自然發(fā)酵泡菜中共軛亞油酸高產(chǎn)菌株的篩選及培養(yǎng)基優(yōu)化

自然發(fā)酵泡菜中共軛亞油酸高產(chǎn)菌株的篩選及培養(yǎng)基優(yōu)化

隨著生活水平的提高，人們越來越關(guān)注自己的健康，食品的安全和營養(yǎng)越來越受到重視。共軛亞油酸(CLA)作為一種重要的營養(yǎng)物質(zhì),在人體和動物健康方面的作用正日益受到關(guān)注,并逐漸成為生物保健和疾病治療研究的新熱點(diǎn)和新領(lǐng)域,被世界公譽(yù)為“21世紀(jì)的新型營養(yǎng)素”。目前,世界上僅有少數(shù)國家生產(chǎn)出以CLA為原料的保健食品。美國的SmartbodyNutrition、JarrowFormulas和ASTSportScience等公司已推出CLA軟膠囊丸保健品,日本則推出了以CLA為主要活性成分的高效減肥保健品,這些產(chǎn)品在歐美及日本市場非常暢銷。目前工業(yè)上主要是采用化學(xué)合成法生產(chǎn)CLA,如堿法異構(gòu)化,使亞油酸(LA)發(fā)生異構(gòu)化而生成CLA。但化學(xué)合成法存在較多缺點(diǎn),如CLA產(chǎn)物中異構(gòu)體繁多、有毒成分殘留、分離純化工藝復(fù)雜、生產(chǎn)成本高等。許多微生物能夠利用自身的酶將LA轉(zhuǎn)化成CLA。與化學(xué)合成法相比,利用微生物合成CLA的特異性強(qiáng),條件溫和,產(chǎn)物中活性CLA異構(gòu)體含量高,對人體無毒副作用。因此利用微生物生產(chǎn)CLA已成為主要的研究方向。乳酸菌兼性厭氧,培養(yǎng)條件易于控制,無毒安全。迄今,人們發(fā)現(xiàn)多種乳酸菌菌種可以發(fā)酵生產(chǎn)CLA。Ogawa等研究發(fā)現(xiàn),嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)AKU1137在微好氧的環(huán)境下,可將LA轉(zhuǎn)化為CLA。Irmak等對嗜酸乳桿菌、羅伊氏乳酸桿菌(Lactobacillusreuteri)ATCC23272和ATCC55739進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)這3種菌都有將LA轉(zhuǎn)化為CLA的能力。自然發(fā)酵的泡菜汁中富含乳酸菌,筆者通過溴甲酚紫平板篩選產(chǎn)酸細(xì)菌,革蘭氏染色法初步鑒定,紫外吸收光譜法檢測發(fā)酵液中CLA含量等方法,從3種自然發(fā)酵的泡菜中篩選出一株共軛亞油酸高產(chǎn)菌株QL2,并對其培養(yǎng)基組成成分及底物亞油酸添加量進(jìn)行了優(yōu)化。1材料和方法1.1試驗(yàn)材料1.1.1原料：本地泡菜、海里泡菜和泡菜1.1.2化學(xué)試劑及儀器共軛亞油酸標(biāo)準(zhǔn)品,(純度≥96%,Sigma公司);亞油酸(分析純,上海制劑一廠);吐溫-80(化學(xué)純,上海青析化工有限公司);溴甲酚紫(分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);正己烷(分析純,天津市大茂化學(xué)試劑廠)。1.1.3主要儀器。SK-1快速混勻器(常州國華電器有限公司);150A型生化培養(yǎng)箱(富華電器有限公司);YXO-GOI-280型蒸汽滅菌鍋(上海醫(yī)療器械廠);FA1004型電子天平(上海天秤儀器廠);BCD-238低溫冰箱(博西華家用電器有限公司);UV751GD紫外/可見分光光度計(jì)(上海分析儀器廠);VD-650桌上式垂直送風(fēng)潔凈工作臺(蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司)。1.1.4培養(yǎng)基分離純化培養(yǎng)基:溴甲酚紫平板培養(yǎng)基;斜面保藏培養(yǎng)基:MRS固體培養(yǎng)基;初始發(fā)酵培養(yǎng)基:MRS液體培養(yǎng)基。1.2測試方法1.2.1正己烷-正己烷分光光度法檢測cla標(biāo)準(zhǔn)溶液吸收值取2.5mgCLA標(biāo)準(zhǔn)品以正己烷為溶劑定容于25ml容量瓶中,分別吸取0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80ml裝入容量瓶,定容至10ml。將CLA標(biāo)樣配成不同濃度的溶液,以正己烷為參比,在波長233nm處測定其吸收值。以CLA濃度(μg/ml)為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),繪制CLA紫外吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.2.2干燥器的培養(yǎng)采用燭缸法。即將已接好種的平皿或者試管放入密閉干燥器內(nèi),干燥器中放置點(diǎn)燃的蠟燭,立即蓋上器皿蓋,待蠟燭熄滅后,將干燥器置于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1.2.3制備“x”汁和“快速”勻液的制備按吐溫-80∶LA為5∶3的比例混合,加入10ml蒸餾水,然后用快速混勻器混勻。