花生四烯酸細(xì)胞色素p450cyp表氧化酶代謝產(chǎn)物對牛主動脈內(nèi)皮細(xì)胞的影響

花生四烯酸細(xì)胞色素p450cyp表氧化酶代謝產(chǎn)物對牛主動脈內(nèi)皮細(xì)胞的影響

許多人類疾病都與血管生成有關(guān)。血管生成與個體發(fā)育、新生兒組織形成、傷口愈合、局部組織缺氧和其他生理病理過程非常重要。因此研究新的血管生成因子及其作用機(jī)制具有重要的臨床意義。內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、趨化和遷移是血管形成過程中必需的起始和中心環(huán)節(jié),因此研究血管生成促進(jìn)因子必須研究其對血管內(nèi)皮細(xì)胞及其功能有何影響。血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮其功能是通過其合成產(chǎn)生的各種生物活性因子來實現(xiàn)的,其中包括多種血管舒張物質(zhì),如一氧化氮(nitricoxide,NO)和前列環(huán)素(prostacyclin,PGI2)等。除NO和PGI2外,近年來發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞通過細(xì)胞色素P450(CYP)表氧化酶代謝花生四烯酸(arachidonicacid,AA)生成另外一種擴(kuò)血管因子——表氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoicacid,EET),這種因子通過激活鈣離子敏感的鉀通道,使平滑肌細(xì)胞處于超極化狀態(tài)而擴(kuò)張血管。對AA的研究已有多年,最為人們熟知的是通過環(huán)氧化酶和脂質(zhì)氧化酶途徑代謝,而經(jīng)表氧化酶(即AA代謝的第三條途徑)代謝產(chǎn)生四種EET(5,6-、8,9-、11,12-和14,15-EET)。與內(nèi)皮細(xì)胞中的擴(kuò)血管物質(zhì)NO和PGI2相比,EET對血管張力的調(diào)節(jié)在某些病理狀態(tài)下可能更有意義,目前已知NO和PGI2均能顯著改善缺血和促進(jìn)血管生長,而CYP表氧化酶和EET是否具有促進(jìn)血管生成的作用以及它們對血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、趨化、遷移的影響目前尚不清楚。本研究擬通過在內(nèi)皮細(xì)胞給予外源性的EET或表氧化酶基因的過度表達(dá)研究它們對內(nèi)皮細(xì)胞增殖、趨化、移行、類微血管結(jié)構(gòu)生成和血管生成的影響。材料和方法一、實驗材料1.菌株和抗cyp-843質(zhì)粒構(gòu)件:重組腺相關(guān)病毒(recombinantadeno-associatedvirus,rAAV)包裝質(zhì)粒pXX2、腺病毒輔助質(zhì)粒pXX6、真核表達(dá)載體pXXUF1(含綠色熒光蛋白序列)由美國Pittsburgh大學(xué)分子遺傳及生物化學(xué)系XiaoXiao博士饋贈。工程菌株E.coliDh5α由我科心血管研究室保存,293細(xì)胞購自ATCC(美國)。CYP2J2cDNA由美國國立衛(wèi)生部Zeldin博士饋贈,CYP102F87V突變DNA、CYP2C11OR[由大鼠CYP2C11與大鼠細(xì)胞色素P450氧化還原酶(CYPOR)融合構(gòu)建]、抗CYP2J2抗體和抗CYPF87V抗體由美國Vanderbilt大學(xué)Capdevila教授饋贈。CYP2J2為來源于人的表氧化酶,可以代謝花生四烯酸產(chǎn)生5,6-、8,9-、11,12-和14,15-EET,CYPBM3F87V選擇性增加內(nèi)源性14,15-EET的產(chǎn)生,CYP2C11OR主要代謝生成11,12-EET,同時也產(chǎn)生8,9-EET和14,15-EET。2.血管內(nèi)皮生長因子和血管內(nèi)皮生長因子各種限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶,堿性磷酸化酶購自寶生物工程大連有限公司,核酸分子量參照物購自NewEnglandBiolabs,質(zhì)粒大量提取試劑盒(WizardPlusMaxiprepsDNAPurificationSystem)為Promega公司產(chǎn)品,DNA快速純化回收試劑盒購自北京原平皓公司,蛋白酶K購自Sigma公司,胰蛋白胨和酵母提取物購自美國DIFCO公司。