協(xié)和博士研究生課程-質(zhì)譜結(jié)構(gòu)解析-第3講

質(zhì)譜在結(jié)構(gòu)解析中的應(yīng)用1質(zhì)譜解析的基本要點(diǎn)首先需要確定分子離子及碎片離子,推斷分子量及分子式在EI-MS譜中，大多數(shù)分子失去一個(gè)電子，產(chǎn)生含有一個(gè)未成對(duì)電子的單電荷分子離子，稱之為奇電子離子，用“[M]+·”表示，因此[M]+·是一個(gè)游離基離子。此外一些芳香族類化合物可失去2－3個(gè)電子生成多電荷的[M]z+分子離子。一般分子在電離時(shí)將優(yōu)先失去雜原子上的非成鍵n電子，其次是π電子，較難失去的是σ電子。由于[M]+·游離基離子比較活潑，容易進(jìn)一步碎裂產(chǎn)生一系列碎片離子，包括同樣含有未成對(duì)電子的奇電子碎片離子，可用“OE+·”表示；丟失游離基產(chǎn)生不含未成對(duì)電子的一些碎片離子，這稱之為偶電子離子，可用“EE+”。一般偶電子離子更穩(wěn)定，則由分子離子或奇電子碎片離子進(jìn)一步裂解產(chǎn)生偶電子碎片離子是有利的反應(yīng)。在FAB-MS及ESI-MS譜中形成的[M+H]+

、[M-H]-、[M+Na]+

等（準(zhǔn)）分子離子也屬于偶電子離子。質(zhì)譜分析的優(yōu)勢(shì)是可直接獲得分子量信息，并通過高分辨質(zhì)譜測(cè)定獲得離子的精確質(zhì)量數(shù)，則分析推斷出分子式。在應(yīng)用EI-MS測(cè)試時(shí)，需要注意有些化合物可能不出現(xiàn)分子離子分子峰。為了得到分子離子峰，可以改變離子源的參數(shù)，降低離子內(nèi)能；根據(jù)化合物的類型或理化性質(zhì)，選用其它一些軟電離方法，如CI、FAB、ESI、APCI等。質(zhì)譜解析的基本要點(diǎn)獲得分子離子峰的方法質(zhì)譜解析的基本要點(diǎn)確定分子離子及其碎片離子的相關(guān)結(jié)構(gòu)信息是質(zhì)譜測(cè)定的首要目的，因此前人也總結(jié)提出了一些很有用的基本規(guī)律：①氮規(guī)則：含有奇數(shù)氮原子的化合物，EI-MS譜的[M]+?離子是奇數(shù)；②同位素峰的豐度比：由于大多數(shù)元素存在同位素，則質(zhì)譜中離子峰通常為峰簇。根據(jù)同位素峰的天然豐度比及其對(duì)同位素峰的貢獻(xiàn)大小，可計(jì)算分子離子的元素組成，尤其是Cl，Br，S，Si等元素的天然豐度表現(xiàn)出特征的峰簇。③計(jì)算不飽和度：根據(jù)分子式計(jì)算出不飽和度（環(huán)加雙鍵值），可獲得分子骨架以及化合物類型的信息。④特征離子：[M-15]+、[M-CO]+?、m/z77（苯基）、m/z91（芐基）、m/z105（苯?；┑忍卣魉槠x子的出現(xiàn)，有助于推斷分子離子峰，還可提供分子部分結(jié)構(gòu)和化合物種類的信息。質(zhì)譜的解析手法確認(rèn)各個(gè)峰的質(zhì)量數(shù)（m/z）

檢驗(yàn)最高質(zhì)量數(shù)，推測(cè)分子離子峰，并確認(rèn)是奇數(shù)還是偶數(shù)