LA乳化液采用膜孔徑為0.22μm的微孔過濾器過濾除菌,然后按一定比例加至已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中。1.2.4菌落的分離純化在無菌條件下,取3種自制泡菜樣品的發(fā)酵汁在溴甲酚紫平板上劃線,37℃恒溫培養(yǎng)48h,對其中產(chǎn)生黃色圈的菌落進(jìn)行反復(fù)分離、純化至純菌落。將各菌株編號,并將其接種于MRS固體斜面培養(yǎng)基上,培養(yǎng)48h后,置于4℃冰箱中保存,備用。1.2.5發(fā)酵液中cla的分離純化將初篩菌株分別接種于裝有MRS液體培養(yǎng)基的三角燒瓶中,37℃活化2代。在裝有MRS液體培養(yǎng)基試管(4.5ml/管)中加入500μlLA乳化液并搖勻,使發(fā)酵培養(yǎng)液中亞油酸濃度為0.06%(V/V)。將已活化的初篩菌株接入含亞油酸初始發(fā)酵培養(yǎng)液中,接種量為2.00%(V/V)。37℃靜置,發(fā)酵24h。發(fā)酵結(jié)束后,試管中的發(fā)酵液(5ml)移入60ml分液漏斗中,每管發(fā)酵液加入20ml正己烷振蕩萃取。靜置分層后放棄下層水相液體,加入等量蒸餾水振蕩水洗,靜置后棄去下層水相液體,水洗2遍后,萃取液移至干凈小燒杯中,加入少量無水硫酸鈉脫去萃取液中的水分和水溶性物質(zhì),干燥至無乳化層。將脫去水分和水溶性物質(zhì)的正己烷萃取液移入25ml容量瓶中,加入正己烷定容,搖勻后待測。以未接入菌種,其他步驟和條件同上所得正己烷萃取液為對照組。將樣品置200~350nm波長范圍內(nèi)掃描,觀察波長233nm處有無特征吸收峰。在233nm波長處有特征吸收峰者,表明其發(fā)酵液中有CLA生成。讀取233nm處的吸光度,根據(jù)吸光度-CLA濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線所得CLA濃度、測定稀釋倍數(shù)、萃取時(shí)正己烷與培養(yǎng)液體積比,計(jì)算發(fā)酵液中CLA的生成量。根據(jù)培養(yǎng)發(fā)酵液中CLA的含量,篩選出產(chǎn)CLA水平最高的菌株。1.2.6優(yōu)化培養(yǎng)基組成的構(gòu)成1.2.6.菌株的培養(yǎng)和接種分別以濃度為2.00%(V/V)的D-果糖、D-半乳糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖和葡萄糖作為發(fā)酵培養(yǎng)基(4.5ml/管)的唯一碳源,底物L(fēng)A添加量為0.06%(V/V)。將活化2代后的菌株QL2接種到已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中,接種量為2.00%(V/V)。在37℃的培養(yǎng)箱里靜置發(fā)酵24h,檢測發(fā)酵液中CLA的產(chǎn)量,以得到最優(yōu)的碳源。1.2.6.培養(yǎng)基底物la添加量分別以濃度為3.00%(V/V)的蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、硫酸銨和檸檬酸氫二銨作為發(fā)酵培養(yǎng)基(4.5ml/管)的唯一氮源,底物L(fēng)A添加量為0.06%(V/V)。將活化2代后的菌株QL2接種到已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中,接種量為2.00%(V/V)。在37℃的培養(yǎng)箱里靜置發(fā)酵24h,檢測發(fā)酵液中CLA的產(chǎn)量,以得到最優(yōu)的氮源。1.2.6.無機(jī)鹽對cla表達(dá)的影響在亞油酸濃度和菌株QL2接種量不變,以及已優(yōu)化了碳、氮源的MRS(未加無機(jī)鹽)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,添加不同濃度的CH3COONa、K2HPO4和MgSO4,以發(fā)酵液中的CLA產(chǎn)量為檢測指標(biāo),研究這3類無機(jī)鹽對菌株QL2生成CLA的影響。選取正交表L9(34)安排正交試驗(yàn)方案,正交試驗(yàn)的因素和水平見表1。1.2.6.菌株的活化在優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基(4.5ml/管)中,分別添加0.04%、0.08%、0.12%、0.16%、0.20%、0.24%、0.28%、0.32%、0.36%、0.40%、0.44%、0.48%、0.52%、0.56%、0.60%(V/V)的LA。將活化2代后的菌株QL2接種到已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中,接種量為2.00%(V/V)。