牛主動脈(武漢市血清制品廠),胰酶、DMEM、胎牛血清、Trizol(Gibco),10%DMEM[含10%胎牛血清、50mg/L肝素鈉、0.146g/L的L-谷氨酰胺、100μ/ml青霉素、100μ/ml鏈霉素]。噻唑藍(lán)(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbro-mide,MTT)、碘化吡啶、8,9-EET、11,12-EET、14,15-EET、HEPES、MEK抑制劑(2′-amino-3′-methoxyflavone,PD98059)、apigenin、PI3K抑制劑[2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one,LY294002]、H7、土溫20、苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonylfluoride,PMSF)、抑肽酶、表氧化酶抑制劑(17-octadecynoicacid,17-ODYA)、一氧化氮合酶抑制劑L-單甲基精氨酸(NG-methyl-L-arginine,NG-methyl-L-arginine,L-NMMA)(Sigma,St.Louis,MO)。血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)購自美國CollaborativeBiomedicalProductsA,兔抗表皮生長因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR)和磷酸化EGFR購自CellSignalingTechnology,兔抗PI3K(SantaCruz,California),兔抗-ERK1/2(p44/42MAPK)和兔抗-phospho-ERK1/2(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA)。Matrigel(B&DBiosciences,德國),PVDF膜(Dassel,德國),蛋白裂解液(500mmol/LTris.Hcl-pH8.0、150mmol/L氯化鈉、0.02%疊氮鈉、0.1%SDS、100μg/mlPMSF、1μg/ml抑肽酶、1%NP40、0.5%去氧膽酸鈉),WesternBlot設(shè)備(Biorad),WesternBlot顯色液(PierceBiotechnology),密度掃描分析(GeneTools分析軟件),流式細(xì)胞儀(Becton-Dickinson);其余試劑為國產(chǎn)分析純試劑。二、實驗方法1.培養(yǎng)和代代相傳293細(xì)胞按本實驗室方法培養(yǎng)和傳代,牛主動脈內(nèi)皮細(xì)胞按本實驗室建立的方法進(jìn)行培養(yǎng)和傳代,實驗采用第2~5代細(xì)胞。2.raav病毒載體的純化及鑒定采用腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的表氧化酶轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞,將表氧化酶cDNAs克隆至rAAV載體pXXUF1的巨細(xì)胞病毒啟動子下游,按本實驗室方法將rAAV-F87V、rAAV-2C11OR、rAAV-2J2、rAAV-GFP以鈣磷轉(zhuǎn)染法在293細(xì)胞中包裝純化,斑點雜交法測定病毒滴度。3.baec細(xì)胞的免疫印跡檢測EET刺激:使用EET(5×10-5mol/L)、表氧化酶抑制劑17-ODYA(1×10-4mol/L)和(或)eNOS抑制劑L-NMMA(1×10-4mol/L)刺激BAEC細(xì)胞15min后,提取蛋白行免疫印跡檢測磷酸化ERK、PI3K和磷酸化EGFR的蛋白表達(dá)水平。病毒轉(zhuǎn)染:使用rAAV-F87V、rAAV-2C11OR、rAAV-2J2和rAAV-GFP(50病毒顆粒/細(xì)胞)轉(zhuǎn)染BAEC細(xì)胞5天后細(xì)胞傳代,細(xì)胞再培養(yǎng)48h后行免疫印跡檢測表氧化酶的蛋白表達(dá)。免疫印跡:細(xì)胞處理后吸出培養(yǎng)基,用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(phosphate-bufferedsaline,PBS)洗滌后加入三去污劑細(xì)胞裂解液,冰浴20min后用刮下細(xì)胞轉(zhuǎn)至微量離心管,12000r/min×3min×4℃離心,轉(zhuǎn)移上清液至新離心管。