探討同位素峰的豐度比，特別是Cl，Br，S等特殊元素的豐度比

確定分子式、計(jì)算不飽和度（環(huán)＋雙鍵數(shù)）

通過產(chǎn)生的碎片離子的質(zhì)量數(shù)，以及特征離子（如[M-15]+,m/z77(苯基)、m/z91(芐基)及m/z105(苯?；?）等來推測(cè)分子的部分結(jié)構(gòu)和化合物的種類通過總體質(zhì)譜，對(duì)分子及碎片的穩(wěn)定性和反應(yīng)性進(jìn)行分析，并綜合以上結(jié)果，將各部分結(jié)構(gòu)有效地連接起來，最后推測(cè)化合物的結(jié)構(gòu)

核對(duì)或驗(yàn)證！

影響碎片離子豐度的主要因素：

豐度最高的碎片離子峰與形成最穩(wěn)定的裂解反應(yīng)產(chǎn)物（包括離子自身、中性分子或游離基碎片）的反應(yīng)性相對(duì)應(yīng)，也就是通過低生成熱或最合理的裂解途徑產(chǎn)生穩(wěn)定、高豐度的碎片離子。此外，離子的豐度越高，表明生成該離子的裂解反應(yīng)越有利，則與分子的結(jié)構(gòu)及其穩(wěn)定性具有直接的關(guān)系，因此在質(zhì)譜分析中不僅需要確定分子離子峰，掌握碎片離子峰（或m/z）的歸屬，還要充分考慮相關(guān)離子的豐度或相對(duì)強(qiáng)度的大小，這對(duì)于了解化合物（尤其是同分異構(gòu)體）的結(jié)構(gòu)差異很重要。影響碎片離子豐度的因素比較多，可以概括為以下幾個(gè)主要因素。質(zhì)譜解析要點(diǎn)影響碎片離子豐度的主要因素：①碎片離子的穩(wěn)定性（最主要因素）：離子的穩(wěn)定性包括其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、有利于電荷或未成對(duì)電子所處的化學(xué)環(huán)境或位置，如共振結(jié)構(gòu)體系的存在等。②電離能量：所需的電離能（I值）越低、越容易被電離，則形成分子離子、碎片離子的概率越高；但有時(shí)豐度并不一定高（有競爭性，或者繼續(xù)發(fā)生裂解反應(yīng)）。③最大烷基的丟失：在裂解中往往最大的烷基最容易丟失。④中性產(chǎn)物的穩(wěn)定性：中性分子，或者丟失的碎片能為未成對(duì)電子提供有利的位置，則該反應(yīng)途徑的重要性隨之增加。⑤ 空間因素：有時(shí)會(huì)直接影響碎片離子的產(chǎn)生或穩(wěn)定性。如空間位阻或轉(zhuǎn)移距離將影響重排反應(yīng)的難易性。最強(qiáng)的碎片離子峰與形成最穩(wěn)定的產(chǎn)物（包括離子、中性或游離基碎片）的反應(yīng)性相對(duì)應(yīng)。也就是說該（類）離子是通過最合理的裂解途徑產(chǎn)生的。麥?zhǔn)现嘏舏

McLafferty等質(zhì)譜學(xué)家對(duì)以EI-MS為主的離子裂解反應(yīng)及其規(guī)律進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，并總結(jié)歸納出若干個(gè)重要的基本裂解反應(yīng)，不但成功地解釋了早期的大部分類型有機(jī)化合物的質(zhì)譜結(jié)果，也構(gòu)成了有機(jī)質(zhì)譜解析的基礎(chǔ)。這些基本裂解反應(yīng)以及McLafferty提出的用于解釋離子裂解機(jī)理的電子轉(zhuǎn)移規(guī)律，在一定范圍內(nèi)仍然適用于解釋后來發(fā)展起來的快原子轟擊電離（FAB）和電噴霧電離（ESI）等其它離子化方法產(chǎn)生的離子裂解過程以及碰撞誘導(dǎo)裂解（CID）過程。因此，首先有必要掌握這些裂解反應(yīng)類型及基本要點(diǎn)。 當(dāng)然，這里需要指出的是大多數(shù)離子的裂解反應(yīng)以及碎片離子的產(chǎn)生過程其實(shí)要復(fù)雜得多，有時(shí)離子的產(chǎn)生還會(huì)同時(shí)存在幾種不同的裂解途徑；一些復(fù)雜結(jié)構(gòu)的分子中有可能同時(shí)發(fā)生幾種類型的裂解反應(yīng)甚至包括未總結(jié)的其它裂解類型，則它往往是一個(gè)綜合過程。質(zhì)譜裂解反應(yīng)m/z100-C2H4=m/z72m/z100–C3H6=m/z58m/z114–C3H6=m/z72m/z114–C4H8=m/z58m/z128–C3H6=m/z86m/z86–C4H9+·m/z

