放線菌scouzy0206的分離鑒定

放線菌scouzy0206的分離鑒定

在過(guò)去的幾十年里，陸生放線菌在發(fā)現(xiàn)藥物原材料方面發(fā)揮了絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。但近年來(lái),隨著研究的深入,化合物發(fā)現(xiàn)的重復(fù)率不斷增加,從陸生放線菌中尋找新化合物日趨困難,進(jìn)而,人們將探索的目光轉(zhuǎn)向尚待開(kāi)發(fā)的海洋。隨著勘探技術(shù)的不斷完善,人們對(duì)海洋資源的開(kāi)采有了突破性進(jìn)展,從海岸到淺海再到深海,發(fā)現(xiàn)了大量的海洋微生物資源。由于海洋微生物的生存環(huán)境迥異于陸生微生物,因此海洋微生物擁有獨(dú)特的遺傳背景和代謝能力,使得其具有生產(chǎn)新穎的化學(xué)結(jié)構(gòu)、多樣的生物活性的化合物的能力。目前從海洋微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了許多大環(huán)內(nèi)酯類、醌類、環(huán)肽類、生物堿類等新穎結(jié)構(gòu)天然產(chǎn)物,多具有抗菌、抗病毒、抗凝、抗炎和抗血小板粘附等藥理作用。因此,發(fā)掘海洋微生物次生代謝產(chǎn)物,可以為先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)提供新途徑,為藥物研發(fā)注入新的活力。本課題組致力于海洋放線菌天然產(chǎn)物及其生物合成的研究,近來(lái)陸續(xù)從南海海域中發(fā)現(xiàn)了許多放線菌資源,從其發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到了一系列的抗腫瘤及抗菌天然產(chǎn)物。例如從南海放線菌新屬、新種MarinactinosporathermotoleransSCSIO00652中發(fā)現(xiàn)了具有耐藥抗瘧原蟲(chóng)活性的β-咔啉生物堿及吲哚內(nèi)酰胺類生物堿;從南海放線菌StreptomyceslusitanusSCSIOLR32中分離得到了具有細(xì)胞毒活性的角環(huán)素類化合物和芳酰胺類化合物等。最近,通過(guò)抗菌及鹵蟲(chóng)致死等生物活性篩選,結(jié)合HPLC-DAD及LC-MS篩選,獲得了一批具有生產(chǎn)活性次生代謝產(chǎn)物的南海海洋放線菌菌株。其中ZY0206菌株經(jīng)16S分子生物學(xué)鑒定為Streptomycesgriseorubens,其發(fā)酵提取物顯示出良好的抗菌活性,能抑制枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的生長(zhǎng)。采用硅膠柱層析及半制備高效液相色譜,以濾紙片法抗菌活性檢測(cè)對(duì)該菌株的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行了活性跟蹤分離,獲得四個(gè)多酚蒽酮類衍生物,經(jīng)HR-ESI-MS、1H及13CNMR、HMBC等波譜技術(shù)分析鑒定為resistoflavine(1)、resistomycin(2)、1-hydroxy-1-norresistomycin(3)和tetracenomycinD(4)。本文報(bào)道該放線菌的16S分子生物學(xué)鑒定以及化合物1~4的分離和結(jié)構(gòu)鑒定。1材料和方法1.1色譜柱及代試劑AVANCEDRX500核磁共振儀(Bruker,500/125MHz,TMS為內(nèi)標(biāo));maXis高分辨質(zhì)譜儀及amaZonSL質(zhì)譜儀(Bruker);ProStar高效液相色譜儀(Varian,配PDA檢測(cè)器);YMC-PackODS-A半制備色譜柱(250×10mm,5μm);硅膠薄層層析板(煙臺(tái)江友,HSGF254);柱層析用硅膠(煙臺(tái)江友,100~200目);中壓制備層析系統(tǒng)EZPurifierIII(上海利穗化工科技有限公司);色譜純乙腈(安徽時(shí)聯(lián)公司);氘代試劑(CIL);其它化學(xué)試劑皆為國(guó)產(chǎn)分析純。放線菌StreptomycesgriseorubensSCSIOZY0206分離自采集于中國(guó)南海(E120°0.250′′,N20°22.971′′)3536m深海海底沉積物樣品,菌種保存于中國(guó)科學(xué)院海洋微生物研究中心。種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基均用M-AM2ab:豆粉0.5%,酵母粉0.5%,可溶性淀粉2%,細(xì)菌學(xué)蛋白胨0.2%,海鹽3%,碳酸鈣0.2%,pH7.2~7.4,121℃滅菌30min。1.2菌株的檢測(cè)與培養(yǎng)1.2.1海洋鏈霉菌SCSIOZY0206的分子生物學(xué)鑒定16SrRNA基因序列的PCR擴(kuò)增用細(xì)菌16SrRNA的通用引物,27Fprimer(5′-AGAGTTTGATC(AC)TGGCTCAG-3′)和1492Rprimer(5′-ACGG(CT)TACCTTGTTACGACTT-3′),進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(25μL):DNA模板0.5μL,10×PCRBuffer2.5μL,dNTP(各2.5mmol/L)2μL,27Fprimer(20μmol/L)0.5μL,1492Rprimer(20μmol/L)0.5μL,Tap酶(5U·μL)0.2μL,DMSO1.25μL,ddH2O17.55μL。