Bradford方法測定蛋白質(zhì)濃度,等量蛋白質(zhì)(10μg/孔)加入6×加樣緩沖液,煮沸3min后上樣,SDS聚丙烯酰胺凝膠(分離膠8%,積層膠4.5%)垂直電泳分離,電轉(zhuǎn)至PVDF膜上(4℃轉(zhuǎn)膜過夜),室溫下含5%脫脂奶粉的TBS-T(10mmol/LTris·Cl+100mmol/LNaCl+0.1%Tween20)封閉2h,加入一抗(1∶500稀釋)4℃作用過夜,第2天TBS-T于室溫下洗膜4次,每次15min,加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(1∶8000稀釋),室溫下輕搖2h,TBS-T室溫下同法洗膜4次,增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑顯色曝光。4.甲基亞分光光度a經(jīng)藥物處理的細(xì)胞,按培養(yǎng)基體積的1/10加入MTT儲存液(濃度為5g/L,PBS配制),繼續(xù)培養(yǎng)4h后,吸棄培養(yǎng)液,加入二甲基亞砜(96孔板加入100μl,24孔板加入300μl)置室溫30min,補(bǔ)加900μl二甲基亞砜并混勻后在分光光度儀上測定570nm處A值(OD值)。5.mtt檢測細(xì)胞增殖外源性EET刺激取對數(shù)生長期細(xì)胞,用含100ml/L胎牛血清(胎牛血清)的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107/L,以每孔0.2ml分別加入96孔的Nunc培養(yǎng)板內(nèi),置37℃、50ml/LCO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12h,換0.5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)12h,在氬氣條件下分別加入不同種類及濃度的EET,血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF,10-3μg/L)為陽性對照,每劑量組設(shè)3復(fù)孔,為防止EET氧化,12h后換用新的培養(yǎng)基和同樣濃度的EET,24h后行MTT檢測細(xì)胞增殖。表氧化酶病毒感染:BAEC置75cm2培養(yǎng)瓶生長至80%匯合后,細(xì)胞計數(shù)后按1∶4傳入6孔板,分別加入病毒(500p.f.u/個細(xì)胞),同時設(shè)空白對照和熒光蛋白病毒對照,每組重復(fù)3次,5天后以0.05%的胰酶(含0.02%的EDTA)完全消化細(xì)胞,1000g×3min×4℃離心收集細(xì)胞沉淀,等體積10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,細(xì)胞計數(shù)后按1∶4傳代,約6h細(xì)胞貼壁后換用含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,48h后行MTT檢測細(xì)胞增殖差異。6.流式細(xì)胞術(shù)檢測外源性EET干預(yù):BAEC置75cm2培養(yǎng)瓶生長至80%匯合后,細(xì)胞計數(shù)后按1∶3傳代至6孔板培養(yǎng)12h,換0.5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)12h,換用無血清的DMEM培養(yǎng)基,分別加入不同種類和不同濃度的EET孵育12h,行流式細(xì)胞儀檢測,每組重復(fù)3次。表氧化酶病毒感染:按上文表氧化酶病毒感染中的方法加入病毒并培養(yǎng)5天后傳代,約6h細(xì)胞貼壁后換用含0.5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,再12h后行流式細(xì)胞儀檢測。流式細(xì)胞儀檢測:細(xì)胞用胰酶消化,1000g×3min×4℃離心收集細(xì)胞沉淀,PBS洗一次,1000g×20s離心,取細(xì)胞沉淀加入75%酒精固定30min,1000g×3min×4℃離心收集細(xì)胞,PBS洗一次,加入10μlRNA酶(10mg/L)置37℃消化30min,離心收集細(xì)胞,加入0.5ml碘化吡啶(0.1g/L),調(diào)整細(xì)胞密度為1×109/L,4℃避光染色30min,上樣行流式細(xì)胞儀檢測(激發(fā)光波長488nm)。7.