143裂解反應(yīng)類型

（1）σ鍵斷裂:（典型的單純裂解）

ABCD

AB·＋CD+

AB+

＋CD·

R+·CR3R·＋CR3+鍵的斷裂優(yōu)先發(fā)生在支鏈C原子上，支鏈越多，鍵的裂解越容易，且正電荷留在支鏈多的基團(tuán)上（比較強(qiáng)的碎片離子一定是能較好地穩(wěn)定正電荷的離子結(jié)構(gòu)。分子離子強(qiáng)度及其裂解特征與結(jié)構(gòu)的關(guān)系M+·正十二烷4-甲基十一烷2,2,4,6,6-五甲基庚烷

以上介紹的裂解反應(yīng)主要是圍繞活性反應(yīng)中心，即游離基中心或電荷中心（+?）發(fā)生，這些是重要及需要掌握的質(zhì)譜基本裂解反應(yīng)類型。實(shí)際上質(zhì)譜中的裂解反應(yīng)及其碎片離子的產(chǎn)生過程比較復(fù)雜，它往往同時(shí)伴隨有多種裂解方式及途徑；而且有些反應(yīng)會(huì)在遠(yuǎn)離電荷（+?）位置上發(fā)生，這被稱之為遠(yuǎn)離電荷裂解。 另外，當(dāng)今廣泛采用的離子化方法主要是FAB、ESI及APCI等‘軟’電離技術(shù)，產(chǎn)生[M+H]+和[M+Na]+

等加合離子，并常用MS/MS技術(shù)的CID方式誘導(dǎo)引發(fā)一些特征的裂解反應(yīng)，因此，[M+H]+離子與上述[M]+?離子本身所具有的內(nèi)能就不盡相同，而且由[M+H]+離子及其在CID過程發(fā)生的裂解方式、產(chǎn)生的離子種類等，在很多情況下與上述基本裂解反應(yīng)沒有直接關(guān)系，或發(fā)生不同的獨(dú)特裂解反應(yīng)。因此，為了解釋化合物的裂解反應(yīng)機(jī)理往往需要更多信息，近幾年來在天然產(chǎn)物的質(zhì)譜分析研究中也常常有發(fā)現(xiàn)新穎及獨(dú)特裂解反應(yīng)的報(bào)道。相關(guān)內(nèi)容將結(jié)合MS/MS技術(shù)在天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)分析中的應(yīng)用進(jìn)行敘述。小結(jié)（1）在正離子模式下，查看除了[M+H]+分子離子之外，是否出現(xiàn)以下加合離子：[M+NH4]+（+18Da），[M+Na]+(+

23Da）和[M+K]+（+39Da）等離子峰（2）在負(fù)離子模式下，查看除了[M-H]-分子離子之外，是否出現(xiàn)以下加合離子：[M+Cl]-（+35Da），[M+CHOO]-（+45Da），[M+CH3COO]-（+59Da）等離子峰確定分子離子峰及分子量在FAB-MS或ESI-MS譜等中天然產(chǎn)物的質(zhì)譜解析概述現(xiàn)代有機(jī)質(zhì)譜技術(shù)飛速發(fā)展，具有多種不同電離方式和串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）

等手段本課題組運(yùn)用MS/MS技術(shù)系統(tǒng)開展了多種不同類型天然產(chǎn)物的離子化、質(zhì)譜行為及其與結(jié)構(gòu)特征之間的相關(guān)性等研究。發(fā)現(xiàn)并解釋了一系列新穎或獨(dú)特的裂解反應(yīng)，并總結(jié)出反映結(jié)構(gòu)細(xì)微差異或特點(diǎn)的質(zhì)譜變化規(guī)律；同時(shí)結(jié)合LC-MS/MS等聯(lián)用技術(shù)，開展藥用植物微量（活性）成分的快速分子鑒別。研究思路驗(yàn)證分析

