川大黃粉水解大黃酸的研究

川大黃粉水解大黃酸的研究

中藥大黃的化學(xué)成分非常復(fù)雜。具有抗菌和抗癌活性的成分是th衍生物，主要包括大黃酸、大黃素、蘆葦大黃素、大黃酚和大石基。有關(guān)大黃蒽醌衍生物的提取分離,目前使用最多的方法是硫酸水解、三氯甲烷提取及pH梯度分離的系統(tǒng)分離法。在實際工作中筆者發(fā)現(xiàn)該法提取大黃素很有效,但大黃酸提取率很低,且純度不高(?；烊?0%～50%的大黃素),不適合大黃酸的提取。主要原因可能為:(1)從大黃酸分子結(jié)構(gòu)來看,由于它在7(3)位是羧基(-COOH),極性比大黃素、蘆薈大黃素、大黃酚和大黃素甲醚都強,決定了其在有機溶劑中溶解度最小,用三氯甲烷提取時大黃酸溶出少,其它幾個組分的溶出多,要使大黃酸有較高的收率,提取液的體積就會很大;(2)2.5%KHCO3溶液的pH值偏高,提取大黃酸時,大黃素也被提出來了。如果這兩個問題能很好的解決,不僅可以大大提高大黃酸的收率和純度,依次還可使大黃素的純度提高,因為大黃酸被提走就沒有東西進入大黃素組分了。近年文獻報道大黃酸、大黃素不但有很強的抗菌、抗炎、抗癌作用,還具解毒、抗衰老、誘殺柯薩奇病毒B3、免疫雙向調(diào)節(jié)、降脂減肥、抗動脈硬化等功能,被認為是具有多靶點多功能的藥物。在目前眾多的有關(guān)文獻報道中,還沒有專門討論大黃酸提取方法的,研究大黃酸的提取工藝對開發(fā)天然藥物有重要實際意義。1大黃酸的提取大黃樣品供試大黃為重慶中藥材市場購買的川大黃。樣品大黃經(jīng)撿選去雜,于70℃烘干,然后用中藥專用粉碎機粉成40目的粉,密閉保存?zhèn)溆?。儀器和試劑本研究涉及儀器主要為液相色譜儀。大黃酸標品自制,HPLC分析含量大于98%,其余試劑均為分析純。提取大黃酸的溶劑選擇試驗用三氯甲烷、乙醇、異丙醇、丙三醇、三氯甲烷+丙三醇分別提取水解后的大黃粉末,用液相色譜儀測定大黃酸的峰面積,峰面積大說明提取效果好。流動相:甲醇∶0.1%磷酸水溶液為70∶30,依利特C18柱(4×260mm),檢測波長220nm。樣品色譜圖如下:水解溫度和時間對大黃酸提取的影響稱大黃粉5g,加50ml20%硫酸分別于29℃(室溫)50℃、60℃、70℃、80℃、90℃水解4h,過濾、洗渣到中性后于70°烘干,再用100ml三氯甲烷分4次振蕩提取,最后定容到100ml。取此液2ml定容到25ml,用液相色譜儀測大黃酸的峰面積。同法在70℃分別做1、2、2.5、3、3.5、4、5h的水解試驗。大黃酸的分離用2.5%、0.5%、0.2%、0.1%KHCO3溶液萃取大黃酸,鹽酸沉淀,水洗、烘干、稱重得粗大黃酸。取一定量的粗大黃酸甲醇溶解,用液譜儀測定大黃酸峰面積,觀察色譜峰的個數(shù),計算相對峰面積百分率來代表其純度。2提取溶劑和萃取條件的篩選水解溫度和時間對大黃酸的影響大黃中的大黃酸以游離和結(jié)合態(tài)存在,結(jié)合態(tài)(主要為單糖和二糖甙)不能用溶劑直接提取,需水解成游離態(tài)才能提取出來。從圖2可見:水解后大黃酸的量明顯增加;隨著水解溫度的增加,大黃酸也增加,當溫度為70℃時達到最高,溫度再增加大黃酸保持不變,說明在70℃水解過程已經(jīng)完成。用20%硫酸在70℃水解大黃粉時,水解時間在3h大黃酸的量達高峰值(見圖3)。綜上所述,大黃中的大黃酸用20%的硫酸在70℃時3h可完成水解。水解完成后大黃酸比沒水解(29℃)增加了91.55%(以峰面積計算).說明試驗用川大黃中有近一半的大黃酸是結(jié)合態(tài),需水解才能提出來。提取溶劑的影響大黃酸7(3)位為羧基,分子極性大,在氯仿中的溶解度很小,在甲醇等醇類中溶解度相對較大。用目前常用的溶劑三氯甲烷、乙醇、異丙醇和丙三醇在同等條件下作溶出試驗,結(jié)果大黃酸的峰面積比分別為1、2.2、1.3、4.3;可以看出同等條件下丙三醇和乙醇溶出的大黃酸比三氯甲烷和苯高一倍和三倍,見圖4和圖5。丙三醇在增加大黃酸溶出的同時,也引入了更多的非蒽醌雜質(zhì)(圖5峰I)分離純化時不易除去;況且強親水的丙三醇和梯度洗脫的緩沖液互溶,不能用PH梯度洗脫法把大黃酸分離出來。經(jīng)篩選試驗發(fā)現(xiàn)丙三醇加入三氯甲烷中可以增加大黃酸的溶出,而不增加雜質(zhì)的溶出。從圖6可以看出,加入丙三醇后雜質(zhì)溶出量大大減少,但大黃酸的量卻有增加。丙三醇是中藥提取常用的助溶劑和溶劑,符合安全衛(wèi)生要求,在后面的pH梯度分離提取大黃酸時,不會引起溶液pH的變化,又很容易和大黃酸分離。由此可見,丙三醇加入三氯甲烷中不僅能提高大黃酸的溶出量減少雜質(zhì)溶出,滿足pH梯度分離對溶劑的要求,還符合安全衛(wèi)生標準,是最佳的選擇。進一步的研究表明丙三醇的加入超過一定量會減少大黃酸的溶出,過大還出現(xiàn)提取液分層的現(xiàn)象。從圖7來看:(1)丙三醇的量增加,大黃酸量也增加,當丙三醇在三氯甲烷中達10%時大黃酸的溶出量最大,和純?nèi)燃淄楸茸罡咴黾?15%(峰面積計算);(2)丙三醇超過10%,大黃酸略有下降。由此可以認為用含丙三醇8～10%的三氯甲烷多次提取效果最好。KHCO3提取大黃酸效果比較提取液先用水洗2～3次,使大部分丙三醇被水洗走;大黃酸不溶于水留在三氯甲烷相里。pH梯度洗脫的第一步是用2.5%KHCO3溶液提取大黃酸,實驗發(fā)現(xiàn)大黃素很易和大黃酸一起出來,使得大黃酸組分里含有約30%～50%的大黃素。隨著KHCO3濃度的降低,提取的大黃酸中大黃素的含量逐漸減少(見表1)。萃取條件:室溫,間歇振蕩,時間30min,與提取液等體積的萃取劑分三次萃取。粗品大黃酸甲醇溶解用HPLC測定峰面積,計算大黃酸、大黃素和雜質(zhì)峰面積百分比代表各自百分含量。3大黃粉溶劑的制備試驗用川大黃中的大黃酸約50%為結(jié)合態(tài),用20%硫酸70℃水解3h可完成水解釋放出該部分大黃酸