高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定附子、附姜、四逆湯水提液中3種生物堿

高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定附子、附姜、四逆湯水提液中3種生物堿

中藥附子是毛科植物烏拉的加工產(chǎn)品。它是抗感染藥物，用于治療太陽(yáng)、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化火、幫助太陽(yáng)、驅(qū)風(fēng)、凈化和惡化疾病?，F(xiàn)代研究明確附子中的烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿等雙酯型生物堿,既是毒性成分同時(shí)也是主要的藥效成分,可謂藥效與毒性并存。附子經(jīng)炮制或水解可使其毒性成分降低,轉(zhuǎn)化成一系列毒性較小的成分。但目前附子的炮制尚無標(biāo)準(zhǔn),部分有效成分會(huì)隨加工過程流失,因此炮制程度直接關(guān)系到附子的減毒、存效。中藥配伍是減毒增效又一途徑,大量研究證明藥物之間相互為伍、協(xié)同合作,可能引起藥效、化學(xué)成分的變化,起到整體增效減毒作用。但目前對(duì)附子配伍研究中,僅就其毒性成分的溶出量變化進(jìn)行研究,還不能有力地解釋配伍機(jī)制的實(shí)質(zhì),甚至有些結(jié)論是相互矛盾的。附子、干姜配伍是歷代醫(yī)家廣為重用的藥對(duì),在《傷寒論》回陽(yáng)救逆之代表方劑四逆湯中就得以很好的體現(xiàn)。古人有“附子無姜不熱”、“干姜溫中散寒,以其大辛而散毒”之說?！侗静菥V目》中也有“生姜解半夏、膽南星、烏頭、附子及鳥獸肉毒”的記載。所以姜附相配是具減毒、增效雙重作用的經(jīng)典藥對(duì)。從化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)層面揭示姜附配伍增效減毒機(jī)制和規(guī)律意義重大。研究以高效液相色譜(HPLC)法同時(shí)檢測(cè)雙酯型生物堿,通過比較附姜配伍前后化學(xué)成分的變化規(guī)律,初步探討、解釋其作用機(jī)制,為臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。1藥物、藥品和適應(yīng)證島津LC-20AT高效液相色譜儀,島津SPD-2OA紫外檢測(cè)器,SIL-2OA自動(dòng)進(jìn)樣器;SartoriusBT125D分析天平(十萬分之一);飛鴿牌離心機(jī)AnKeTDL-40B;KQ-250B超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿對(duì)照品由中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)所提供(批號(hào)分別為0799-9403、110720-200410、0798-9403);生附子天津飲片廠提供;干姜、炙甘草由天津中醫(yī)藥大學(xué)?？滇t(yī)院提供,經(jīng)本校中藥鑒定教研室張麗娟教授鑒定。甲醇(色譜純);水為娃哈哈純凈水,其他試劑均為分析純。2方法和結(jié)果2.1流動(dòng)相、檢測(cè)波長(zhǎng)色譜柱:WaterssymmetryC18柱(4.6mm×150mm,5μm);流動(dòng)相:甲醇-0.1%三乙胺(60∶40);檢測(cè)波長(zhǎng):235nm;柱溫:35℃;流速:1.0mL/min;進(jìn)樣量:20μL。2.2溶液的制備2.2.1對(duì)照品溶液的制備精密稱取新烏頭堿13.47mg、烏頭堿5.64mg、次烏頭堿5.82mg,分別于10mL量瓶中用二氯甲烷溶解并稀釋至刻度,即得對(duì)照品溶液。2.2.2樣品溶液的制備精密稱取粉碎后的生附子5g,于250mL圓底燒瓶中,浸泡0.5h,分別用15倍、12倍水;45、30min煎煮2次,離心取上清液,合并,水浴濃縮至30mL,加3倍量95%乙醇攪勻,靜置12h濾過,蒸去乙醇,加入10mL稀鹽酸,超聲15min,至分液漏斗中,分別用30、15、10mL乙醚萃取3次棄去醚液,用濃氨水調(diào)pH至9~10,用30、15、10mL二氯甲烷萃取3次,合并萃取液,揮干,再用二氯甲烷溶解至10mL量瓶中稀釋至刻度,即得附子樣品溶液。2.2.3附姜比例的測(cè)定精密稱取粉碎后的生附子5g,干姜3g(按藥典四逆湯處方附姜比例取樣),置于250mL圓底燒瓶中,按照與2.2.2項(xiàng)下相同方法制備即得。2.2.4制備四逆湯方差時(shí)g精密稱取粉碎后的生附子5g,干姜3g,炙甘草5g(按藥典四逆湯處方比例取樣)置于250mL圓底燒瓶中,按照與2.2.2項(xiàng)下相同方法制備即得。2.2.5陰性樣品的制備按藥典四逆湯處方比例取缺附子的陰性樣品置于250mL圓底燒瓶中,按照與2.2.2項(xiàng)下相同方法制備即得。2.3稀釋液回收率的測(cè)定精密量取2.2.1項(xiàng)下的新烏頭堿對(duì)照品溶液2mL、烏頭堿對(duì)照品溶液1mL、次烏頭堿對(duì)照品溶液4mL于10mL量瓶中,用二氯甲烷稀釋至刻度混勻,將混合對(duì)照品溶液稀釋2,4,8,16倍,在上述色譜條件下,按稀釋液濃度由低至高順序進(jìn)樣,測(cè)定峰面積。