在37℃的培養(yǎng)箱里靜置發(fā)酵24h,檢測發(fā)酵液中CLA的產(chǎn)量,以得到最優(yōu)的底物L(fēng)A添加量。2結(jié)果與分析2.1標(biāo)準(zhǔn)cma紫外吸收曲線以CLA濃度(μg/ml)為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),繪制CLA紫外吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖1所示。2.2發(fā)酵液中cla和bl2的濃度檢測從3種自制泡菜汁樣品中分離出50株G+菌,經(jīng)初步發(fā)酵檢測后,有19株菌發(fā)酵液的萃取液在233nm處有最大吸收峰(圖2),其中菌株QL2的發(fā)酵液CLA產(chǎn)量最高,達(dá)23.263μg/ml。2.3唯一碳源類型分別以2.00%(V/V)D-果糖、D-半乳糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖和葡萄糖作為發(fā)酵培養(yǎng)基的唯一碳源,CLA產(chǎn)量依次為29.342、28.047、23.299、33.047、23.478、25.241μg/ml?？梢?菌株QL2可以利用D-果糖、D-半乳糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖和葡萄糖進(jìn)行生長代謝,并將LA轉(zhuǎn)化成CLA,當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基以乳糖為碳源時(shí),CLA產(chǎn)量最高。2.4氮源中cla的產(chǎn)量以2.00%(V/V)乳糖為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源,分別以3.00%(V/V)蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、硫酸銨和檸檬酸氫二銨作為發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源,CLA產(chǎn)量依次為31.824、33.622、24.270、24.054、33.371μg/ml?？梢?菌株QL2可以利用蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、硫酸銨和檸檬酸氫二銨進(jìn)行生長代謝,并將LA轉(zhuǎn)化為CLA,當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基以酵母膏為氮源時(shí),CLA產(chǎn)量最高。2.5發(fā)酵液中cla的發(fā)酵條件以2.00%乳糖為碳源、以3.00%酵母膏為氮源,按照正交表L9(34)分別添加不同濃度的CH3COONa、K2HPO4、MgSO4于未加無機(jī)鹽的發(fā)酵培養(yǎng)基中。由表2可知,影響發(fā)酵液中CLA產(chǎn)量的因素主次順序?yàn)锽>A>C,即K2HPO4>CH3COONa>MgSO4。在CH3COONa、K2HPO4、MgSO43種無機(jī)鹽中,K2HPO4對CLA產(chǎn)量影響最為顯著,3因素的最優(yōu)水平為A1B3C3。即:CH3COONa0.20%,MgSO4·7H2O0.08%,K2HPO4·3H2O0.30%。2.6底物la濃度對cla產(chǎn)量的影響在優(yōu)化碳、氮源和無機(jī)鹽后的發(fā)酵培養(yǎng)基中,LA添加量分別為0.04%、0.08%、0.12%、0.16%、0.20%、0.24%、0.28%、0.32%、0.36%、0.40%、0.44%、0.48%、0.52%、0.56%、0.60%(V/V)。由圖3可知,當(dāng)?shù)孜風(fēng)A濃度低于0.40%(V/V)時(shí),CLA產(chǎn)量隨LA濃度的增加而升高,但轉(zhuǎn)化率的提高并不明顯。當(dāng)?shù)孜風(fēng)A濃度為0.40%(V/V)時(shí),CLA產(chǎn)量最高,達(dá)到288.740μg/ml,轉(zhuǎn)化率高達(dá)7.21%。當(dāng)?shù)孜風(fēng)A濃度超過0.40%(V/V)時(shí),CLA產(chǎn)量隨LA濃度增加而下降,轉(zhuǎn)化率也隨之顯著下降?？赡苁沁^高濃度的LA對菌體的生長代謝有一定的毒性,從而降低了LA的轉(zhuǎn)化及CLA產(chǎn)物的形成。3發(fā)酵液中cla和培養(yǎng)基的組成(1)從3種自制泡菜汁樣品中分離出50株G+菌,經(jīng)過初步發(fā)酵試驗(yàn),其中19株菌發(fā)酵液的萃取液在233nm處有吸收值,它們產(chǎn)CLA的能力從3.982μg/ml到23.263μg/ml不等,其中菌株QL2的發(fā)酵液CLA產(chǎn)量最高,達(dá)23.263μg/ml。(2)對菌株QL2的培養(yǎng)基組成成分進(jìn)行優(yōu)化,得到發(fā)酵培養(yǎng)基的最優(yōu)碳源是乳糖,最優(yōu)氮源是酵母