移行細(xì)胞數(shù)的檢測利用改良的Boyden趨化小室進(jìn)行細(xì)胞遷移趨化實驗,使用8μm微孔多聚碳酸酯濾膜。BAEC細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)液洗滌后調(diào)整為1×108/L,在趨化小室的下層加入200μl不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基及EET(1×10-7mol/L)作為趨化因子,然后蓋上多聚碳酸酯濾膜,在趨化小室的上層加入細(xì)胞懸液800μl,在5%CO2和37℃條件下培養(yǎng)24h后拆卸裝置,收取濾膜。擦凈濾膜上層面的細(xì)胞,濾膜及下層細(xì)胞用甲醇固定,蘇木素染色,200倍顯微鏡下照相,每張膜隨機(jī)選擇10個視野計算每高倍鏡視野(HPF)中的移行細(xì)胞數(shù)。為5×108/L,每孔加入100μl細(xì)胞懸液,繼續(xù)培養(yǎng)36h,并在顯微鏡下照相,選取6個視野,使用ScionImage軟件計算類微血管結(jié)構(gòu)的區(qū)域面積。8.小鼠血清中微血管的檢測將Matrigel置冰浴中6h融解,以預(yù)冷的滅菌槍頭取250μl鋪24孔板,置冰浴6h使液面平整并消除氣泡,置37℃30min使膠凝固。外源性EET:取BVEC細(xì)胞,0.05%的胰酶消化后用1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞為5×108/ml,每孔加入100μl細(xì)胞懸液,并分別加入對照溶媒和不同種類的EET,繼續(xù)培養(yǎng)36h,在顯微鏡下照相,選取6個視野,使用ScionImage軟件計算類微血管結(jié)構(gòu)的區(qū)域面積。病毒感染:表氧化酶病毒感染5天后的牛主動脈內(nèi)皮細(xì)胞用0.05%的胰酶(含0.02%的EDTA)消化,含0.5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞為5×108/L,每孔加入100μl細(xì)胞懸液,繼續(xù)培養(yǎng)36h,并在顯微鏡下照相,選取6個視野,使用ScionImage軟件計算類微血管結(jié)構(gòu)的區(qū)域面積。9.計數(shù)三種血管分離培養(yǎng)取第6天雞胚,消毒大頭端,滅菌砂輪鉆孔(1.5cm2×1.5cm2),去除殼膜,暴露尿囊腔,同時取大小一致的消毒濾膜(2mm2×2mm2),分別給予5μl等濃度的病毒(含5×109個病毒顆粒)并植入尿囊腔,消毒透明膠封口,每組6個,置37℃相對濕度為70%環(huán)境培養(yǎng),每8h轉(zhuǎn)動雞胚1次以防胚膜粘連,培養(yǎng)至第15天,去除透明膠,以濾膜附著點為中心直徑5cm范圍剪下尿囊腔,10%甲醇漂洗固定并照相,以濾膜為中心選取等面積計數(shù)分支血管。10.細(xì)胞增殖及類微血管結(jié)構(gòu)形成抑制劑為研究EET促進(jìn)細(xì)胞增殖、細(xì)胞移行、細(xì)胞趨化、類微血管結(jié)構(gòu)生成的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,在給予細(xì)胞EET刺激時或表氧化酶病毒感染的同時給予MAPK抑制劑(apigenin,25μmol/L),或PKC抑制劑(H7,12μmol/L),或PI3K抑制劑(LY294002,15μmol/L),MEK抑制劑(PD98059,20μmol/L),其后按上述方法檢測細(xì)胞增殖、細(xì)胞移行、細(xì)胞趨化、類微血管結(jié)構(gòu)生成。另外為研究EET對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的影響,我們在給予EET刺激1h后,按上法提取蛋白行免疫印跡直接檢測磷酸化ERK、PI3K和磷酸化EGFR的蛋白表達(dá)水平。11.免疫組化檢測血管生成情況30只雄性正常血壓Wistar大鼠隨機(jī)分為5組,戊巴比妥(50mg/kg)腹腔麻醉后,消毒鋪巾,使用3-0絲線結(jié)扎右側(cè)股動脈,從髂動脈分支游離至腘動脈處,術(shù)后1周檢查下肢切口愈合情況良好,分別給予rAAV-2J2、rAAV-F87V、rAAV-2C11OR和rAAV-GFP溶于200μl無菌生理鹽水,在內(nèi)收肌附近多點注射(含大約3×1011virons),注射表氧化酶病毒后6周麻醉處死動物,取后肢骨骼肌,4%多聚甲醛固定,取肌纖維橫面方向向上石蠟包埋,使用抗CD-31(plateletendothelialcelladhesionmolecule)行免疫組織化學(xué)染色,顯微鏡下(×400倍)ACT-1軟件隨機(jī)選擇20個視野計數(shù),計算毛細(xì)血管數(shù)目(mm2)、肌纖維數(shù)目(mm2)、毛細(xì)血管與肌纖維之比(肌纖維數(shù)目用以矯正可能的肌肉脫水和變形改變),評價血管生成情況。