單體化合物的(±)離子化探討；

(±)ESI-MS及ESI-MSn譜；另選用(±)FAB-MS,或EI/CI-MS等

混合物的(±)

ESI-MS及ESI-MSn譜；

(±)FAB-MS譜（Na+離子的作用）

混合物的GC-MS,或LC-UV,LC-MS

及LC-MSn譜混合物的HRMS測(cè)定

組分的NMR或LC-NMR譜分析天然產(chǎn)物的“互補(bǔ)性”質(zhì)譜分析方法三種不同混合基質(zhì)測(cè)得紫杉醇的FAB-MS譜

基質(zhì)對(duì)FAB-MS分析的影響紫杉醇的ESI-MS譜

m/z569離子的子離子掃描譜紫杉醇的(+)FAB-MS/MS譜[M+H]+

離子的MS/MS譜；m/z286的子離子掃描譜;m/z105的母離子掃描譜紫杉醇在正離子模式下的MS/MS譜裂解示意圖Yunnanxamine（云南杉胺）[M+H]+離子的FAB-MS/MS譜856云南杉胺在正離子模式下的MS/MS譜主要裂解示意圖黃連中已知四氫異喹啉生物堿的結(jié)構(gòu)以季銨鹽的形式（）存在+M特點(diǎn)：母核結(jié)構(gòu)為共軛體系，其整體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；因此在質(zhì)譜上顯示

明顯特色的譜圖。黃連堿的ESI-MS/MS譜-(2CH2O+2CO)小檗堿的ESI-MS/MS譜藥根堿的ESI-MS/MS譜棕櫚堿的ESI-MS/MS譜33棕櫚堿的特征裂解m/z278-CH4m/z250-CO

三分丹提取物的成分分析

1. 菲并吲哚里西丁類生物堿的質(zhì)譜裂解規(guī)律研究

2. 三分丹植物中兩種活性提取部位的微量成分質(zhì) 譜分析方法研究(1)YunXiang,A.Zeper,etal.RapidCommun.Massspectrum.2002，16(17):1668-1674(2)CuiLJ,A.Zeper,etal.RapidCommun.MassSpectrom.2004,18:184-19035三分丹中菲并吲哚里西丁類生物堿的結(jié)構(gòu)compoundR1R2R3R4R5M.W.(Da)phe-1OCH3OCH3OCH3OH(α)H(β)379phe-2OCH3OCH3OCH3OH(β)H(β)379phe-3OCH3OCH3OCH3OH(α)H(α)379phe-4OCH3OHOCH3OH(α)H(β)365phe-5OCH3OHOCH3OH(α)H(α)365phe-6OHOCH3OCH3OH(β)H(β)365phe-7OCH3OHOCH3HH(α)349phe-8OCH3OCH3OCH3HH363Compoundphe-9(M+360)Compoundphe-10(M.W.381)36化合物B4,B5B1,B2,B3化合物B6,B7B8菲并吲哚里西丁類生物堿的結(jié)構(gòu)類型結(jié)構(gòu)類型結(jié)構(gòu)類型FAB-MS譜ESI-MS譜Phe-1phe-1中[M+H]+離子的FAB-MS/MS譜(C4H7N+H)phe-4中[M+H]+離子的FAB-MS/MS譜Phe-1的ESI-MS/MS譜

(a)[M+H]+的MS/MS譜(b)[M+H-H2O]+的MS/MS譜菲吲哚里西丁類生物堿的特征裂解反應(yīng)(1)[M+H-H2O]+phe-7中[M+H]+離子的FAB-MS/MS譜-69×菲吲哚里西丁類生物堿的特征裂解反應(yīng)(2)-H2Ophe-9中M+離子的FAB-MS/MS譜phe-13中[M+H]+離子的ESI-MS/MS譜-86（phe-8的氮氧化物）phe-10中[M+H]+離子的FAB-MS/MS譜-87菲吲哚里西丁類生物堿的特征裂解反應(yīng)(3)+菲吲哚里西丁生物堿ESI-MSn質(zhì)譜裂解行為