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min,94℃變性1min;59℃退火1min,72℃延伸1.5min;30個(gè)循環(huán);72℃延伸10min;4℃保溫。擴(kuò)增產(chǎn)物的序列測(cè)定用凝膠回收試劑盒(OMEGA)純化PCR產(chǎn)物,再連接到pCR2.1載體(Invitrogen)中,16SrRNA基因序列由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測(cè)定。將測(cè)出的16SrRNA基因序列進(jìn)行BLAST分析(/)。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建通過(guò)CLUSTALX軟件進(jìn)行海洋鏈霉菌菌株SCSIOZY0206及鏈霉菌屬最相似菌株的16SrRNA基因序列的對(duì)比,使用軟件MEGA4構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。1.2.2菌株的發(fā)酵培養(yǎng)種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基均采用M-AM2ab培養(yǎng)基。種子液用250mL錐形瓶,每瓶加入50mL培養(yǎng)基,從平板上接入適量菌種,于28℃、200rpm的搖床上培養(yǎng)36h后分別轉(zhuǎn)接于2L錐形瓶,每瓶200mL培養(yǎng)基,于28℃、200rpm條件下培養(yǎng)7d。1.2.3抗菌活性檢測(cè)取5mg/mL的DMSO發(fā)酵提取物溶液5μL,加到濾紙片上,置于含枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis和大腸桿菌Escherichiacoli的LB檢測(cè)平板,37℃培養(yǎng)24h,測(cè)量抑菌圈大小,判斷抑菌活性。1.2.4發(fā)酵產(chǎn)物的提取與分離發(fā)酵產(chǎn)物(6L)于4000rpm,離心10min,分離得到上清液和菌絲體部分,上清液經(jīng)丁酮萃取后減壓濃縮得到浸膏A;菌絲體部分先用丙酮浸提,浸取液回收丙酮后剩余的水混合液再用丁酮萃取,丁酮層減壓濃縮得到浸膏B,通過(guò)HPLC分析,浸膏A和B成分相似,因此合并得到總浸膏16g。采用正相硅膠柱層析,氯仿-甲醇梯度(100∶0,98∶2,96∶4,94∶6,92∶8,90∶10,8∶2,5∶5,V/V)洗脫共得到8個(gè)組份Fr.1~Fr.8。抑制枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的活性追蹤顯示Fr.2~Fr.6為活性組分,通過(guò)HPLC驗(yàn)證合并后得到組分Fr.2-3和Fr.4-6。對(duì)其中Fr.2-3進(jìn)行常壓正相柱層析,石油醚-乙酸乙酯梯度(7∶3,6∶4,5∶5,4∶6,3∶7,V/V)洗脫得到27個(gè)組份,進(jìn)一步對(duì)其中組份Fr.2-3-12~Fr.2-3-19進(jìn)行半制備HPLC(乙腈-水50%~95%線性洗脫25min,流速2.5mL/min)分離,分別在保留時(shí)間為9.8min和18.0min處得到化合物1和2;再對(duì)其中Fr.4-6進(jìn)行常壓正相柱層析,石油醚-乙酸乙酯梯度(7∶3,6∶4,5∶5,4∶6,3∶7,V/V)洗脫得到30個(gè)組份,Fr.B-1~Fr.B-30。通過(guò)TLC,HPLC驗(yàn)證后合并組份得到Fr.B-4~Fr.B21進(jìn)行常壓正相柱層析,氯仿-甲醇梯度(100∶0,99∶1,98∶2,97∶3,96∶4,95∶50,94∶6,V/V)洗脫得到12個(gè)組份,Fr.BB-1~Fr.BB-12。對(duì)其中的組份Fr.BB-5~Fr.BB-11進(jìn)行半制備HPLC(乙腈-水40%~90%線性洗脫23min,流速2.5mL/min)分離,分別在保留時(shí)間為15.7min和17.4min處得到化合物4和3。2結(jié)果與討論2.1srrna基因序列及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)16SrRNA基因序列分析表明SCSIOZY0206與菌株StreptomycesgriseorubensNBRC12780T(AB184139)的16SrRNA基因序列相似性為100%,故該菌株為Streptomycesgriseorubens,其系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖2。2.2化合物2結(jié)構(gòu)的篩選化合物1深黃色粉末,(-)HR-ESI-MS給出準(zhǔn)分子離子峰m/z391.0823[M-H]-,推測(cè)其分子式為C22H16O7(理論[M-H]-值391.0823),不飽和度為15,說(shuō)明分子中存在大的共軛體系。1HNMR在高場(chǎng)區(qū)有三個(gè)甲基單峰質(zhì)子信號(hào);低場(chǎng)區(qū)存在三個(gè)苯環(huán)質(zhì)子的單峰信號(hào)及一個(gè)活潑氫質(zhì)子的寬單峰信號(hào)。