三、統(tǒng)計處理各參數(shù)之間的差異顯著性應(yīng)用統(tǒng)計軟件SPSS11.0進(jìn)行TwoWay-ANOVA檢驗,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。結(jié)果1.表氧化酶抑制劑的作用分別以不同種類和不同濃度的EET(8,9-,11,12-和14,15-EET)、一氧化氮合酶抑制劑L-NMMA和(或)表氧化酶抑制劑17-ODYA作用于BAEC細(xì)胞24h后行MTT檢測,與對照組和溶媒組(乙醇)相比,三種EET(50nmol/L)均能顯著促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,加用表氧化酶抑制劑17-ODYA可以顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,而L-NMMA(100μmol/L)可部分逆轉(zhuǎn)該作用(圖1A)(P<0.01),更高濃度的L-NMMA作用結(jié)果類似,另外給予不同劑量的EET刺激顯示它們的作用呈現(xiàn)劑量依賴性,其中14,15-EET作用相對較強(qiáng)而8,9-EET相對較弱(圖1B),細(xì)胞計數(shù)也顯示相似的結(jié)果。rAAV介導(dǎo)的三種表氧化酶轉(zhuǎn)染BAEC7~8天后行免疫印跡,顯示轉(zhuǎn)染表氧化酶后相應(yīng)的CYP102F87V,CYP2C11和CYP2J2均有效表達(dá)(圖1C),MTT檢測證實表氧化酶的過度表達(dá)能顯著促進(jìn)BAEC的增殖(P<0.01)(圖1D)。2.中性細(xì)胞間增殖cyp-mas,ra教學(xué)-et的表達(dá)rAAV-2J2、rAAV-2C11、rAAV-F87V和rAAV-GFP分別轉(zhuǎn)染一周或EET刺激12h后,收獲細(xì)胞行流式細(xì)胞儀檢測。結(jié)果顯示,rAAV-2J2、rAAV-2C11和rAAV-F87V顯著升高S+G2/M期的細(xì)胞比例,分別為(45.7±2.7)%,(49.1±3.4)%和(46.4±3.4)%,而對照組和GFP組分別為(26.8±2.5)%和(25.4±2.1)%(P<0.01)(圖2A),EET刺激也顯示類似的結(jié)果,14,15-EET的作用較其他兩種略強(qiáng)(圖2B),說明CYP表氧化酶可促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入分裂期而促進(jìn)牛主動脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖。3.t刺激對內(nèi)皮細(xì)胞趨化的影響我們使用改進(jìn)的Boyden趨化小室研究EET刺激對內(nèi)皮細(xì)胞趨化的影響。結(jié)果顯示,EET顯著促進(jìn)BAEC的趨化(P<0.05)(圖3A),并且呈現(xiàn)劑量依賴性(圖3B)。4.圖2不同的EET刺激24h后均能顯著促進(jìn)類微血管結(jié)構(gòu)的形成(P<0.05)(圖4A);表氧化酶基因病毒過度表達(dá)均能顯著促進(jìn)類微血管結(jié)構(gòu)的形成,而單獨加入表氧化酶抑制劑17-ODYA可抑制類微血管結(jié)構(gòu)的形成(P<0.05)(圖4B),進(jìn)一步證實CYP表氧化酶具有促進(jìn)血管形成的作用。5.對血管內(nèi)皮功能的影響ERK抑制劑apigenin、MEK抑制劑PD89059、PI3K抑制劑LY294002顯著抑制了EET對內(nèi)皮細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用(P<0.01),而PKC抑制劑H7無明顯作用(圖5A、5B);信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑在EET促進(jìn)趨化、移行和類微血管結(jié)構(gòu)生成的實驗中也表現(xiàn)出類似的效應(yīng)。