川烏與白芍配伍減毒作用機制研究

川烏與白芍配伍減毒作用機制研究

川烏和白芍具有鎮(zhèn)痛和抗炎作用。這兩種藥物是由冷和熱藥物引起的。歷代中醫(yī)常用于治療風濕性疾病，具有降壓、降毒作用。烏頭堿是川烏的主要化學成分之一,具有抗炎、鎮(zhèn)痛作用,但有較強的心臟毒性;白芍中主要化學成分芍藥苷,具有鎮(zhèn)痛、抗炎、解痙及較強的免疫調節(jié)等作用。本實驗以烏頭堿、芍藥苷為指標,用薄層掃描法、高效液相色譜法進行測定,通過比較川烏、白芍單煎及以不同比例配伍,樣本藥物中烏頭堿、芍藥苷煎出量的變化,考察兩藥配伍對有效成分煎出量的影響,從而為進一步研究川烏、白芍配伍后藥效的變化提供科學的依據。1型積分儀檢測CS-9301PC薄層掃描儀(日本島津);Beckman高效液相色譜儀(美國貝克曼公司,110B型泵,420型控制器,163可變波長紫外檢測器);HP3396SeriesⅡ型積分儀(美國惠普公司)。烏頭堿對照品(批號720-9805,供含量測定用,純度98.6%)、芍藥苷對照品(批號0736-9811,供含量測定用,純度99.1%)均由中國藥品生物制品檢定所提供;甲醇為色譜純,其余試劑為分析純;硅膠G(薄層色譜用,青島海洋化工廠)。川烏(RadixAconiti)、白芍(RadixPaeoniaeAlba)均購自濟南中藥飲片廠。經本校中藥鑒定教研室石俊英教授鑒定。2方法和結果2.1試驗溶液的制備2.1.1川烏單樹供試品溶液的制備川烏粉碎成最粗粉(10目),稱取50g,置圓底燒瓶中,加水浸泡30min,加熱回流兩次(1,0.5h),第一次加水6倍量,第二次加水4倍量,濾過,合并兩次提取液,定容至500mL,吸取50mL,以濃氨水調pH=9,用乙醚提取6次(40mL2次,30mL2次,20mL2次),合并乙醚提取液,回收乙醚,殘渣加二氯甲烷溶解,定容至5mL,得川烏單煎供試品溶液。2.1.2加樣回收、精制稱取川烏50g、白芍50g;川烏50g、白芍100g,分別按“2.1.1”項下方法提取、精制,得川烏、白芍1∶1,1∶2合煎供試品溶液Ⅰ,Ⅱ。2.1.3單漿供試品溶液制備稱取白芍25g,置圓底燒瓶中,加水浸泡30min,加熱回流兩次(1,0.5h),第一次加水6倍量,第二次加水4倍量,濾過,合并兩次提取液,定容至250mL,精密吸取5mL,加入硅藻土0.5g,拌勻,置真空干燥箱內60℃烘干,置錐形瓶中,精密加入50%乙醇50mL,稱定重量,超聲處理30min,稱定重量,加50%乙醇補足減失重量,濾過,取續(xù)濾液5mL,置10mL量瓶中,加50%乙醇至刻度,0.5μm的微孔濾膜濾過,作為白芍單煎供試品溶液。2.1.4加樣回收、精制稱取川烏25g,白芍25g;川烏25g,白芍50g,按“2.1.3”項下方法提取、精制,得川烏、白芍1∶1,1∶2合煎供試品溶液Ⅲ,Ⅳ。2.1.5陰性對照品溶液吸取缺川烏的白芍單煎液50mL,按“2.1.1”項下方法精制,制得川烏陰性對照品溶液。吸取缺白芍的川烏單煎液5mL,按“2.1.3”項下方法精制,制得白芍陰性對照品溶液。2.2測定了烏堿性含量2.2.1雙波長反射法硅膠G薄層板,正己烷-醋酸乙酯-乙醇(64∶36∶6)為展開劑,濃氨水飽和20min后展開,展距10cm,碘熏顯色,取同樣大小的玻璃板覆蓋,周邊用膠布固定密封。雙波長反射法鋸齒掃描,λS=420nm,λR=680nm,光束狹縫0.4mm×0.4mm,Sx=3。有關樣品分離的薄層色譜圖見圖1。2.2.2對照品溶液的制備精密稱取烏頭堿對照品10.2mg,置10mL量瓶中,加二氯甲烷制成每1mL含1.02mg的溶液,作為對照品溶液。