13CNMR揭示出三個(gè)酮羰基信號(hào),其中兩個(gè)為共軛酮羰基;14個(gè)芳香碳信號(hào),其中三個(gè)為連氧芳碳;另外還存在一個(gè)連氧脂肪碳,一個(gè)連羰基的脂肪碳以及三個(gè)甲基碳信號(hào)。通過(guò)對(duì)照文獻(xiàn),確定化合物1的結(jié)構(gòu)為resistoflavine。1HNMR(DMSO-d6,500MHz)δ7.30(1H,s,11-OH),7.03(1H,s,H-8),6.57(1H,s,H-4),6.51(1H,s,H-11),2.70(3H,s,H-14),1.64(3H,s,H-12),1.56(3H,s,H-13);13CNMR(DMSO-d6,125MHz)δ203.4(C-2),189.1(C-6),183.6(C-10),168.2(C-5,7),163.8(C-3),156.6(C-11a),149.9(C-9),149.3(C-11c),148.3(C-11d),127.6(C-11),121.0(C-8),120.5(C-9a),111.5(C-6a),108.5(C-5a),107.5(C-2a),104.2(C-4),61.8(C-11b),46.5(C-1),30.9(C-14),24.5(C-12),23.4(C-13)。化合物2深黃色粉末,(+)HR-ESI-MS給出準(zhǔn)分子離子m/z377.1038[M+H]+,推測(cè)其分子式為C22H16O6(理論[M+H]+值377.1020),較化合物1少一個(gè)氧原子。化合物2的1HNMR和1極為相似,僅少了一個(gè)活潑質(zhì)子信號(hào),同時(shí)11位質(zhì)子由δH6.51向低場(chǎng)位移至δH7.23?；衔?的13CNMR與1比較,少了一個(gè)共軛羰基和一個(gè)連氧脂肪碳信號(hào),多出兩個(gè)芳香碳信號(hào)。通過(guò)與文獻(xiàn)對(duì)照,確定化合物2的結(jié)構(gòu)為resistomycin。1HNMR(DMSO-d6,500MHz)δ14.62(1H,s,3-OH),14.41(1H,s,5-OH),14.17(1H,s,7-OH),7.23(1H,s,H-11),7.09(1H,s,H-8),6.38(1H,s,H-4),2.94(3H,s,H-14),1.58(6H,s,H-12,13);13CNMR(DMSO-d6,125MHz)δ204.9(C-2),184.5(C-6),170.4(C-3),169.9(C-5),168.1(C-7),163.0(C-10),152.6(C-11a),152.1(C-9),139.7(C-11c),128.5(C-11d),119.4(C-8),114.5(C-9a),110.2(C-11),107.0(C-11b),106.5(C-6a),106.0(C-5a),102.7(C-2a)100.3(C-4),46.1(C-1),28.6(C-14),25.7(C-12,13)?；衔?深黃色粉末,(-)ESI-MS給出m/z377.3[M-H]-,提示其分子量為378.3,推測(cè)其分子式為C21H14O7。化合物3的1HNMR和2相似,僅少了一個(gè)甲基的質(zhì)子信號(hào)。通過(guò)對(duì)比文獻(xiàn),確定化合物3的結(jié)構(gòu)為1-hydroxy-1-norresistomycin。1HNMR(CD3OD,500MHz)δ7.36(1H,s,H-11),6.99(1H,s,H-8),6.29(1H,s,H-4),2.99(3H,s,H-14),1.56(3H,s,H-13)?；衔?淺紅色粉末,(-)ESI-MS給出m/z335.3[M-H]-,結(jié)合氫譜及碳譜信息,推測(cè)其分子式為C19H12O6?；衔?的1HNMR給出一個(gè)芳環(huán)上的甲基質(zhì)子單峰信號(hào)δH2.8,兩組苯環(huán)間位質(zhì)子信號(hào),一個(gè)苯環(huán)質(zhì)子的單峰信號(hào),以及兩個(gè)活潑質(zhì)子信號(hào)δH12.2及14.6。13CNMR給出19個(gè)碳信號(hào),其中2個(gè)共軛羰基碳信號(hào),16個(gè)芳碳信號(hào),以及1個(gè)芳環(huán)取代甲基碳信號(hào)。查閱文獻(xiàn),確定化合物為tetracenomycinD。1HNMR(DMSO-d6,500MHz)δ14.64(1H,s,8-OH),12.23(1H,s,10-OH),7.91(1H,s,H-3),7.18(1H,d,J=2.0,H-4),7.13(1H,d,J=2.5,H-1),6.99(1H,d,J=2.0,H-6),6.57(1H,d,J=2.5,H-11),2.82(3H,s,7-CH3);13CNMR(DMSO-d6,125MHz)δ188.3(C-9),180.9(C-2),166.0(C-10),165.0(C-12),164.1(C-5),159.6(C-8),141.3(C-7),139.8(C-1a),135.7(C-3a),127.8(C-3),123.3(C-2a),121.4(C-6),119.4(C-7a),111.5(C-4),109.5(C-9a),108.0(C-1),107.9(C-11),106.4(C-8a),24.2(C-13)。2.3reaseimycink-ras生物合成途徑Resistoflavine(1