為進(jìn)一步證實本研究的發(fā)現(xiàn),在給予EET刺激后行免疫印跡分別檢測EET對PI3K、磷酸化ERK影響,結(jié)果顯示EET可顯著上調(diào)PI3K、磷酸化ERK的蛋白表達(dá)(圖5C、5D),另外還發(fā)現(xiàn)可顯著上調(diào)磷酸化EGFR的蛋白表達(dá)(圖5E)。由于既往我們證明EET可以顯著上調(diào)eNOS的表達(dá)并促進(jìn)NO的生成,為了進(jìn)一步研究在內(nèi)皮細(xì)胞中NO對EET信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響,我們給予EET刺激內(nèi)皮細(xì)胞時,先給予eNOS抑制劑L-NMMA阻斷NO的合成,行免疫印跡分別觀察它們對磷酸化ERK和PI3K蛋白表達(dá)的影響,結(jié)果顯示加用eNOS抑制劑L-NMMA則可以顯著逆轉(zhuǎn)EET對內(nèi)皮細(xì)胞PI3激酶蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用,而不能逆轉(zhuǎn)EET對內(nèi)皮細(xì)胞磷酸化ERK蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用(圖5F、5G)。6.raav-gfp對raac溶血性早發(fā)大鼠血管內(nèi)皮數(shù)目的影響在雞胚尿囊絨毛膜上給予腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的表氧化酶(CYPF87V、CYP2C11OR和CYP2J2)轉(zhuǎn)染15天后,分別計數(shù)一級和二級毛細(xì)血管數(shù)目,一級毛細(xì)血管數(shù)目在對照組為4.6±0.6,rAAV-GFP組為4.3±0.6,而在rAAV-F87V、rAAV-2C11OR和rAAV-2J2分別為13.1±0.9、8.9±0.7和7.0±0.5。二級毛細(xì)血管數(shù)目的計數(shù)結(jié)果在對照組為5.1±0.7,rAAV-GFP組為6.3±0.8,而在rAAV-F87V、rAAV-2C11OR和rAAV-2J2分別為13.9±1.4、11.1±1.2和10.3±0.9。7.表氧化酶轉(zhuǎn)染組血清細(xì)胞系數(shù)動數(shù)大鼠缺血后肢給予表氧化酶轉(zhuǎn)染6周后,取材轉(zhuǎn)染局部的骨骼肌并使用CD-31行免疫組化染色,顯微照相后使用ACT-1軟件計數(shù)毛細(xì)血管數(shù),結(jié)果顯示與對照組相比,表氧化酶轉(zhuǎn)染組毛細(xì)血管密度顯著增加了30%~70%,其中在rAAV-CYP102F87V、rAAV-CYP2C11-CYPOR和rAAV-CYP2J2分別為(1260±62)/mm2、(1096±53)/mm2和(905±43)/mm2,而使用rAAV-GFP轉(zhuǎn)染組僅為(706±24)/mm2(P<0.01)。eet促進(jìn)血管生成的作用內(nèi)皮細(xì)胞在心血管系統(tǒng)的短期和長期調(diào)節(jié)中均起著重要的作用,近年來作為內(nèi)皮細(xì)胞花生四烯酸的第三條代謝通路,EET或表氧化酶對內(nèi)皮細(xì)胞影響的研究日益受到重視,但到目前為止它們對內(nèi)皮細(xì)胞和血管生成的影響尚缺乏較詳細(xì)和深入的研究。血管生成是一個復(fù)雜的病理生理過程,為此我們分別從細(xì)胞增殖、細(xì)胞趨化、細(xì)胞遷移、細(xì)胞周期、類微血管結(jié)構(gòu)形成和體內(nèi)的毛細(xì)血管生成6個方面較為詳盡的研究了EET對內(nèi)皮細(xì)胞和血管生成的影響。在本項研究中,首先使用重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的表氧化酶轉(zhuǎn)染BAEC細(xì)胞1周后,免疫印跡檢測顯示與對照組相比,表氧化酶轉(zhuǎn)染組有高效表達(dá),可被用以從細(xì)胞內(nèi)干預(yù)探討EET對血管生成的影響。為研究CYP表氧化酶代謝產(chǎn)物對血管生成的影響,在BAEC中直接給予外源性EET刺激后行MTT檢測。結(jié)果顯示,各種EET均顯著促進(jìn)BAEC的細(xì)胞增殖,并且呈劑量依賴效應(yīng);3種表氧化酶病毒轉(zhuǎn)染BAEC后行MTT檢測,結(jié)果也證實了均可以顯著促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖;在給予EET刺激或CYP表氧化酶轉(zhuǎn)染BAEC后,行流式細(xì)胞儀檢測顯示與對照組細(xì)胞相比,EET刺激后S+G2/M期的細(xì)胞比例顯著增加,同樣表氧化酶病毒轉(zhuǎn)染BAEC后流式細(xì)胞儀檢測也獲得類似的結(jié)果,提示EET刺激或轉(zhuǎn)染CYP表氧化酶可以促進(jìn)BAEC進(jìn)入分裂期而促進(jìn)增殖。