丟失CH4的特征裂解反應(yīng)(AutoSpecUltima-Tof)-CH4ESI-MS/MSspectrumofB1ESI-MSn譜分析(LCQ)(1)MS2(2)MS3

MS2spectrumofM+atm/z360forB1MS3spectrumof[M-CH3]+?atm/z345MS2spectrumofM+atm/z360forB1MS3spectrumof[M-CH3]+?atm/z345forB1ESI-MSn譜分析(QTRAP)MS2MS3碰撞信息增多中性丟失掃描譜分析(QTRAP)NLS16

forB1M+PRESofm/z344forB1PRESofm/z345forB1母離子掃描譜分析(QTRAP)M+M+55

B1中丟失CH4的裂解反應(yīng)機(jī)理1.XiangY,AblizZ,LiLJ,etal.RapidCommun.MassSpectrom.2002,16:1668-16742.CuiLJ,AblizZ,XiaM,etal.RapidCommun.MassSpectrom.2004,18:184-19056不同結(jié)構(gòu)類型的菲并吲哚里西丁類生物堿在(+)ESI-MS/MS譜中的特征裂解反應(yīng)（標(biāo)有★的反應(yīng)為主要途徑）57D環(huán)飽和的菲吲哚里西丁類生物堿紫外吸收特征:260nm、285nm、315nm(sh)有紫外吸收。季胺鹽類菲吲哚里西丁類生物堿紫外吸收特征：268nm、292nm有紫外吸收。N氧化的菲吲哚里西丁類生物堿紫外吸收特征：260nm、285nm，其中285nm處紫外吸收有所增強(qiáng)。蘿摩科三分丹混合物中菲吲哚里西丁類生物堿的成分分析三分丹混合物的液相色譜及紫外吸收光譜1234567峰2的紫外吸收光譜峰7的紫外吸收光譜三分丹混合物的LC-MS總離子流及質(zhì)量色譜圖(m/z360)(m/z390)三分丹混合物的ESI-MS譜及MS/MS譜12345HPLCchromatogramofthecrudeextractfromTylophora.atrofollivulatabyLC-MS(QTRAP)

混合物分析TICofNL69混合物分析35NL69forconstituents3混合物分析NL69forconstituents5成分1結(jié)構(gòu)的分析推導(dǎo)((±)ESI-MS)C21H21NO5M.W.367三分丹活性提取物T15中組分的結(jié)構(gòu)驗(yàn)證

Constituentno.ObservedmassCalculatedmassError(ppm)Formula1368.1489368.14982.5C21H22NO52and3382.1658382.1654-1.0C22H24NO54and5346.1451346.1443-2.2C22H20NO36332.1255332.12879.5C21H18NO37360.1598360.16000.4C23H22NO38352.1580352.1549-8.9C21H22NO49and10390.1710390.1705-1.2C24H24NO4FAB-HRMS數(shù)據(jù)三分丹活性提取物中成分結(jié)構(gòu)（一）（結(jié)合HR-MS、NMR等驗(yàn)證了部分成分的結(jié)構(gòu)）Cl-Cl-Cl-三分丹活性提取物中成分結(jié)構(gòu)（二）Cl-Cl-Cl-Cl-

由于天冬植物中呋喃甾烷型甾體皂苷C-22位的取代基（OH或CH3O基）十分活潑，容易發(fā)生中性丟失反應(yīng)；同時(shí)發(fā)生互變反應(yīng)。這些結(jié)果為分析確定該類成分的分子量帶來了困難，特別是利用LC-MS方法分析含有這類甾體皂苷的混合物時(shí)，具有一定難度。為了解決上述問題，首先探討適合混合物成分分析的FAB-MS方法；同時(shí)考慮到運(yùn)用LC-MS方法分析混合物成分，考察了采用(±)ESI-MS分析方法。通過上述研究，總結(jié)出開展這類甾體皂苷成分分析的有效途徑。