以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,得回歸方程(見表1),結(jié)果表明在上述范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。2.4陰性對(duì)照液的制備按處方比例稱取除附子外其他藥味,按2.2.2項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照液。在上述色譜條件下檢測(cè),結(jié)果新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿出鋒處均無干擾,表明方法專屬性良好。見圖1。2.5峰面積的測(cè)定取2.3項(xiàng)下的最低濃度的混合對(duì)照品溶液,在以上色譜條件下,重復(fù)進(jìn)樣6次,測(cè)定峰面積,結(jié)果新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿峰面積的RSD值分別為0.6%、0.6%、0.5%。2.6新烏堿、頭皮堿、次麻黃堿峰取同一份附姜樣品溶液在1、3、6、12h測(cè)定峰面積,結(jié)果新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿峰面積值相對(duì)均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)值分別為1.2%、1.4%、1.1%。表明樣品溶液在12h穩(wěn)定性良好。2.8加對(duì)照品溶液精密稱取已知含量的附子2.5g,干姜1.5g,按2.2.2項(xiàng)下制備,向溶液中精確加入一定量的對(duì)照品溶液,測(cè)定峰面積計(jì)算回收率。新烏頭堿,烏頭堿,次烏頭堿的平均回收率分別為97.1%,98.0%,103.2%,RSD分別為1.6%,1.5%,2.0%(n=6)。2.9外標(biāo)法計(jì)算3種原則將按照附子,附姜,四逆湯制備方法制備的樣品溶液在上述色譜條件進(jìn)樣,外標(biāo)法計(jì)算3種生物堿含量及未知峰峰面積(n=3)結(jié)果見表2-3,見圖2-5。3逆湯中甘草配伍附姜君以養(yǎng)源節(jié)工作用本研究中采用生附子為樣品,是為了避免炮制品由于水解程度不同造成生物堿含量的差異,以便清晰地觀察配伍前后雙酯型烏頭堿及水解產(chǎn)物變化情況。自古臨床使用附子多采用“先煎”、以水煎煮的方式來降低毒性。故提示筆者結(jié)合臨床用藥習(xí)慣對(duì)其水提液進(jìn)行研究,以取得對(duì)臨床用藥有指導(dǎo)意義的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看到,煎煮過程中3種雙酯型烏頭堿中溶出量最高的是次烏頭堿,與文獻(xiàn)報(bào)道一致;姜附配伍水提液較附子中次烏頭堿及新烏頭堿的溶出量均有顯著的增加,其中姜附水提液中次烏頭堿增加了135.4%;四逆湯中3種雙酯型烏頭堿中溶出量較姜附水提液均降低。另外從圖3、4、5可觀察到X號(hào)峰的變化規(guī)律,凡有干姜配伍的水提液中面積均增加,在四逆湯中增加尤為顯著。初步得出附子配伍增效減毒雙重作用機(jī)制,附子中雙酯型生物堿既是毒性成分又是體現(xiàn)回陽(yáng)救逆功效的活性成分,與干姜配伍后雙酯型生物堿的溶出量大體均增加,體現(xiàn)了中醫(yī)“附子無姜不熱”的觀點(diǎn)。其中增加幅度最小的是原本含量最低的烏頭堿僅為9.7%,但在四逆湯中毒性最強(qiáng)的烏頭堿的溶出量較附子降低約71.0%。所以新烏頭堿、次烏頭堿含量雖有增加,但是它們的毒性比烏頭堿小很多,所以整體還是減毒增效。另外筆者關(guān)注的X峰變化規(guī)律,在有干姜配伍的水提液中較附子單煎液明顯增大,尤其在四逆湯中隨著烏頭堿溶出量的減少X峰顯著增大,而附子空白試液中未檢測(cè)到此峰。在目前的色譜條件下,本體系中能產(chǎn)生紫外吸收的僅有可能是含有苯甲?；鶠躅^類生物堿。就此結(jié)合參考文獻(xiàn)推斷,此峰極有可能來自于雙酯型生物堿的水解。大量研究表明烏頭類雙酯型生物堿毒性最大,而當(dāng)其水解掉一個(gè)酯鍵,變成單酯型生物堿時(shí),毒性降低:水解掉兩個(gè)酯鍵時(shí),它的毒性更小,但是這些水解產(chǎn)物卻仍具有藥理活性。由此推斷X號(hào)峰所對(duì)應(yīng)的化合物應(yīng)是使附子配伍增效的關(guān)鍵物質(zhì),有待進(jìn)一步研究。這一推斷體現(xiàn)“干姜以其大辛之性而解附子之毒”一說,與藥理藥效實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相吻合。這里特別值得提出的是:四逆湯中雙酯型生物堿溶出量較附姜配伍減小,X峰較附姜配伍增大,作為佐使藥的炙甘草功不可沒。有研究表明甘草中的黃酮類化合物與附子中烏頭類生物堿等毒性成分結(jié)合成不溶于水的物質(zhì),而使其配伍后烏頭類生物堿明顯降低,提示在四逆湯中甘草配伍附姜君臣兩藥減毒增效作