血管內(nèi)皮細(xì)胞向受損的組織趨化、遷移是血管修補(bǔ)或新生血管的起始環(huán)節(jié),為此,Boyden小室趨化實驗和劃痕修復(fù)實驗被用以檢測EET對BAEC趨化和遷移的影響,從而評價其促進(jìn)血管生成的能力。研究結(jié)果顯示各種EET均能呈劑量依賴性促進(jìn)Boyden小室中內(nèi)皮細(xì)胞的趨化,同樣3種EET也顯著促進(jìn)BAEC的劃痕修復(fù)并呈劑量依賴性,而3種表氧化酶病毒轉(zhuǎn)染后都顯著促進(jìn)BAEC的劃痕修復(fù),進(jìn)一步說明EET不但可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的移行,而且能定向趨化內(nèi)皮細(xì)胞向受損組織遷移,促進(jìn)血管的生成。內(nèi)皮細(xì)胞的管腔化是血管形成的至關(guān)重要的環(huán)節(jié),對內(nèi)皮細(xì)胞形成管腔化能力的評估包括體外和在體兩個方面。BAEC種于Matrigel上并加入EET,觀察它們對類微血管結(jié)構(gòu)形成的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同的EET刺激24h后均能顯著促進(jìn)類微血管結(jié)構(gòu)的形成;表氧化酶基因病毒轉(zhuǎn)染5天后BAEC細(xì)胞種在Matrigel上結(jié)果均能顯著促進(jìn)類微血管結(jié)構(gòu)的形成,這些實驗從體外證實了EET可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的管腔化。利用CAM進(jìn)行的在體研究顯示,CYP表氧化酶過度表達(dá)明顯促進(jìn)毛細(xì)血管的形成,在基因轉(zhuǎn)染組毛細(xì)血管分支的數(shù)目是對照組的2~3倍。上述結(jié)果都是基于一定生理條件的研究,在體內(nèi)病理狀態(tài)下的研究結(jié)果顯示,大鼠缺血后肢給予表氧化酶轉(zhuǎn)染6周后,與對照組相比表氧化酶轉(zhuǎn)染組毛細(xì)血管密度顯著增加,其增加幅度達(dá)到30%~70%,進(jìn)一步證實表氧化酶代謝產(chǎn)物EET可以顯著促進(jìn)血管的生成。在EET促進(jìn)血管生成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究中,在細(xì)胞增殖、細(xì)胞趨化、劃痕修復(fù)以及類微血管樣結(jié)構(gòu)形成中MAPK和PI3K均顯著介導(dǎo)了EET的促進(jìn)效應(yīng);同時蛋白水平的研究也證實了EET直接刺激或轉(zhuǎn)染三種表氧化酶基因均可以顯著上調(diào)MAPK和PI3K的蛋白表達(dá)。既往研究顯示,在牛主動脈內(nèi)皮細(xì)胞CYP表氧化酶的過度表達(dá)可以在mRNA和蛋白水平上調(diào)eNOS的表達(dá),并促進(jìn)eNOS的1179位絲氨酸的磷酸化。眾所周知NO具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)形成的作用,并證實NO介導(dǎo)了血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子促進(jìn)血管生成的作用,Kawasaki等研究進(jìn)一步證明NO的促血管生成作用是由PI3K/AKT途徑介導(dǎo)的?；谏鲜鲅芯堪l(fā)現(xiàn),為進(jìn)一步研究NO是否也介導(dǎo)了EET促進(jìn)血管生成的效應(yīng),在上述實驗中EET刺激的同時給予eNOS抑制劑L-NMMA,結(jié)果顯示eNOS抑制劑僅能部分逆轉(zhuǎn)EET對細(xì)胞增殖、劃痕修復(fù)、細(xì)胞趨化和類微血管結(jié)構(gòu)的形成。另外在蛋白水平的研究也顯示eNOS抑制劑可以顯著逆轉(zhuǎn)EET對PI3激酶表達(dá)的影響,提示NO參與了EET對PI3K的激活,這些結(jié)果與Kawasaki等關(guān)于NO的促血管生成作用是由PI3K/AKT途徑介