天冬植物中甾體皂苷類的質(zhì)譜解析(1)F.Liang,A.Zeper*,etal.RapidCommun.Massspectrum.2002,16:1168-1173(2)YZLiu,A.Zeper*,etal.RapidCommun.MassSpectrom.2004,18:235-238化合物TD-1和TD-1-OH的ESI-MS譜conevoltage=20V[M+H-CH3OH]+[M+H-H2O]+基質(zhì)G/m-NBATD-1-OHTD-1TDTDH-1[M+H-H2O]+[M+H-CH3OH]+[M+H]+[M+H]+FAB-MS基質(zhì)Gly+Na+(a)(b)(c)TD-1-OHTD-1TD-1Gly+NaClCH3CNGly+NaClCH3OHGly+NaClCH3CNFAB-MS[M+Na]+[M+2Na-H]+TD-1在不同溶劑中的FAB-MS譜：(1)CH3OHTD-1在不同溶劑中的FAB-MS譜：(2)普通CH3CN0時(shí)刻[M+Na]+[(M-CH3+H)+Na]+(TD-1-OH)TD-1在不同溶劑中的FAB-MS譜(3)無水CH3CN(4)無溶劑[M+Na]+[(M-CH3OH)+Na]+[(M-CH3OH)+H]+[M+Na]+[M+2Na-H]+TD-1-OH在不同溶劑中的FAB-MS譜：(1)H2OTD-1-OH在不同溶劑中的FAB-MS譜：(2)CH3OH[M+Na]+[M+2Na-H]+0時(shí)刻TD-1-OH在不同溶劑中的FAB-MS譜：(3)CH3OH4小時(shí)[M+Na]+[M+2Na-H]+[(M-H+CH3)+Na]+TD-1-OH中添加Li+，Na+和K+（1:1:1）的FAB-MS譜

[M+Li-H2O]+[M+Li]+[M+2Li-H]+[M+Na]+[M+K]+小結(jié)LiClNaClKClLi+對(duì)C-22位取代基的保護(hù)不夠，易產(chǎn)生[M+Li-H2O]+Na+對(duì)C-22位取代基的保護(hù)適中K+對(duì)C-22位取代基的親和力弱堿金屬離子對(duì)活潑基團(tuán)的保護(hù)作用下降

堿金屬量較少無法獲得比較強(qiáng)的分子離子峰進(jìn)行成分分析

堿金屬量過多呋喃甾體皂苷類的互變反應(yīng)及總結(jié)問題研究結(jié)論建議LC-MS分析：⑴用H2O溶解⑵采用H2O-CH3CN為流動(dòng)相進(jìn)行分析C-22位OCH3和OH取代的單體同時(shí)存在，流動(dòng)相的選擇？考察不同溶劑體系、不同時(shí)間中的互變反應(yīng)性C-22位OCH3更容易，且快速轉(zhuǎn)化為OHMS/MSSpectrumofm/z887byAutoSpec-TOFm/z725離子的MS/MS譜Theeliminationreactionforlossof144Da______________1.FengLiang,Li-junLi,ZeperAbliz,etal.RapidCommun.MassSpectrom.2002,16:1168-1173

144massunitsMS/MSSpectrumofm/z887byLCQ1.Y-ZLiu,FengLiang,ZeperAblizetal.RapidCommun.MassSpectrom.2004,18:235-238[Y0+H]+MS/MSSpectraofm/z887byQTRAPMode:PROS(MS2)Mode:EnhancedPROS(EPI)Fragmentationpathwaysof[M+H]+ion(m/z887)-144m/z273-H2Om/z255m/z435-144CLZG-I的[M+H]+離子的裂解途徑[(+)ESI-MSn]CLZG-I的[M+Na]+離子的裂解途徑[M-H-Rha]-707CLZG-I的[M-H]-離子的(-)ESI-MS2譜[M-H]-CLZG-I的[M-H-Ara-Rha]-離子的(-)ESI-MS4譜[M-H-Ara-Rha]-