精密吸取對照品溶液6,8,10,12,14,16μL,分別點于同一硅膠G薄層板上,按上述條件展開,顯色,掃描測定峰面積積分值,以對照品量(μg)為橫坐標,峰面積積分值為縱坐標,繪制標準曲線,得回歸方程Y=742.35x+1809.64,r=0.9995,線性范圍6.12～16.3μg。2.2.3供試品與陰性對照品、相同rf值的對照品試驗組將供試品溶液、陰性對照品溶液及對照品溶液各6μL點于同一硅膠G薄層板上,按上述條件展開,顯色,結果供試品有與烏頭堿對照品相同Rf值的斑點,而陰性對照品則無此斑點。2.2.4相同量斑點的測定吸取川烏單煎供試品溶液,在同一硅膠G薄層板上點6個相同量的斑點,按上述色譜條件掃描測定,結果RSD=0.76%;對其中1個斑點連續(xù)掃描6次,結果RSD=0.57%,表明精密度良好。2.2.5穩(wěn)定實驗吸取川烏單煎供試品溶液,依法點樣、展開、顯色,對烏頭堿斑點每30min掃描一次,結果在2h內穩(wěn)定,RSD=0.68%(n=5)。2.2.6加標回收率試驗采用加樣回收法,取已測知烏頭堿含量的川烏單煎水煎液樣品25mL,平行5份,分別精密加入烏頭堿對照品1.1mg,按“2.1.1”項下方法自“吸取樣品液,以濃氨水調pH=9”起制備,依法測定,計算5次測定平均回收率為98.4%,RSD=0.84%。2.2.7供試品溶液的薄層測定吸取對照品溶液8,10μL,川烏單煎供試品溶液、川烏、白芍合煎供試品溶液Ⅰ,Ⅱ各6μL,分別交叉點于同一硅膠G薄層板上,按上述薄層條件依法測定,結果見表1。2.3規(guī)定了芍藥酚的含量2.3.1動相、檢測波長色譜柱:KromasilC18(200mm×4.6mm,5μm);流動相:甲醇-水(28∶72);流速0.8mL·min-1;檢測波長:230nm,定量環(huán)進樣20μL。在此條件下,樣品中芍藥苷與其它相關峰均能達到基線分離,芍藥苷色譜峰的保留時間為16.6min,有關樣品分離的液相色譜圖見圖2。2.3.2標準曲線的繪制精密稱取芍藥苷對照品10.1mg,置10mL量瓶中,加乙醇制成每1mL含1.01mg的溶液,精密吸取各60,90,120,150,180μL置1mL量瓶中,加乙醇稀釋至刻度,搖勻,作為對照品溶液,各吸取20μL,注入液相色譜儀中,測定峰面積積分值,以進樣量(μg)為橫坐標,峰面積積分值為縱坐標,繪制標準曲線?；貧w方程為Y=199535.7x-125971.4,r=0.9999,線性范圍1.212～3.636μg。2.3.3精密度測試取白芍單煎供試品溶液,按上述色譜條件連續(xù)進樣5次,結果RSD=1.77%。2.3.4穩(wěn)定性試驗取白芍單煎供試品溶液分別間隔3h進樣,結果在15h內穩(wěn)定,RSD=1.75%(n=6)。2.3.5加樣回收率采用加樣回收法,取已測知芍藥苷含量的白芍單煎水煎液樣品2.5mL,平行5份,分別精密加入芍藥苷對照品4.86mg,按“2.1.3”項下方法制備,依法測定,計算5次測定平均回收率為100.1%,RSD=1.87%。2.3.6制備成分配峰面積積分值試驗取白芍單煎供試品液,川烏、白芍合煎供試品液Ⅲ,Ⅳ,吸取20μL,注入液相色譜儀中,按上述色譜條件測定峰面積積分值,計算芍藥苷含量。結果見表2。3川烏、白砂糖配伍使用可顯著降低在安全生產中的毒性川烏、白芍單煎及其配伍組方的藥物水煎液是按同一方法平行制得,因而對其烏頭堿、芍藥苷的煎出量進行平行比較,研究配伍組方對烏頭堿、芍藥苷煎出量變化的影響是科學可行的。烏頭堿具有鎮(zhèn)痛作用,但又是毒性成分,適量起到積極的治療作用,超過一定限量對心肌呈現明顯不良反應。實驗結果表明,川烏與白芍配伍使用可降低烏頭堿的煎出量,抑制川烏的毒性。兩藥配伍后芍藥苷煎出量的變化可初步看到,隨著白芍配伍比例的增加,烏頭堿的含量相對穩(wěn)定,而芍