液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定青花菜中l(wèi)-硒甲基硒代半胱氨酸的含量

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定青花菜中l(wèi)-硒甲基硒代半胱氨酸的含量

1富硒青花菜中含硒化合物的檢測(cè)遼寧能有效地扮演其他養(yǎng)分的生物學(xué)功能。研究發(fā)現(xiàn),人體和動(dòng)物體內(nèi)硒的吸收、作用效果和毒性等與攝入硒的化學(xué)形態(tài)密切相關(guān)。L-硒甲基硒代半胱氨酸(SeMC)是比硒蛋氨酸(SeMet)和亞硒酸鈉具有更高生物活性的一種小分子有機(jī)含硒化合物,可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等機(jī)制發(fā)揮抑癌作用。近年來,多種現(xiàn)代分析技術(shù)被嘗試用于富硒生物樣品中含硒化合物的鑒定和定量分析,最值得推薦的是液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),具有靈敏度高,專屬性好,分析速度快等特點(diǎn)。Finley等已運(yùn)用ICP-MS技術(shù)證實(shí)富硒青花菜含有SeMC。本研究擬建立測(cè)定富硒青花菜中SeMC的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS-MS),并通過方法學(xué)考察,以獲得高效、準(zhǔn)確、特異性和實(shí)用強(qiáng)性的定量檢測(cè)富硒青花菜中SeMC的分析技術(shù)。2實(shí)驗(yàn)部分2.1美國法上的紡粘設(shè)備1100高效液相色譜系統(tǒng)(美國安捷倫公司);API4000三級(jí)四極串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司);MettlerAE163萬分之一分析天平(美國MettlerToledo);VORTEX-TGENIE渦流混勻器(scientificindustry);Barnstead純水機(jī);acrodisc25mmsyringe0.2μm過濾器(美國Pall公司);電子恒溫浴鍋。甲醇為色譜純(美國Fisher公司);99%七氟丁酸(Lancaster公司)。CH3-Se-CH2-CH(NH2)-COOHSeMC(美國PharmacySe公司)。實(shí)驗(yàn)用水由Barnstead純水系統(tǒng)制備。2.2合成青花菜總硒含量的測(cè)定市購普通青花菜,富硒青花菜采自我國高硒地區(qū),經(jīng)洗凈、陰干、切碎、60℃烘干后,研磨,過0.16mm篩,采用2,3-二氨基萘熒光分光光度法測(cè)定這兩種青花菜總硒含量分別為13和320mg/kg。準(zhǔn)確稱取0.1g樣品于50mL具塞離心管中,加入5mL18.2MΩcm的純水,沸水浴加熱提取1h,期間,每隔20min渦流混勻一次。提取液室溫放置自然冷卻,用0.2μm濾器過濾。2.3氟丁酸溶液10.1%7%v.7WatersSymmetryC18色譜柱(150mm×3.9mmi.d.,5μm),柱溫20℃。流動(dòng)相:甲醇-0.1%七氟丁酸水溶液(30∶70,V/V)。流速:500μL/min;進(jìn)樣量為10μL。ESI離子源,正離子電離方式,電離電壓5500V;霧化氣:高純氮?dú)?碰撞活化(CAD)參數(shù)為6;氣簾氣(CUR)20psig;霧化氣(GS1)35psig,輔助氣(GS2)40psig;離子源溫度(TEM):450℃;掃描方式:多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)(MRM)。3結(jié)果與討論3.1流動(dòng)相的影響比較水、甲醇、丙酮和二氯甲烷等溶劑對(duì)青花菜中SeMC的提取效率。由于純水提取效率較高,實(shí)驗(yàn)選擇純水作為提取溶劑。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),沸水浴加熱提取優(yōu)于常溫超聲方法?？疾觳煌壤募状妓芤?70%、50%、30%和20%)作流動(dòng)相的情況,比較發(fā)現(xiàn),在30%甲醇條件下,SeMC在樣品中與雜蜂分離較好,但峰形存在拖尾現(xiàn)象。流動(dòng)相中添加了少量七氟丁酸,峰形有較好改善。綜合考慮分離效果、分離時(shí)間,選擇甲醇-0.1%七氟丁酸水溶液(30∶70,V/V)為流動(dòng)相。3.2質(zhì)譜分析結(jié)果首先經(jīng)Q1全掃描選擇母離子,然后進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描,得到化合物的二級(jí)質(zhì)譜圖(圖1)。根據(jù)質(zhì)譜圖分析結(jié)果,選定進(jìn)行MRM掃描的離子通道SeMCm/z184.0→(167.0;94.9)。在選定的儀器條件下,標(biāo)準(zhǔn)溶液液相色譜圖見圖2a。從圖2a可以看出,SeMC的保留時(shí)間為3.86min,色譜行為良好。3.3青花菜基質(zhì)對(duì)富硒離子檢測(cè)的影響普通青花菜在保留時(shí)間位置并沒有檢測(cè)到SeMCm/z184.0→(167.0;94.9)的離子對(duì)色譜峰,表明普通青花菜基質(zhì)不會(huì)干擾采用LC-MS-MS技術(shù)檢測(cè)富硒樣品中SeMC的含量(見圖2b)。富硒青花菜樣品中SeMC保留時(shí)間和標(biāo)準(zhǔn)品一致,加標(biāo)后,保留時(shí)間不變,信號(hào)增高,見圖2c和2d。3.4標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限在普通青花菜中添加不同量的標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照2.3和2.4所述樣品前處理方法及儀器條件進(jìn)行測(cè)定,以樣品的濃度(x,μg/L)為橫坐標(biāo),峰面積(y)為縱坐標(biāo)(外標(biāo)法),根據(jù)離子對(duì)響應(yīng)強(qiáng)度,選擇SeMCm/z184.0/94.9作為定量分析的離子對(duì),獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程(n=6)為:SeMC(184.0/94.9):y=1940x+395(r=0.9993)。結(jié)果表明,SeMC在0～200μg/L的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。采用信噪比S/N=3來計(jì)算,得到本方法的最低檢出限為SeMC0.1mg/kg。采用信噪比S/N=10來計(jì)算,得到本方法的最低定量濃度為SeMC0.5mg/kg。3.5富硒青花菜樣品的質(zhì)譜行為取普通青花菜樣品0.1g,按照前面所述方法配制3個(gè)濃度的樣品,每一濃度進(jìn)行6樣本分析,連續(xù)測(cè)定6d,并與標(biāo)準(zhǔn)曲線同時(shí)進(jìn)行。求算回收率和精密度,結(jié)果見表1。我國高硒地區(qū)采集的青菜花,經(jīng)處理后用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行分析測(cè)定,計(jì)算SeMC的含量為7.91mg/kg。研究結(jié)果表明:LC-MS-MS通過陽離子對(duì)的選擇,能有效排除含有大量雜質(zhì)的植物提取液基質(zhì)的干擾,在有效分離含硒化合物的同時(shí),能在線完成富硒青花菜樣品中SeMC中的選擇性檢測(cè)。此外,Finley等發(fā)現(xiàn)SeMC為青花菜的主要含硒化合物