取不足還是BH4的缺乏所致,其機理還有待于進一步深入研究。近年來,國外學者還在人和大鼠腦內發(fā)現有與5-HT釋放有關的蛋白質-5-HT轉運體(5-HTT),它在調節(jié)5-HT能神經元活動方面也有重要作用。5-HTTmRNA只分布在中縫5-HT神經元胞體內,在胞體中合成5-HTT后經軸漿運輸到神經末梢,在Na+介導下將釋放到突觸間隙的5-HT遞質重吸收到突觸前膜內存儲。因此,5-HTT被認為是一種不需要Ca2+介導的調節(jié)神經遞質釋放的物質,它在神經末梢對5-HT的釋放-再吸收循環(huán)發(fā)揮重要作用。目前,對腦內5-HTT